李亭亭，劉秋月，李向臣*，王海濤*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，杭州 311300；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101)

綿羊()起源于現(xiàn)亞洲中西部的新月沃地區(qū)，是世界上最早被人類馴化的家養(yǎng)動(dòng)物之一。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of United Nations，F(xiàn)AO)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國是世界上最大的羊肉生產(chǎn)國，其產(chǎn)量幾乎占世界總產(chǎn)量的三分之一。隨著人們對羊肉需求的增加，針對地方綿羊品種繁殖、生長以及抗病性狀等方面的選育越來越受到重視，育種方式也越來越多樣化。

綿羊在上萬年的進(jìn)化過程中經(jīng)歷了長期的人工和自然選擇。在不同地區(qū)和環(huán)境中的綿羊群體為了適應(yīng)自然環(huán)境或人類喜好，會(huì)對自身體型、毛色、繁殖、耐受等生理表型進(jìn)行調(diào)整，還會(huì)在基因組上留下不同印記，通過對綿羊品種中不同印記進(jìn)行檢測，就能夠?qū)?dòng)物的環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制有更好的理解，同時(shí)如果能夠找到影響這些表型的遺傳變異，就能極大提升育種的效率。在綿羊上，目前研究者主要針對繁殖、生長、脂尾、抗病及抗逆等幾個(gè)與經(jīng)濟(jì)效益關(guān)聯(lián)緊密的性狀，通過家系遺傳定位、比較基因組學(xué)、候選基因關(guān)聯(lián)分析以及全基因組關(guān)聯(lián)分析等手段，先后鑒定獲得綿羊中多個(gè)包括增加排卵數(shù)、提高生長速度、增加產(chǎn)肉量以及增強(qiáng)抗病能力的主效基因以及致因位點(diǎn)，如圖1所示。其中部分基因已經(jīng)大范圍運(yùn)用于綿羊育種實(shí)踐，大部分正處于動(dòng)物個(gè)體水平驗(yàn)證的階段。

圖1 綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀及其相關(guān)基因Fig.1 Important economic traits and related genes of sheep

隨著遺傳修飾技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，一套新的育種策略和方法已經(jīng)逐漸形成。研究者可以通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯等方式直接對獲得的候選基因進(jìn)行體內(nèi)功能驗(yàn)證，極大的縮短了大動(dòng)物中候選主效基因的驗(yàn)證周期。針對定位獲得的候選基因，最普遍的做法就是通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將基因進(jìn)行直接敲除，觀察動(dòng)物表型以確認(rèn)基因功能；通過CRISPR/Cas9結(jié)合同源重組或供體DNA，可以在不完全破壞功能基因的前提下針對特定基因型進(jìn)行定點(diǎn)編輯；更進(jìn)一步，隨著單堿基編輯系統(tǒng)的開發(fā)，目前研究者在無需依賴基因組產(chǎn)生雙鏈斷裂的情況下，可以進(jìn)行高效定點(diǎn)的基因編輯，或者利用先導(dǎo)編輯(prime editor，PE)技術(shù)對基因進(jìn)行插入、缺失等突變體的編輯以確認(rèn)致因突變的價(jià)值。本文將目前已研究的相對清楚并影響綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)基因和應(yīng)用情況進(jìn)行了總結(jié)，為以后的綿羊分子育種工作提供參考。

1 綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀及相關(guān)基因

1.1 繁殖性狀

綿羊的繁殖性狀是影響?zhàn)B羊業(yè)最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，可體現(xiàn)在產(chǎn)羔和季節(jié)性發(fā)情兩個(gè)方面。目前在綿羊上鑒定出的重要多羔主效基因的多個(gè)突變主要集中在變異生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路的相關(guān)基因上，主要有、15、9，另外還包括近年來鑒定出的基因，它是唯一一個(gè)不屬于TGF-β信號通路的調(diào)控綿羊排卵數(shù)的基因。而對于影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的研究，鑒定出的基因主要有、1A，可通過綿羊?qū)庹盏姆磻?yīng)來調(diào)控體內(nèi)相關(guān)生殖激素的合成，從而影響發(fā)情。

1.1.1 產(chǎn)羔數(shù)性狀 產(chǎn)羔數(shù)性狀是養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟(jì)性狀中最重要的生產(chǎn)性狀，受母羊排卵數(shù)、子宮容量等因素影響，其中排卵數(shù)可直接決定母羊的產(chǎn)羔數(shù)和繁殖力。母綿羊產(chǎn)羔數(shù)與排卵數(shù)的相關(guān)性達(dá)到0.96，但產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳力較低，約為0.11，而排卵數(shù)性狀遺傳力相對較高，自然群體中約為0.19左右，而在選擇群體中可高達(dá)0.30。雌性綿羊在出生前，卵巢上便形成了大量原始卵泡。初情期前，卵泡雖能發(fā)育，但不能成熟排卵，當(dāng)發(fā)育到一定程度時(shí)，便閉鎖退化。初情期后，在每個(gè)發(fā)情周期中可發(fā)育的卵泡多達(dá)幾十個(gè)，但單羔品種最終能發(fā)育到成熟排卵的卵泡一般只有1～2個(gè)，其余卵泡中途閉鎖而死亡，而多羔品種則有多個(gè)卵泡能發(fā)育成熟并排卵。

