徐幸杰 潘濤 樊慧杰 肖琪 和璐璐 李艷榮 賈璐 王利然 尉杰忠肖保國 馬存根 張波 柴智

帕金森病的發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病,是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其病理特征是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的丟失和神經(jīng)元蛋白質(zhì)內(nèi)含物“路易小體”的形成[1]。目前,帕金森病尚不能完全治愈,現(xiàn)代藥物治療副作用大,手術(shù)治療風(fēng)險高。中醫(yī)藥治療帕金森病療效確切,近期臨床研究也表明中醫(yī)藥與現(xiàn)代治療相結(jié)合,能夠提高治療效果,減少不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。課題組前期研究表明中醫(yī)補(bǔ)腎方五子衍宗丸可以有效改善1-甲基-4-苯 基-1,2,3,6-四 氫 吡 啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)的帕金森病小鼠的步態(tài)紊亂,減輕神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),保護(hù)多巴胺神經(jīng)元[3-5]。進(jìn)一步的研究表明,五子衍宗丸主要活性成分金絲桃苷能夠減輕魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠多巴胺神經(jīng)元丟失和魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷,其機(jī)制與抑制多巴胺神經(jīng)元凋亡和自噬有關(guān)[6]。在此基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步探討金絲桃苷對帕金森病模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞(簡稱BV2細(xì)胞)M1/M2極化的調(diào)節(jié)作用,觀察炎性細(xì)胞因子水平和極化相關(guān)蛋白表達(dá)變化,聚焦小膠質(zhì)細(xì)胞極化,探究金絲桃苷對帕金森病模型的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 金絲桃苷對帕金森病模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化的影響研究

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只體質(zhì)量為18～22 g的雄性C57BL/6小鼠(8周齡)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,合格證號:[SCXK(京)2016-0006]。小鼠在溫度為20～25℃、濕度為40%～60%的條件下飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器 金絲桃苷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥98%,北京索萊寶科技有限公司,貨號SH8310);MPTP(美國Sigma公司,貨號M0896);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)ELISA試劑盒、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號ml002095、ml301814);酪氫酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase B kinase,p-AKT)抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號58844、4685);離子鈣接頭蛋白抗原(ionized calcium bindingadapter molecule 1,Iba-1)、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inductible nitric oxide synthase,iNOS)、驢抗小鼠IgG Alexa Fluor?647、驢抗兔IgG Alexa Fluor?555抗體(英國Abcam公司,貨號ab5076、ab96183、ab49999、ab150107、ab150074);驢抗山羊IgG Alexa FluorTMPlus 488抗體(美國invitrogen公司,貨號A32814);β-actin抗體(南京Bioworld公司,貨號AP0060);辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,HRP)羊抗兔IgG(武漢BOSTER生物工程有限公司,貨號BA1055)。多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司,型號SpectraMax Plus384),凝膠成像儀(美國Azure Biosystems公司,型號C300),熒光顯微鏡(德國Leica公司,型號DM4000B)。

1.1.3 動物分組、造模及給藥 按照隨機(jī)分配原則將小鼠分成三組:正常組、MPTP組和MPTP+金絲桃苷組,每組10只。除正常組外,其余小鼠腹腔注射MPTP建立帕金森病模型,每日1次,連續(xù)注射7天,注射劑量參考課題組前期實(shí)驗(yàn)[4-5]。將金絲桃苷與聚乙二醇400按5 mg∶100μL的比例,于37℃超聲30分鐘溶解,再用生理鹽水稀釋至所需用量,現(xiàn)用現(xiàn)配。自MPTP注射第1天起,金絲桃苷組小鼠每日腹腔注射25 mg/kg的金絲桃苷溶液,每只0.2 mL,共注射2周。

