解娜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病是臨床常見的疾病類型之一，由于血脂血糖代謝紊亂導(dǎo)致灌注血管內(nèi)皮慢性損傷而形成脂質(zhì)斑塊從而導(dǎo)致缺血缺氧性心臟疾病的發(fā)生，目前臨床主要采用介入或支架手術(shù)恢復(fù)血流再灌注，但易造成再灌注損傷〔1～4〕。但關(guān)于缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。木蝴蝶具有清肺利咽、抗炎、抗氧化等作用〔5〕。程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD)5屬于促細(xì)胞凋亡基因，其在心肌細(xì)胞損傷等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔6〕。因此，本研究采用過氧化氫(H2O2)處理心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，探究其對(duì)PDCD5的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 木蝴蝶(成都曼思特生物科技有限公司)；大鼠心肌細(xì)胞H9C2(美國ATCC公司)；H2O2(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；pcDNA3.1(北京科展生物科技有限公司)；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)凋亡試劑盒(美國Sigma公司)；兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(PDCD)5抗體(美國Abam公司)；兔抗鼠谷半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase9抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 木蝴蝶總黃酮提取〔7〕：精確稱量木蝴蝶粉末100 g，置于70%乙醇內(nèi)浸潤30 min，應(yīng)用超聲提取5 min(溫度6℃，200 W)，轉(zhuǎn)移至回流裝置內(nèi)30 min，反復(fù)提取3次，收集提取液，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器回收乙醇，減壓濃縮(15 ml)，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，經(jīng)過冷凍及干燥后得到黃酮類化合物，黃酮類化合物重量為5.65 g，提取率為6.65%，含量為18.35%。將總黃酮溶解于DMSO(0.1%)溶液內(nèi)，制備木蝴蝶總黃酮母液，調(diào)整溶液濃度為10 mg/ml。取對(duì)數(shù)生長期心肌細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置control組(加入空白DMEM培養(yǎng)基)、model組(加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)〔8〕、experiment1組(加入含有濃度為2 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment2組(加入含有濃度為4 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3組(加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)〔9〕。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、pcDNA3.1-PDCD5組(pcDNA3.1-PDCD5轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3+pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組(pcDNA3.1-PDCD5轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 1×103個(gè)心肌細(xì)胞接種于96孔板，分別加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為490 nm處的吸光度值(OD)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組心肌細(xì)胞1×105個(gè)經(jīng)3 000 r/min離心6 min后棄上清，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，向細(xì)胞沉淀中依次加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4檢測(cè)MDA含量及SOD、GSH-Px活性 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書檢測(cè)各組MDA含量及SOD、GSH-Px活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5Western印跡檢測(cè)caspase3、caspase9、PDCD5蛋白表達(dá) 收集各組心肌細(xì)胞后加入500 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入caspase3(1∶1 000)、caspase9(1∶1 000)、PDCD5(1∶800)與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2的細(xì)胞活性的影響 與control組比較，model組心肌細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組心肌細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組心肌細(xì)胞活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而experiment1組心肌細(xì)胞活力與model組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2細(xì)胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

2.2木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2凋亡及PDCD5表達(dá)的影響 與control組比較，model組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組心肌細(xì)胞凋亡率及caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組心肌細(xì)胞凋亡率與caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而experiment1組心肌細(xì)胞凋亡率、caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平與model組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1、圖2。

2.3木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與control組比較，model組MDA的活性顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組MDA的含量顯著降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px的含量顯著升高(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而experiment1組MDA含量及SOD、GSH-Px活性與model組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖1 木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2凋亡的影響

1～5：control組，model組，experiment1組，experiment2組，experiment3組圖2 木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2 凋亡PDCD5、caspase3、caspase9蛋白表達(dá)的影響

2.4PDCD5對(duì)H2O2處理的H9C2的細(xì)胞活性及凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-PDC-D5組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率及caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5PDCD5對(duì)H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-PDCD5組MDA的含量顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.6PDCD5能逆轉(zhuǎn)木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2的細(xì)胞活性及凋亡的影響 與experiment3+pcDNA3.1組比較，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表3。

圖3 PDCD5對(duì)H2O2處理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表達(dá)的影響

表2 PDCD5對(duì)H2O2處理的H9C2的細(xì)胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

2.7PDCD5能逆轉(zhuǎn)木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與experiment3+pcDNA3.1組比較，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組MDA的含量顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，見表3。

1～2：experiment3+pcDNA3.1組，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組圖4 PDCD5能逆轉(zhuǎn)木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表達(dá)

表3 PDCD5能逆轉(zhuǎn)木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2處理的H9C2的細(xì)胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

3 討 論

心血管疾病已成為威脅人類生命安全的重要疾病之一，其具有發(fā)病率高及死亡率高等特點(diǎn)，既往研究顯示葒草花中的黃酮等有效成分可減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷及抑制細(xì)胞凋亡；山楂有機(jī)酸中的黃酮類物質(zhì)、有機(jī)酸等可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)；參芎葡萄糖注射液可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激〔10～12〕。但木蝴蝶的黃酮類提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2損傷的分子機(jī)制尚未闡明。

木蝴蝶醇提取物可減輕心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化型低密度脂蛋白氧化損傷〔13〕。研究顯示從中藥中提取的黃酮類化合物具有抗氧化作用，其中木蝴蝶總黃酮具有極強(qiáng)的清除氧自由基能力，還可對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，其可能作為治療心血管等疾病的藥物〔14，15〕。本研究結(jié)果顯示H2O2處理?xiàng)l件下，木蝴蝶總黃酮可促使心肌細(xì)胞活力顯著升高，在一定程度上呈劑量依賴效應(yīng)，提示木蝴蝶總黃酮可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖。心血管疾病發(fā)生過程中心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加，caspase3、caspase9被激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔16〕。本研究結(jié)果顯示H2O2處理?xiàng)l件下，木蝴蝶總黃酮可減弱心肌細(xì)胞凋亡能力及抑制caspase3、caspase9表達(dá)。氧化自由基生成量增加時(shí)細(xì)胞膜中的飽和脂肪酸可發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而生成MDA，若MDA的含量升高可反映心肌細(xì)胞過氧化損傷程度，SOD屬于抗氧化酶類，還可還原生成H2O2進(jìn)而被GSH-Px催化還原生成水及氧氣從而減輕過氧化損傷〔17〕。本研究結(jié)果顯示H2O2處理?xiàng)l件下，木蝴蝶總黃酮可降低MDA的含量而增高SOD、GSH-Px活性。

PDCD5在心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病中表達(dá)上調(diào)，沉默PDCD5表達(dá)可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及自噬從而保護(hù)心肌細(xì)胞〔18〕。沉默PDCD5表達(dá)可抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷〔19〕。抑制PDCD5的表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡〔20〕。本研究結(jié)果顯示H2O2處理后心肌細(xì)胞中PDCD5蛋白水平升高，而木蝴蝶總黃酮處理后心肌細(xì)胞中PDCD5蛋白水平降低，PDCD5過表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可提高氧化應(yīng)激水平進(jìn)而降低木蝴蝶總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用。提示木蝴蝶總黃酮可能通過下調(diào)PDCD5的表達(dá)從而減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上，木蝴蝶總黃酮可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡，并可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制PDCD5的表達(dá)有關(guān)，可為木蝴蝶總黃酮在心血管疾病中的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。