目前發(fā)現(xiàn)的多羔主效基因大部分都屬于TGF-β信號通路成員?；?fecundity booroola)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的主效基因，1994年，Montgomery等利用微衛(wèi)星標(biāo)記和遺傳連鎖的方法將與Booroola Merino綿羊多產(chǎn)相關(guān)的基因定位到綿羊6號染色體上，之后發(fā)現(xiàn)該基因?qū)嶋H為綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B型基因(bone morphogenetic protein receptor type 1B，1B)編碼區(qū)發(fā)生了A746G突變，造成其編碼的氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?Q249R)，該位點(diǎn)的突變減弱了BMPR1B在BMP信號通路中的配體功能，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的加速成熟并排卵，使母羊排卵數(shù)增加。經(jīng)過大量研究證實(shí)，突變在Booroola Merino綿羊、Javanese Indonesia、小尾寒羊、湖羊、Garole綿羊和Kalehkoohi等多產(chǎn)綿羊品種中均有發(fā)現(xiàn)。TGF-β家族中分別位于綿羊X和5號染色體上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，15)和生長分化因子9(growth differentiation factor 9，9)基因，是由歐洲科學(xué)家利用自然突變的高產(chǎn)羔數(shù)綿羊群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，利用微衛(wèi)星掃描或者全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)定位獲得的影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，二者有高度的氨基酸序列同源性，通常共同形成異源二聚體作用于BMPRⅡ型受體，并激活Smad2/3(sma- and mad-related，Smad)和Smad 1/5/8信號通路，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖及分化、卵泡發(fā)育以及增加排卵數(shù)。迄今為止，在不同綿羊品種中已識別出15基因的10個(gè)與排卵率、繁殖力相關(guān)的點(diǎn)突變，分別具有不同的功能，即、(終止密碼子提前使蛋白合成受損)，、(通過改變閱讀框)，(導(dǎo)致15蛋白功能喪失)，和(與9蛋白相互作用受損)，和(細(xì)胞信號活性改變)以及(未知)。與其他突變不同的是，、和的純合突變不僅不會(huì)導(dǎo)致母羊不育，反而使其具有更高的繁殖能力。在9中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)突變，分別是G1～G8，以及、、，這些突變均可對排卵和產(chǎn)羔造成影響。目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用到大動(dòng)物模型上，研究者們利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了具有g(shù).A746G點(diǎn)突變的綿羊，但有關(guān)這些突變羔羊繁殖能力的研究還未見報(bào)道。吳艷芳不僅獲得了突變的灘羊，而且還證明具有突變的灘羊比野生型灘羊具有更高的產(chǎn)羔數(shù)，這些研究為獲得突變的綿羊從而提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)提供了一個(gè)新的方向。而對于15和9，可能是由于其效應(yīng)位點(diǎn)較多難以選擇或一些綿羊群體中存在自然突變，很少有關(guān)于其在綿羊上的報(bào)道，但是有研究人員在豬上引入15無義突變后，觀察到純合突變導(dǎo)致母豬不育，而雜合突變則可增加母豬排卵數(shù)，這一發(fā)現(xiàn)與存在自然突變的綿羊群體中觀察到的現(xiàn)象一致。

上述3個(gè)與多羔相關(guān)的主效基因中，多個(gè)突變位點(diǎn)的效應(yīng)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)多個(gè)綿羊品種中得到證實(shí)。近年來研究者還利用其它綿羊群體陸續(xù)在這3個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了新的突變，可為綿羊產(chǎn)羔性狀研究提供新的參考。另外，研究者還通過轉(zhuǎn)錄組及代謝組等分析手段，發(fā)現(xiàn)在這3個(gè)基因發(fā)生突變的個(gè)體中，與胰島素分泌、cAMP、MAPK、Smads、Hippo等相關(guān)的信號通路被顯著富集，且突變個(gè)體卵泡液中的葡萄糖6-磷酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等重要代謝物與排卵率的增加顯著相關(guān)，這些研究結(jié)果將有助于深入闡明綿羊多羔性狀的發(fā)生機(jī)制。

除TGF-β信號通路之外的產(chǎn)羔數(shù)主效基因也已有報(bào)道?；蚴欠▏r(nóng)科院Bodin等從1975到1996年間通過5個(gè)世代的選育構(gòu)建Lacaune綿羊的回交家系，又經(jīng)過基因組掃描、高通量測序以及分子生物學(xué)驗(yàn)證，于2013年定位到了4GALNT2(glycosylation enzyme beta-1,4-N-acetyl galactosaminyltransferase 2)為的主效基因，可能的機(jī)制是突變導(dǎo)致了4GALNT2基因在卵泡中的異位表達(dá)，此蛋白在顆粒細(xì)胞中的高表達(dá)會(huì)使卵泡中特定靶蛋白的糖基化狀態(tài)改變，進(jìn)而引起了排卵數(shù)的改變。這一發(fā)現(xiàn)揭開了除TGF-β信號通路之外調(diào)控綿羊排卵數(shù)的全新機(jī)制。除了基因外，最新的研究也鑒定到一些新的與綿羊產(chǎn)羔相關(guān)的重要基因，并發(fā)現(xiàn)了這些基因上存在的影響產(chǎn)羔數(shù)的多個(gè)突變位點(diǎn)，例如、、、等基因，這些功能基因突變之后，會(huì)對繁殖相關(guān)的生物學(xué)過程產(chǎn)生影響，如可通過影響排卵過程而導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)的變化，及其受體可參與卵泡的成熟和發(fā)育，影響胚胎附著和排卵過程，可能通過參與卵母細(xì)胞的發(fā)育而影響產(chǎn)羔數(shù)，則可影響綿羊卵巢和卵泡發(fā)育。另外，研究者還利用產(chǎn)羔數(shù)顯著差異的綿羊個(gè)體進(jìn)行比較生物學(xué)研究，從轉(zhuǎn)錄組和蛋白層面鑒定到了多個(gè)相關(guān)基因及信號通路，如4、1、2B、1等可分別參與晝夜節(jié)律、代謝和胰島素分泌合成等相關(guān)激素調(diào)節(jié)過程；、和1能影響GnRH活性和生殖激素的釋放；4可調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟；3與能協(xié)同促進(jìn)卵泡成熟和排卵；5可與卵泡發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，參與卵泡生成，這些結(jié)果使研究者對影響綿羊繁殖性狀的機(jī)制多了新的認(rèn)識。