1.1.4 Western blot檢測TH蛋白表達(dá) 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,生理鹽水灌注后取腦,腦組織加入蛋白裂解液在冰上研磨并裂解30分鐘,在12000 g,4℃條件下離心15分鐘,取上清液,使用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。每孔加30μg蛋白樣品,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳分離后,200 mA濕轉(zhuǎn)2小時至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜,室溫下使用5%脫脂牛奶封閉45分鐘,使用TH(1∶2000)和β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜。次日,使用加入Tween-20的Tris緩沖液洗膜后,用HRP羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2小時,使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,條帶灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.1.5 ELISA檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,冰上快速分離腦組織,稱重后加入9倍質(zhì)量的生理鹽水,冰上研磨后3000 r/15分鐘,離心取上清液,用ELISA法檢測小鼠腦組織上清液中TNF-α和IL-1β蛋白含量。

1.1.6 免疫熒光檢測小鼠腦組織Arg-1、iNOS、Iba-1和p-AKT表達(dá) 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,先使用生理鹽水,再使用4%多聚甲醛灌注后取腦,腦組織在4%多聚甲醛中固定4小時后浸入30%蔗糖溶液中脫水48小時,腦組織沉底后取出,吸干表面水分,使用包埋劑包埋腦組織,用液氮速凍組織,使用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片,切片厚度為10μm。先使用5%BSA封閉冰凍切片,后使用Arg-1、iNOS、Iba-1和p-AKT一抗(1∶500)在4℃條件下孵育過夜,次日洗滌后使用熒光二抗(1∶500)室溫孵育切片2小時,甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察,使用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2 金絲桃苷對LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的極化的調(diào)節(jié)作用研究

1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 BV2細(xì)胞購買于北納生物,使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3天傳代一次。

1.2.2 試劑與儀器 金絲桃苷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥98%,北京索萊寶科技有限公司,貨號SH8310),LPS(北京索萊寶科技有限公司,貨號L8880);TNFαELISA試劑盒,IL-1βELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號ml002095、ml301814);AKT、p-AKT抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號4060、4685);APC-CD16/32和PE-CD206抗體(美國BioLegend公司,貨號101325、141705);βactin抗體(南京Bioworld公司,貨號AP0060);HRP羊抗兔IgG(武漢BOSTER生物工程有限公司,貨號BA1055)。多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司,型號SpectraMax Plus384),凝膠成像儀(美國Azure Biosystems公司,型號C300),流式細(xì)胞儀(美國BD公司,型號BD Accuri C6 Plus)。

1.2.3 細(xì)胞分組、造模及給藥 BV2細(xì)胞分為正常組、LPS組和金絲桃苷組。LPS組使用1μg/mL的LPS刺激BV2細(xì)胞24小時,建立BV2細(xì)胞的炎癥模型,金絲桃苷組使用1μg/mL的LPS刺激BV2細(xì)胞24小時后,再使用濃度為20μg/mL的金絲桃苷干預(yù)24小時[7]。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測BV2細(xì)胞CD206、CD16/32陽性細(xì)胞比例 BV2細(xì)胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時后刮下細(xì)胞,離心后使用CD206、CD16/32抗體避光室溫染色20分鐘,洗滌3次后使用流式細(xì)胞儀檢測CD206、CD16/32陽性細(xì)胞比例。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量 BV2細(xì)胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時后,取各組BV2細(xì)胞上清液;用ELISA檢測各組BV2上清液中TNF-α和IL-1β蛋白含量。