1.1.2 發(fā)情性狀 季節(jié)性發(fā)情是限制綿羊繁殖能力的瓶頸因素之一，經(jīng)過研究者們幾十年的探索，現(xiàn)在基本確定了哺乳動(dòng)物中光照通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)系統(tǒng)引起季節(jié)性發(fā)情，其機(jī)制為：眼球視網(wǎng)膜接受光照刺激產(chǎn)生視神經(jīng)沖動(dòng)，并由下視丘傳至下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，SCN作為動(dòng)物體內(nèi)最主要的生物鐘，將信號傳至松果體，引起松果體中褪黑素(melatonin，MEL)分泌的改變，之后褪黑素通過HPGA軸進(jìn)一步引起下丘腦中促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)以及相關(guān)生殖激素的合成、釋放，最終調(diào)控動(dòng)物的季節(jié)性發(fā)情活動(dòng)。近年來，促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，)基因和褪黑素受體1A(melatonin receptor 1A，1A)基因被認(rèn)為是影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的重要調(diào)控基因，可作為改良綿羊季節(jié)性發(fā)情的重要分子標(biāo)記。

最初在狗的甲狀腺中被發(fā)現(xiàn)，之后通過對生活在不同環(huán)境下的野生和家養(yǎng)品種進(jìn)行選擇分析，發(fā)現(xiàn)在雞和綿羊的馴化過程中均受到強(qiáng)烈選擇，并且可通過HPGA軸通路反饋調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖活動(dòng)。目前認(rèn)為的調(diào)控方式是下丘腦中的促甲狀腺激素β亞基(thyrotrophin β subunit，)可與結(jié)合，通過cAMP通路調(diào)控四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T)與三碘甲狀腺原氨酸(triodothyronine，T)的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物對光照周期的應(yīng)答與季節(jié)性發(fā)情。研究發(fā)現(xiàn),在Soay綿羊中光照長短能通過調(diào)節(jié)的表達(dá)從而影響綿羊的季節(jié)性繁殖活動(dòng)。通過對國內(nèi)多個(gè)地方綿羊品種的重測序以及分群驗(yàn)證，證實(shí)該基因的多態(tài)性與中國本土綿羊的季節(jié)性發(fā)情行為和繁殖活動(dòng)顯著相關(guān)。1A基因于1996年首先在西伯利亞倉鼠中被發(fā)現(xiàn)，參與介導(dǎo)褪黑素對哺乳動(dòng)物生殖活動(dòng)的影響，隨后在Merinos d’Arles、Aragonesa、Sarda、小尾寒羊等綿羊品種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)1A基因與綿羊卵巢的排卵活動(dòng)和產(chǎn)羔頻率相關(guān)。目前，研究者發(fā)現(xiàn)綿羊1基因的不同突變不僅與綿羊的季節(jié)性發(fā)情和產(chǎn)羔有關(guān)，同時(shí)某些突變還對雄性綿羊的繁殖活動(dòng)(如外陰嗅探、爬跨等)產(chǎn)生促進(jìn)作用，被公認(rèn)是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物繁殖活動(dòng)的重要基因。

1.2 生長性狀

畜禽生長性能包括生長速度、活體背膘厚及飼料轉(zhuǎn)化率等，而其中生長速度可體現(xiàn)在肌細(xì)胞的增殖發(fā)育以及骨骼的生長速度兩個(gè)方面。一方面，肌肉的形成和再生需通過一個(gè)高度精密的調(diào)控過程，使成肌細(xì)胞分化和融合成多核合胞體。在胚胎發(fā)育過程中，中胚層前體細(xì)胞受到周圍組織信號的控制分化為肌源細(xì)胞，其中需要包括Pax7、MyoD和Myf5等因子的上調(diào)，增殖的前體細(xì)胞/成肌細(xì)胞停止細(xì)胞周期并誘導(dǎo)肌肉特異性基因表達(dá)，之后通過一系列高度有序的程序先發(fā)生肌細(xì)胞之間的融合形成新生的肌管，隨后募集和融合額外的成肌細(xì)胞產(chǎn)生多核肌管，最終形成成熟的肌肉纖維。另一方面，骨骼系統(tǒng)包括硬骨、軟骨、肌腱和韌帶等，共同起源于中胚層和神經(jīng)嵴產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步分化為構(gòu)成特定骨骼類型的細(xì)胞，這個(gè)過程受多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，如FGF、IGF1、MAPK、PI3K/Akt通路都可參與軟骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，軟骨形成后一部分作為永久性軟骨，另一部分可作為生長板形成的模板，這些模板可形成鈣化骨，成為縱向生長的骨骼，BMP信號通路在此過程中起著關(guān)鍵作用。在軟骨中，肥大的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ihh(indian hedgehog)，作用于生長板增厚帶附近的軟骨膜細(xì)胞，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞成熟后，產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白，包括I型膠原蛋白和骨鈣素，使骨骼有一定的彈性和硬度。

生長激素(growth hormone，)基因是研究較多的促進(jìn)生長發(fā)育的基因，也是線性骨生長的主要調(diào)節(jié)劑，可通過全身和局部胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)的產(chǎn)生來刺激骨骼生長，使機(jī)體的生長速度更快。分子育種技術(shù)運(yùn)用之初，就被通過轉(zhuǎn)基因的方式導(dǎo)入綿羊體內(nèi)獲得生長更快的個(gè)體，但是近年來研究較少。

肌肉生長抑制素(myostatin，)，也稱為生長和分化因子8(growth and differentiation factor 8，8)，位于綿羊2號染色體，主要表達(dá)于骨骼肌中，在肌肉分化和生長過程中起負(fù)調(diào)控作用，通過部分抑制成肌細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量，不同畜種中的“雙肌現(xiàn)象”已被證明均是基因突變的結(jié)果。研究表明，可降低肌肉發(fā)育相關(guān)基因7和的表達(dá)，阻斷成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其停滯在G1期，抑制成肌細(xì)胞分化。因此，當(dāng)基因敲除之后，蛋白功能受損，則會(huì)產(chǎn)生相反的效果，促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致雙肌性狀。迄今為止，已經(jīng)在多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)的突變與肌肉質(zhì)量增加相關(guān)，在不同綿羊品種中也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)突變位點(diǎn)，其中大多數(shù)位于該基因的非編碼區(qū)，這表明位于編碼區(qū)之外的遺傳變異在調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育方面有重要作用。研究表明，綿羊基因3′UTR區(qū)的SNP可將其表達(dá)水平降低約三分之一，且在顯著增加肌肉占比的同時(shí)不影響肉品質(zhì)。近年來，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究者已利用原核注射或體細(xì)胞核移植的方式獲得成功敲除的綿羊個(gè)體，這些基因編輯個(gè)體與野生型綿羊相比，體重顯著增加，骨骼肌纖維肥大，具有雙肌性狀。利用基因編輯的方法能夠快速驗(yàn)證候選基因在綿羊中的效應(yīng)并評價(jià)其運(yùn)用效果，對綿羊產(chǎn)業(yè)的未來發(fā)展具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(suppressors of cytokine signaling，2)是SOCS家族的一員，作為GH信號通路和骨骼生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可通過SH2結(jié)構(gòu)域與生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)結(jié)合，對JAK/STAT5b通路起到抑制作用，影響機(jī)體的生長、骨骼發(fā)育以及新陳代謝等，表型上可對動(dòng)物的骨骼線性增長和體重增加產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)2發(fā)生突變時(shí)，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能喪失，與受體的結(jié)合也被破壞，從而調(diào)節(jié)下游的GH/IGF1通路，對動(dòng)物的生長產(chǎn)生促進(jìn)作用。研究表明，2小鼠體型可比野生型大30%～40%，而且這種體重增加是由于內(nèi)臟器官、骨骼長度以及身體長度的顯著增加引起的。Rupp等于2015年首次在Lacaune綿羊中定位到與綿羊體型大小、體重及產(chǎn)奶量顯著相關(guān)的QTL，區(qū)段中包含2基因，當(dāng)編碼SOCS2蛋白SH2結(jié)構(gòu)域的區(qū)段發(fā)生p.R96C點(diǎn)突變時(shí)，其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，導(dǎo)致其與GHR的結(jié)合能力喪失，與野生型綿羊相比，p.R96C純合突變的綿羊的體型、體重分別增加了24%和18%。之后，Zhou等對綿羊2基因進(jìn)行單堿基編輯，將3 mRNA和sgRNA共同注射到綿羊受精卵中，實(shí)現(xiàn)了2中p.R96C的單堿基替換，獲得具有點(diǎn)突變的綿羊，證明該基因突變對于綿羊體重和體型有促進(jìn)作用。

除以上提到的基因以及、、基因都可以影響綿羊的生長性狀，基因與有類似的效應(yīng)，也是目前研究人員公認(rèn)的與綿羊臀部肌肉發(fā)育有關(guān)的基因，是影響綿羊肋骨數(shù)的重要分子標(biāo)記，而能夠影響綿羊的眼肌寬度、深度及面積，這些分子標(biāo)記都可對以后的綿羊育種提供重要的指導(dǎo)。