1.2.6 Western blot檢測AKT與p-AKT表達(dá) BV2細(xì)胞以1.5×106個/mL的密度接種于6孔板,用LPS刺激24小時后再加入金絲桃苷處理24小時,胰酶消化各組BV2細(xì)胞,離心后加入蛋白裂解液,置于冰上裂解30分鐘后在12000 g、4℃條件下離心15分鐘,取上清液,使用BCA法測定蛋白濃度。每孔加30μg蛋白樣品,經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后,200 mA濕轉(zhuǎn)2小時至PVDF膜,室溫下使用5%脫脂牛奶封閉45分鐘,細(xì)胞蛋白使用AKT、p-AKT(1∶2000)和β-actin(1∶5000),動物蛋白使用TH(1∶2000)和β-actin(1∶5000)4℃孵育過夜。次日,使用加入Tween-20的Tris緩沖液洗膜后,用HRP羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2小時,使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,條帶灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計量資料呈正態(tài)分布,且方差齊,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用Tukey檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對小鼠腦TH蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,MPTP組小鼠腦組織TH表達(dá)顯著降低(P＜0.01),而MPTP+金絲桃苷組小鼠TH表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。表明金絲桃苷改善了帕金森病小鼠多巴胺能神經(jīng)元的丟失。見表1、圖1。

表1 各組帕金森模型小鼠腦TH蛋白相對表達(dá)比率

圖1 各組帕金森模型小鼠腦TH蛋白表達(dá)

2.2 金絲桃苷對小鼠腦Iba-1/iNOS、Iba-1/Arg-1的免疫熒光表達(dá)和TNF-α、IL-1β蛋白含量的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/Arg-1雙陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P＜0.01),而Iba-1/iNOS雙陽性細(xì)胞顯著增加(P＜0.01)。與MPTP組比較,金絲桃苷+MPTP組小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/Arg-1雙陽性細(xì)胞顯著增加(P＜0.05),而Iba-1/iNOS雙陽性細(xì)胞顯著減少(P＜0.01)。ELISA結(jié)果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)。與MPTP組比較,MPTP+金絲桃苷 組小鼠腦TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著降低(P＜0.01,P＜0.01)。表明金絲桃苷能夠調(diào)節(jié)帕金森病小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型極化,改善炎癥反應(yīng)。見表2、3,圖2。

圖2 各組帕金森模型小鼠腦炎癥因子表達(dá)和腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1、Arg-1、iNOS共染

表2 各組帕金森模型小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/Arg-1和Iba-1/iNOS雙陽性細(xì)胞數(shù)比較(n=6,±s)

表2 各組帕金森模型小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/Arg-1和Iba-1/iNOS雙陽性細(xì)胞數(shù)比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與MPTP組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 Iba-1+Arg-1+細(xì)胞數(shù)(個)Iba-1+iNOS+細(xì)胞數(shù)(個)28.67±5.51 5.67±2.52 MPTP組 5.33±3.06a 27.33±5.03a MPTP+金絲桃苷組 20.33±3.51b 11.67±2.52正常組c

表3 各組帕金森模型小鼠腦勻漿炎癥因子含量比較(n=6,±s)

表3 各組帕金森模型小鼠腦勻漿炎癥因子含量比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.05,b P＜0.01;與MPTP組相比,c P＜0.01。

組別 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)102.10±10.50 89.87±6.20 MPTP組 124.90±6.54a 108.20±7.20b MPTP+金絲桃苷組 89.15±7.06c 89.82±10.68正常組c

2.3 金絲桃苷對小鼠Iba-1/p-AKT免疫熒光表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示,與正常組比較,MPTP組小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/p-AKT雙陽性細(xì)胞的比例顯著降低(P＜0.05)。與MPTP組比較,MPTP+金絲桃苷 組小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/p-AKT雙陽性細(xì)胞的比例顯著升高(P＜0.05)。表明金絲桃苷能夠增加帕金森病 小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的p-AKT蛋白表達(dá)。見表4、圖3。

圖3 各組帕金森模型小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1和p-AKT共染

表4 各組帕金森模型小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/p-AKT雙陽性細(xì)胞比例比較(n=6,±s)

表4 各組帕金森模型小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)Iba-1/p-AKT雙陽性細(xì)胞比例比較(n=6,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.05;與MPTP組相比,b P＜0.05。