1.3 脂尾性狀

綿羊尾部脂肪是肥尾綿羊儲存能量的重要組織，反映了綿羊?qū)毫雍蜆O端環(huán)境的適應(yīng)性，尾部堆積的大量脂肪不僅可以增強(qiáng)綿羊在極端環(huán)境下的耐寒能力，也可作為遷徙和食物缺乏期間維持機(jī)體所需的重要能量來源，對于人類來說，它還可以在干旱和饑荒期間為人類提供高能量的食物。脂肪細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，尾部脂肪的沉積過程包括脂肪細(xì)胞的增殖、分化和成熟階段。間充質(zhì)干細(xì)胞首先分化為前體脂肪細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化為具有脂質(zhì)運(yùn)輸和合成、分泌脂肪細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)等功能的成熟脂肪細(xì)胞，之后沉積在內(nèi)臟器官、皮下或尾部，可為機(jī)體維持正常的生命活動(dòng)提供能量。這些過程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)之間相互協(xié)調(diào)，涉及PPAR、MAPK、Wnt/β-catenin、BMP/SMADs、胰島素/IGF1等相關(guān)通路，多與脂質(zhì)形成和代謝相關(guān)。然而，近幾十年來，隨生活水平的提高和飲食習(xí)慣等的改變，綿羊大脂肪尾巴作為能量儲備的優(yōu)勢逐漸減少，生產(chǎn)者和消費(fèi)者對低脂肉類更感興趣，形成相同質(zhì)量的尾部脂肪比生成等量的肌肉組織需要付出更大的飼養(yǎng)成本，且相同質(zhì)量的肥尾的價(jià)格遠(yuǎn)低于瘦肉價(jià)格，肥尾還會(huì)對母羊繁殖能力產(chǎn)生負(fù)面影響，過多的尾部脂肪沉積極大的降低了養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，探索調(diào)節(jié)綿羊尾部脂肪沉積和發(fā)育的候選基因及遺傳分子機(jī)制對培育尾脂較少的綿羊品種具有重要意義。

通過基因組學(xué)方法，已經(jīng)定位到數(shù)個(gè)與綿羊尾部脂肪沉積相關(guān)的候選基因，研究較多的為血小板衍生生長因子D(platelet derived growth factor D，)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，2)基因，在不同的綿羊脂尾相關(guān)研究中被多次提到，證明2和基因是影響綿羊肥尾表型的主要因素。其中在全世界不同尾型的綿羊中選擇信號最強(qiáng)，通過激活PDGFRβ來調(diào)節(jié)PPARγ2和C/EBPα的表達(dá)，抑制白色脂肪細(xì)胞分化，也可以通過促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的形成或增殖來影響脂質(zhì)代謝(如脂質(zhì)合成)，造成綿羊尾部的脂肪沉積。2是脂肪發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，不僅能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，還可能有助于將能量儲存分配到內(nèi)臟和皮下脂肪組織中。Zhu等的研究表明,2的錯(cuò)義突變(Ala>Val)與綿羊肥尾表型直接相關(guān)，并參與尾部脂肪沉積。最新研究也表明,2和基因的SNP可能與阿勒泰綿羊的尾脂沉積相關(guān)，但這些基因的具體作用機(jī)制還不清晰，后期可作為重要的候選基因繼續(xù)研究和驗(yàn)證。

近年來有多項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究通過利用地方綿羊品種定位到了多個(gè)影響脂尾性狀的候選區(qū)域，其中，1、、1CC、101117953等基因在綿羊尾型性狀中受到強(qiáng)烈選擇。1作為促脂肪因子，可能在胎兒發(fā)育過程中對中胚層細(xì)胞的分化起關(guān)鍵作用，并影響綿羊尾部的脂肪沉積；(也稱為)參與脂肪的發(fā)育和功能，是控制脂肪生成、分化和發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化的早期階段就已開始發(fā)揮作用；1CC位于2附近，與2有很強(qiáng)的相關(guān)性，101117953為1的反轉(zhuǎn)錄本(-PPP1CC)，但由于大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄拷貝被認(rèn)為是沒有功能的，所以猜測其可能與1相似，通過影響上游的2來發(fā)揮作用。目前,對綿羊脂尾性狀的研究仍主要集中在2和兩個(gè)基因上，研究者們也逐漸發(fā)現(xiàn)了其他有效應(yīng)的突變位點(diǎn)，但還需進(jìn)一步對其進(jìn)行功能驗(yàn)證和作用機(jī)制的探索。除此之外，一些新的相關(guān)基因和通路也逐漸被發(fā)現(xiàn)，也可作為研究其作用機(jī)制的參考。

1.4 抗病性狀

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，疫病常為養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而在綿羊中，感染源通常包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，防治辦法通常有添加抗生素、疫苗預(yù)防或治療，但都會(huì)存在相應(yīng)的問題，比如產(chǎn)生耐藥株及疫苗失效等。不同品種的綿羊在對疾病的抵抗力方面存在差異，一旦通過現(xiàn)代基因組學(xué)方法找到與某些疾病抗性相關(guān)的主效基因以及確定相關(guān)突變，就可以更深入地了解與抗性相關(guān)的分子基礎(chǔ)和遺傳變異，結(jié)合現(xiàn)代基因操作技術(shù)就有可能獲得穩(wěn)定的綿羊抗病新品系。動(dòng)物的抗病性狀的是病原體在與宿主免疫系統(tǒng)對抗過程中被打敗的結(jié)果，其抗性基因的定位大多也集中在病原體識別、免疫因子的分泌、抗感染及相關(guān)通路方面。

線蟲是寄生蟲的一種，而胃腸道線蟲(gastrointestinal nematode，GIN)是對綿羊產(chǎn)業(yè)危害最大的一種線蟲，胃腸道線蟲病是影響全球畜牧生產(chǎn)系統(tǒng)的主要健康問題，動(dòng)物感染之后可在死亡率、生產(chǎn)力和治療成本方面給全世界造成重大經(jīng)濟(jì)損失，澳大利亞綿羊產(chǎn)業(yè)中每年約有4.3億美元用于與線蟲感染相關(guān)的生產(chǎn)損失和治療成本，是世界各地綿羊和其他放牧反芻動(dòng)物的最重要的健康疾病之一。在過去的幾十年中，養(yǎng)羊業(yè)越來越依賴驅(qū)蟲藥物作為一種控制寄生蟲病的方法，然而，這種方式不僅花費(fèi)巨大又通常不是很有效，還會(huì)導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)。該病對反芻動(dòng)物的影響主要反映在體重減輕、腹瀉、厭食、貧血和死亡等方面，而幼齡羔羊又特別容易受到線蟲感染，這是影響綿羊生產(chǎn)的主要經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，大多數(shù)關(guān)于GIN抗性的QTL逐漸被定位出來。Al Kalaldeh等使用GWAS發(fā)現(xiàn)位于綿羊2號染色體上的、6基因與寄生蟲抗性之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，2、32也被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)部胃腸道線蟲感染的抗性相關(guān)。另外，綿羊?qū)€蟲的抗性及恢復(fù)能力也可能與介導(dǎo)病原體識別(、和基因家族)、先天免疫反應(yīng)(、、、20R)以及對感染的適應(yīng)性反應(yīng)(、2R、-)方面的基因有關(guān)，這些結(jié)果都可為研究綿羊抗胃腸道線蟲感染提供參考。