組別 p-AKT+細(xì)胞數(shù)(個)Iba-1+細(xì)胞數(shù)(個)Iba-1+p-AKT+細(xì)胞比例(%)2.25±1.71 13.00±2.94 33.85±2.14 MPTP組 3.00±1.41 20.75±3.78a 15.70±4.92a MPTP+金絲桃苷組 5.00±1.83 19.50±2.89a 25.79±5.21正常組b

2.4 金絲桃苷對BV2細(xì)胞CD16/32和CD206陽性細(xì)胞比率和TNF-α、IL-1β蛋白含量的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞CD16/32陽性細(xì)胞比例顯著上升(P＜0.01),CD206蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細(xì)胞CD16/32陽性細(xì)胞比例顯著下降(P＜0.01),CD206蛋白表達(dá)顯著上升(P＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示,與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β蛋白含量顯著降低(P＜0.01,P＜0.05)。表明金絲桃苷可減輕LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞極化。見圖4,表5、6。

表5 各組BV2細(xì)胞CD16/32陽性細(xì)胞和CD206陽性細(xì)胞比例比較(n=3,±s)

表5 各組BV2細(xì)胞CD16/32陽性細(xì)胞和CD206陽性細(xì)胞比例比較(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 CD16/32陽性比例(%)CD206陽性比例(%)19.04±3.83 26.04±4.07 LPS組 41.53±4.74a 7.75±3.52a金絲桃苷組 19.92±4.53c 17.91±4.27正常組b

圖4 各組BV2細(xì)胞上清液中炎癥因子表達(dá)和CD16/32、CD206陽性細(xì)胞比例

表6 各組BV2細(xì)胞上清液炎癥因子含量比較(n=3,±s)

表6 各組BV2細(xì)胞上清液炎癥因子含量比較(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.05,c P＜0.01。

組別 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)正常組 160.32±25.11 145.84±14.93 b LPS組 398.90±22.87a 237.32±13.01a金絲桃苷組 138.74±18.18c 195.02±17.69 b

2.5 金絲桃苷對BV2細(xì)胞AKT、p-AKT表達(dá)的影響

與正常組比較,LPS組BV2細(xì)胞p-AKT/AKT的表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與LPS組比較,金絲桃苷組BV2細(xì)胞中p-AKT/AKT的表達(dá)顯著升高(P＜0.01),表明金絲桃苷能夠增加LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的p-AKT蛋白表達(dá)。見表7、圖5。

表7 各組BV2細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白相對表達(dá)比率(n=3,±s)

表7 各組BV2細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白相對表達(dá)比率(n=3,±s)

注:與正常組相比,a P＜0.01;與LPS組相比,b P＜0.01。

組別 p-AKT/AKT(灰度比值)1.207±0.054 LPS組 0.489±0.069a金絲桃苷組 0.671±0.051正常組b

圖5 各組BV2細(xì)胞AKT、p-AKT蛋白表達(dá)

3 討論

目前,帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。眾多研究認(rèn)為,帕金森病的發(fā)生是環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、炎癥等因素共同作用的結(jié)果。神經(jīng)炎癥反應(yīng)對帕金森病的發(fā)生發(fā)展具有不容忽視的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是定居在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞,通過分泌細(xì)胞因子和吞噬功能發(fā)揮固有免疫作用,小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的重要來源[8]。當(dāng)組織受損或病原體入侵時,小膠質(zhì)細(xì)胞會被激活并向不同的表型分化,發(fā)揮不同的作用。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞是促炎型細(xì)胞,高表達(dá)iNOS和CD16/32,吞噬能力較弱,并釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子;M2型小膠質(zhì)細(xì)胞是抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞,高表達(dá)Arg-1和CD206,吞噬能力較強(qiáng),并釋放IL-10等抗炎細(xì)胞因子[9-10]。研究發(fā)現(xiàn),帕金森病患者血液、紋狀體和腦脊液中的炎性細(xì)胞因子水平較正常人群顯著增加[11-13]。同時,帕金森病患者的紋狀體和嗅球中也存在大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,主要表型為M1型[14-15]。而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化,能夠減輕中樞神經(jīng)炎癥,保護(hù)多巴胺神經(jīng)元,改善運(yùn)動功能紊亂[16]。因此,靶向小膠質(zhì)細(xì)胞M1向M2轉(zhuǎn)化,進(jìn)而抑制其介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),是保護(hù)多巴胺神經(jīng)元的有效方案之一。