布魯氏菌病由布魯氏菌()感染所致，它是對反芻動(dòng)物養(yǎng)殖和人類健康危害極大的人畜共患病，該病主要對動(dòng)物的生殖系統(tǒng)造成危害，不僅能造成母羊流產(chǎn)、不孕不育，也會(huì)造成雄性動(dòng)物生殖障礙，嚴(yán)重影響牲畜生產(chǎn)性能?？蒲腥藛T對于布魯氏菌病的抗性基因也進(jìn)行了很多的挖掘，目前也有一些收獲。Li等通過構(gòu)建褪黑素合成酶(acetylserotonin O-methyltransferase)基因過表達(dá)載體，成功獲得具有抗布病的轉(zhuǎn)基因綿羊，并證明基因過表達(dá)綿羊可能通過影響免疫相關(guān)的信號通路和腸道微生物群來增強(qiáng)對布魯氏菌病的抵抗力。另一團(tuán)隊(duì)通過全基因組重測序分析，確定了4種與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)的重要途徑以及相關(guān)的候選基因，即粘附小帶(3、3和)、細(xì)胞粘附分子(1、、1和)、唾液分泌(101102109、1和2)和Hippo信號通路(3、1、3)，這些基因與細(xì)胞粘附過程密切相關(guān)，可能有助于機(jī)體發(fā)揮免疫功能的第一道屏障。

目前，病原菌疾病相關(guān)的研究很少是在建立動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上來開展的，大多數(shù)仍然是在群體中通過抗病個(gè)體來尋找可能的相關(guān)基因，或直接在發(fā)病個(gè)體或細(xì)胞水平研究其致病機(jī)制，從而來研制治療方法，原因可能是目前大家對這些疾病深入的致病機(jī)制仍不清晰，導(dǎo)致即使想要構(gòu)建動(dòng)物疾病模型卻無從下手。

1.5 羊毛性狀

綿羊毛作為一種天然的蛋白纖維在綿羊養(yǎng)殖業(yè)和紡織業(yè)中都占有重要的經(jīng)濟(jì)地位，也是毛用綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，其品質(zhì)和質(zhì)量可體現(xiàn)在羊毛的長度、細(xì)度、強(qiáng)度等方面。毛發(fā)生長發(fā)生在毛囊發(fā)育的生長期，始于真皮乳頭部周圍的基底膜干細(xì)胞，隨著細(xì)胞系分化的開始而停止分裂，之后細(xì)胞的形狀和位置停止變化，纖維細(xì)胞系開始合成角蛋白(keratin，K)，皮層逐漸角質(zhì)化，非角蛋白細(xì)胞成分逐漸分解，在上層的毛囊中，被皮脂腺和汗腺包裹的富含油脂的纖維從體表長出，形成毛發(fā)。羊毛纖維主要是由角蛋白組成的角質(zhì)層，羊毛角蛋白包括含量較穩(wěn)定的角蛋白中間絲蛋白(intermediate filament proteins，IFPs)和影響羊毛特性的角蛋白聯(lián)合蛋白(keratin associate proteins，KAPs)兩種，而角蛋白基因的表達(dá)可影響羊毛的彎曲、粗細(xì)、重量等重要經(jīng)濟(jì)特征。

綿羊的羊毛性狀是受遺傳、環(huán)境和營養(yǎng)等因素影響的復(fù)雜生理生化特性，許多信號通路和相關(guān)因素都參與到這些經(jīng)濟(jì)特征的調(diào)節(jié)中。成纖維細(xì)胞生長因子是一系列在促進(jìn)和調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長中起重要作用的因子，其中成纖維細(xì)胞生長因子5(fibroblast growth factor 5,5)基因已被證實(shí)是毛發(fā)生長的抑制劑，沉默5基因的表達(dá)會(huì)延長毛發(fā)周期的生長期VI期，導(dǎo)致極長毛發(fā)的表型，而通過靶向使5功能喪失可抑制真皮細(xì)胞的活化和毛發(fā)纖維的合成，促進(jìn)羊毛的生長和增加羊毛產(chǎn)量。除了5基因，影響綿羊毛色的刺鼠信號蛋白(agouti signaling protein，)基因也是影響羊毛質(zhì)量的重要基因，在哺乳動(dòng)物中可抑制黑色素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor，1R)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和黑色素的產(chǎn)生，調(diào)控毛發(fā)的顏色，Zhang等利用基因編輯技術(shù)破壞其功能，使綿羊的毛色發(fā)生改變。另外，角蛋白相關(guān)蛋白基因的表達(dá)及其多態(tài)性對綿羊羊毛直徑、韌性、彎曲程度的影響也已在多項(xiàng)研究中被報(bào)道。

1.6 抗逆性狀

極端氣候地區(qū)的動(dòng)物品種通過長期的自然選擇及人工選擇，在生理、生化、形態(tài)等方面獲得了穩(wěn)定的遺傳特征，以適應(yīng)高海拔、低氧、寒冷、干旱或高溫等惡劣環(huán)境。因此，極端環(huán)境中具有特殊環(huán)境適應(yīng)性的物種是挖掘抗逆機(jī)制以及候選基因的資源寶庫，如果能在全基因組水平上了解其遺傳基礎(chǔ)并闡明這些分子標(biāo)記，解析動(dòng)物不同適應(yīng)性表型的遺傳基礎(chǔ)，可為未來氣候環(huán)境變化背景下制定適當(dāng)?shù)挠N計(jì)劃提供方向。

1.6.1 高海拔適應(yīng)性狀 生活在高海拔地區(qū)的動(dòng)物為了適應(yīng)低氧帶來的挑戰(zhàn)，在生理、細(xì)胞水平都發(fā)生了適應(yīng)性變化，比如機(jī)體通過降低代謝活性、增加呼吸速率和紅細(xì)胞總量來維持氧氣運(yùn)輸，以滿足動(dòng)物維持其正常生長、發(fā)育和繁殖所需的組織氧氣水平。此外，高原動(dòng)物還會(huì)啟動(dòng)線粒體氧化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起一系列的生理變化，使動(dòng)物能夠在缺氧條件下生存，而缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)通路及相關(guān)因子在這其中發(fā)揮了重要的作用。藏羊是一種耐低氧物種，生活在極其荒涼的高海拔環(huán)境中，與低海拔地區(qū)相比，該地區(qū)紫外線輻射強(qiáng)、溫度低、氧分壓低。藏羊除了提供優(yōu)質(zhì)的羊毛和肉類外，還具有抗粗飼和適應(yīng)高海拔缺氧等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種對極端環(huán)境具有較強(qiáng)適應(yīng)性的模型，從中發(fā)掘一些有助于指導(dǎo)育種實(shí)踐的關(guān)鍵基因。目前已有大量關(guān)于高海拔適應(yīng)性的研究報(bào)道，例如藏獒(1、1)、牦牛(17、2和3)、藏羚羊(、12和3)和藏野豬(1、42和7)等，這些基因功能涉及缺氧、能量代謝、血管生成、Ca代謝、促進(jìn)紅細(xì)胞生成等方面。

利用高原上的低氧來完成正常的生理功能，這是機(jī)體在低氧的惡劣環(huán)境中生存的一種有效方式。近些年的研究報(bào)道了許多與低氧適應(yīng)性相關(guān)的候選基因，其中研究最為透徹的基因是1和1，這兩個(gè)候選基因都是在HIF通路上游起作用的關(guān)鍵基因。1(endothelial PAS domain protein 1，1)，又稱為2α，通過對不同海拔地區(qū)的山羊進(jìn)行外顯子組測序和基因分型分析，發(fā)現(xiàn)1多態(tài)性在藏絨山羊中顯示出強(qiáng)烈的選擇信號，而Q579L突變對藏絨山羊適應(yīng)高海拔環(huán)境起了關(guān)鍵作用。在綿羊上，Wei等發(fā)現(xiàn)，1基因3′UTR的一個(gè)SNP與藏綿羊適應(yīng)高海拔、促進(jìn)紅細(xì)胞生成有關(guān)，另外，該研究也發(fā)現(xiàn)了一些與代謝相關(guān)的基因，如4能維持葡萄糖穩(wěn)定性，參與糖酵解過程；與磷脂代謝相關(guān)；1可激活A(yù)TP生成并減少線粒體ROS的產(chǎn)生。綿羊的靶基因1以及位于7號染色體的7基因在高海拔地區(qū)的綿羊群體中受到顯著的選擇，可能參與高海拔條件下細(xì)胞環(huán)境中可用氧的調(diào)節(jié)或其他調(diào)節(jié)。對于1基因，在綿羊中還未見到有關(guān)其與高海拔適應(yīng)性相關(guān)的報(bào)道。

高海拔地區(qū)的生物除了要面對高海拔帶來的缺氧和寒冷問題之外，還要應(yīng)對紫外線強(qiáng)度對身體帶來的損傷，因此紫外線信號通路扮演著重要的角色。在哺乳動(dòng)物中，高強(qiáng)度的紫外線輻射可誘導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞凋亡、組織損傷和癌癥，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。Zhang等對藏雞的研究發(fā)現(xiàn)，與炎癥和免疫反應(yīng)以及與紫外輻射導(dǎo)致的DNA損傷刺激和DNA修復(fù)過程相關(guān)的基因受到選擇。在對綿羊的研究中，發(fā)現(xiàn)藏羊的和基因、印度肥尾羊的3和3基因受到紫外線照射方面的選擇。從以上研究可以看出，目前參與高強(qiáng)度紫外線輻射適應(yīng)性的研究較少，發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因也有限，并且相互之間的相似性很低。

除了以上提到的相關(guān)基因外，高海拔適應(yīng)相關(guān)的5、、和3基因也受到強(qiáng)烈選擇，但還需要進(jìn)一步的研究和功能驗(yàn)證。