金絲桃苷是一種黃酮類化合物,在帕金森病模型中被證實(shí)具有多巴胺神經(jīng)保護(hù)作用和抗炎抗氧化作用。Seung-Hwan Kwon等[17]研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷能夠通過激活Nrf2/HO-1通路保護(hù)6-OHDA誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞的損傷。Wang Kai等[18]研究發(fā)現(xiàn)金絲桃苷通過激活MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型中的PACAP-CREB途徑減弱NLRP3炎性體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。但金絲桃苷能否調(diào)節(jié)帕金森病模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的極化從而治療帕金森病仍是未知。MPTP是一種神經(jīng)毒素,能夠透過血腦屏障,隨后被單胺氧化酶B代謝為1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridine,MPP+),MPP+會被多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體錯誤識別并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元線粒體,與線粒體復(fù)合物I結(jié)合,隨后阻斷線粒體呼吸鏈,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因此被廣泛用于帕金森病的研究[16]。本研究首先使用金絲桃苷干預(yù)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型,結(jié)果顯示金絲桃苷能夠顯著減少帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的丟失,且顯著減少了小膠質(zhì)細(xì)胞M1型(Iba-1+iNOS+)的數(shù)量,增加了M2型(Iba-1+Arg-1+)的數(shù)量,并降低了炎性細(xì)胞因子的表達(dá),表明金絲桃苷能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而抑制中樞神經(jīng)炎癥。

PI3K/AKT/mTOR通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的存活,遷移和擴(kuò)散,但也協(xié)調(diào)響應(yīng)巨噬細(xì)胞中的不同代謝和炎癥信號。PI3K/AKT/mTOR通路可被TLR4、Fc受體、細(xì)胞因子等激活,進(jìn)而激活下游信號分子產(chǎn)生細(xì)胞因子[19]。激活或過表達(dá)AKT激酶可減少小膠質(zhì)細(xì)胞的活化;AKT激活可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2型編碼基因的上調(diào)[20]。此外,抑制AKT2可以減少巨噬細(xì)胞的吞噬作用[21]。動物實(shí)驗(yàn)顯示金絲桃苷顯著提高了帕金森病小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞AKT的磷酸化水平,這表明金絲桃苷調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化或許與促進(jìn)AKT蛋白磷酸化有關(guān)。

為了進(jìn)一步明確金絲桃苷促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的作用,在證實(shí)金絲桃苷對帕金森病小鼠的治療作用后,課題組使用金絲桃苷干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞炎癥模型。BV2細(xì)胞是一種永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)中常用LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活化模擬中樞神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。課題組的研究結(jié)果顯示,金絲桃苷顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞M1型標(biāo)記物CD16/32的表達(dá),并促進(jìn)M2型標(biāo)記物CD206的表達(dá),ELISA結(jié)果顯示金絲桃苷顯著減少了促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的蛋白含量。此外,Western blot結(jié)果金絲桃苷顯著增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞AKT蛋白的磷酸化水平。這些結(jié)果表明,金絲桃苷能夠靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表型由M1型轉(zhuǎn)化為M2型,減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng),其作用機(jī)制可能與促進(jìn)AKT蛋白磷酸化有關(guān)。

綜上所述,研究證實(shí)金絲桃苷能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化,減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng),可能與其激活A(yù)KT信號有關(guān),為金絲桃苷治療帕金森病的機(jī)制研究提供了新思路。但金絲桃苷對于小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力及整個AKT信號通路的影響還有待進(jìn)一步研究。