1.6.2 抗寒冷性狀 由于中國北方高海拔地區(qū)有著漫長而嚴(yán)酷的高寒冬季，綿羊經(jīng)常出現(xiàn)體溫過低的情況，因此，抵御寒冷的能力對其生存至關(guān)重要。為了在處于低溫環(huán)境時(shí)維持體溫，綿羊必須增加機(jī)體的產(chǎn)熱(生熱)，這包括顫抖生熱(shivering thermogenesis，ST)和非顫抖生熱(non-shivering thermogenesis，NST)，一是通過骨骼肌的快速收縮水解ATP釋放熱量，二是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放去甲腎上腺素，激活棕色脂肪細(xì)胞表面的受體或募集富含解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein，UCP1)的產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞分解甘油三酯產(chǎn)生熱量。據(jù)報(bào)道，同一品種內(nèi)不同品系的綿羊抗寒能力存在差異，而綿羊抗寒能力增強(qiáng)的遺傳力約為0.27。

在與抗寒相關(guān)的研究中，UCP家族通常受到強(qiáng)烈選擇。該家族主要包括1、2和3，三者之間有高度同源性，1主要存在于線粒體內(nèi)膜中，是棕色脂肪的標(biāo)志物，2在全身各個(gè)組織中均有表達(dá)，3主要分布于骨骼肌和心組織中。先前的報(bào)道稱，該家族基因與不同家畜的寒冷適應(yīng)性有關(guān)，存在于綿羊15號染色體上的1基因參與寒冷誘導(dǎo)的非顫抖產(chǎn)熱，2和3基因在綿羊骨骼肌中的表達(dá)對于其適應(yīng)寒冷發(fā)揮著重要作用。通過將印度的一種高海拔綿羊品種Changthangi與分布在平原地區(qū)的綿羊品種相比較，15號染色體基因家族存在最顯著信號，說明該基因可能是參與綿羊適應(yīng)寒冷氣候環(huán)境的重要分子標(biāo)記。

1.6.3 耐高溫性狀 從春季到夏季，氣溫和環(huán)境濕度均升高的綜合影響會(huì)導(dǎo)致農(nóng)業(yè)動(dòng)物的熱應(yīng)激。熱應(yīng)激對動(dòng)物的飼料消耗、生長速度和繁殖效率影響比較明顯。據(jù)統(tǒng)計(jì)，熱應(yīng)激對全球畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響超過12億美元。研究認(rèn)為，熱應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，可造成DNA和蛋白質(zhì)的損傷，而ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是誘導(dǎo)熱休克蛋白基因(heat shock protein，)表達(dá)的關(guān)鍵因素。熱應(yīng)激對動(dòng)物健康有嚴(yán)重影響，它可能導(dǎo)致牲畜的多器官衰竭，降低其生產(chǎn)力和繁殖效率，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡，但是在沙漠地區(qū)的炎熱氣候下，仍有保持正常生長的綿羊品種，這表明在綿羊上存在耐熱性的遺傳基礎(chǔ)。

目前發(fā)現(xiàn)，與綿羊熱應(yīng)激相關(guān)的基因大多都是屬于家族或相關(guān)成員。熱休克蛋白，也被稱為分子伴侶，可由各種應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)，被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)劑，可以介導(dǎo)降解受損細(xì)胞內(nèi)的蛋白折疊，這種保護(hù)機(jī)制使細(xì)胞能夠在高溫條件下生存。此外，也能促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，而且還和免疫功能相關(guān)。的激活主要是通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factor 1，HSF1)實(shí)現(xiàn)的，HSF1是一種響應(yīng)熱應(yīng)激而被激活的轉(zhuǎn)錄因子。白綿羊中發(fā)現(xiàn)，90AA1(HSP90伴侶)基因的多態(tài)性可有效克服熱應(yīng)激并保持正常的生產(chǎn)性能，8基因中的T177P多態(tài)性也與Arabi 綿羊?qū)ρ谉釟夂虻母叨饶蜔徇m應(yīng)性有關(guān)。另外，多浪羊與中國本土其他綿羊品種遺傳距離較大，具有良好的抗逆性和耐熱性，Wang等發(fā)現(xiàn)5(dnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B5)基因多態(tài)性可能參與多浪羊的熱應(yīng)激，5為DNAJ熱休克蛋白40家族伴侶蛋白的一個(gè)成員，在免疫細(xì)胞的熱應(yīng)激耐受性中起著至關(guān)重要的作用。

2 總結(jié)與展望

很久以前人們就觀察到某一性狀在不同個(gè)體中的差別，但是由于當(dāng)時(shí)技術(shù)的局限性，只能通過傳統(tǒng)的雜交育種方式獲得所想要的性狀，而對其背后隱藏的生物學(xué)機(jī)制發(fā)掘進(jìn)展緩慢。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于基因組重測序以及GWAS等遺傳定位研究方法的普遍運(yùn)用，針對綿羊經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的研究也較之前有較大進(jìn)展。目前，鑒定出的部分綿羊經(jīng)濟(jì)性狀主效基因及效應(yīng)影響如表1所示，其中部分基因的作用機(jī)制已比較明晰，也成功構(gòu)建了動(dòng)物模型對其功能進(jìn)行驗(yàn)證。另外通過遺傳定位的方式獲得了一些候選基因，但還需要進(jìn)一步闡明機(jī)制和驗(yàn)證其功能。再加上近年來基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，這為快速建立基于基因編輯的動(dòng)物模型，驗(yàn)證候選基因在個(gè)體水平的效應(yīng)提供了解決方案，也為未來建立具有優(yōu)良性狀的綿羊新品系提供參考。