汪 豐，張維樹，崔 穎，葉林燕，李夢托，曾維斯，周 煥，劉 楠，閆達中,

（1.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430023；2.武漢中糧食品科技有限公司，湖北武漢 430023）

棉籽粕為棉籽經(jīng)過脫殼、壓榨等工序得到的副產(chǎn)品，我國年產(chǎn)量600 萬噸。棉籽粕作為一種農(nóng)業(yè)廢棄物，價格低廉，粗蛋白含量可達40%左右，是極具開發(fā)潛力的植物蛋白質(zhì)飼料資源。然而其含有棉酚、單寧、植酸等多種抗營養(yǎng)因子，它的應用價值受到限制。按棉酚的存在形式，可將其分為游離棉酚和結合棉酚，而前者會在動物體內(nèi)蓄積，通過氧化應激反應，造成動物肝損傷，生殖功能障礙，引發(fā)呼吸窘迫、心律失常和溶血性貧血，有研究報道飼糧游離棉酚含量為162.5 mg/kg 時，導致育肥豬中毒死亡，更嚴重的是不同畜禽體內(nèi)殘留的游離棉酚通過食物鏈累積威脅著人類的健康。盡管我國棉籽粕產(chǎn)量很高，但受限于游離棉酚的毒性，其在飼料生產(chǎn)中的利用率還不到35%。因此，研究如何去除棉粕中的棉酚具有重要意義。

通過物理方法或者化學方法去除棉酚還存在諸多問題，或是能耗太高，或是會造成溶劑殘留、破壞原有營養(yǎng)成分等。近年來，微生物處理法逐漸成為研究熱點，它不僅可以降解包括棉酚在內(nèi)的抗營養(yǎng)因子，無二次污染，還可以提高棉籽粕的蛋白質(zhì)含量，發(fā)酵產(chǎn)物中存留的許多酶類、維生素、氨基酸以及促生長因子，大大改善棉籽粕的營養(yǎng)價值和飼用價值。目前文獻報道的棉酚降解菌有曲霉、酵母菌、紅球菌、芽孢桿菌、乳桿菌等，侯敏等通過對比飼喂正常飼料和棉粕飼料下棉鈴蟲（）腸道微生物的異同，分離棉酚耐受性腸道內(nèi)生菌32 株，對棉酚最高降解率達90.83%。在棉酚降解產(chǎn)物鑒定方面，周生飛運用LC-MS/MS 對發(fā)酵液進行檢測，獲得18 種棉酚降解產(chǎn)物，推導出相應分子結構，提出了近平滑假絲酵母菌降解棉酚的代謝途徑。棉酚與萘的結構相似，可以將其看成萘的衍生物，有學者認為微生物降解棉酚的過程可能與萘的降解相似；同時棉酚是一種多環(huán)芳烴，目前已報道的參與多環(huán)芳烴降解的酶有加氧酶、脫氫酶和木質(zhì)素降解酶。關于微生物降解棉酚蛋白組學方面的研究報道寥寥無幾，目前僅有Yang 等以黑曲霉（）AN-1 為研究對象，以棉酚為唯一碳源培養(yǎng)后對其進行蛋白質(zhì)組學分析，并利用MALDI-TOFMS測定其中可能參與棉酚降解的20種蛋白質(zhì)。

目前微生物降解棉酚的研究大多集中在降解菌的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化，對于菌體利用棉酚為唯一碳源的生長和降解過程關注較少，而該部分研究對于闡明棉酚的微生物降解途徑及生物學機制具有重要意義。本研究從山東棉花種植地及棉籽榨油廠附近采集土壤樣品，篩選出一株可高效降解棉酚的菌株，研究該菌在無機鹽培養(yǎng)基中的生長降解特性，根據(jù)底物譜分析初步推斷棉酚的開環(huán)途徑，旨在為棉粕的微生物脫毒產(chǎn)業(yè)化提供更多的微生物降解菌種資源，也為深入研究棉酚降解機理提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉籽粕 來自新疆棉粕加工廠；土樣 山東濱州薊縣棉花種植地及棉籽榨油廠（土樣取自土表層3 cm 以下）；醋酸棉酚 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4；篩選培養(yǎng)基：醋酸棉酚5.0 g，（NH）SO2.0 g，MgSO·7HO 0.2 g，KHPO0.5 g，CaCl·2HO 0.1 g，KHPO0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2～7.4；無機鹽培養(yǎng)基（Mineral salts medium，MM）（1000 mL）：（NH）SO2.0 g，NaHPO·12HO 14.3 g，KHPO3 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.3 mg，儲存緩沖液（500×）2 mL；儲 存 緩 沖 液：MnSO·HO 0.07 g，MgSO·7HO 0.015 g，CuSO0.0125 g，ZnSO0.0125 g，HBO0.0125 g，溶于蒸餾水，定容至500 mL，過濾除菌。

T-GRADIENT PCR 儀 德國Biometra 公司；SPX-3008SH-II 生化培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；ZQLY300F 振蕩培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DYY-6C 電泳儀、DYY-6C 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 北京六一儀器廠；SW-CJ-IBM 超凈工作臺 蘇州安泰空氣有限公司；5417R 臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；EC20 pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；UV1780 紫外分光光度計日本島津；Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜 美國安捷倫；LDZM-80L-Ⅲ高壓自動滅菌鍋 上海申安；ZF-288 瓊脂糖電泳凝膠成像系統(tǒng) 上海金鵬分析儀器廠；YS100 顯微鏡 日本尼康。

1.2 實驗方法

1.2.1 棉酚降解菌株的篩選 來自山東的土壤取10 g樣品分散到90 mL 無菌水中，放入28 ℃恒溫搖床180 r/min 培養(yǎng)，24 h 后將土壤懸液取出，并進行梯度稀釋。分別取10和10的梯度稀釋液100 μL，涂布于無機鹽加棉酚的培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱5 d。挑取不同形態(tài)的單菌落，分別劃線轉接到以棉酚為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，獲得可以棉酚為唯一碳源生長的純培養(yǎng)物。同時利用添加5 g/L 棉酚的篩選培養(yǎng)基加入土壤懸液進行連續(xù)的傳代培養(yǎng)4～5 周，富集后稀釋涂布平板。從上述平板上挑選長出的單菌落，接種到添加1 mmol/L棉酚無機鹽培養(yǎng)基，鑒定是否可以利用底物棉酚作為碳源生長。

1.2.2 棉酚降解菌的鑒定 從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長的菌株，并將其命名為 YL01。將YL01 制片，進行革蘭氏染色，用光學顯微鏡油鏡觀察細菌形態(tài)。

YL01 生理生化鑒定參考文獻[23-24]進行。

用細菌通用引物進行16S rRNA 基因PCR 擴增。PCR 反應體系（50 μL）為PCR Buffer （5×）10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，引物27F （5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'） 1 μL，引物1492R （5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'） 1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.5 μL，模板4 μL （單菌落加50 μL 無菌水100 ℃煮8 min，離心后取上清為模板），無菌水32.5 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物送上海生工測序，測得的序列登錄NCBI用blastn 進行序列比對，利用Clustal W 和MEGA 7.0 軟件進行分析，Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 YL01 抗生素抗性分析 在無機鹽培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種到添加不同抗生素（氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素和鏈霉素的濃度分別為50、34、10、15、20、10、10 μg/mL）的5 mL 1/4 LB 培養(yǎng)基中，每個實驗組設置三重復，對照組為不加抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基。180 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)，分別在第1、2、3 d 觀察其是否生長，以測試其對抗生素的抗性情況。

1.2.4 菌株生長曲線和對棉酚的降解效果

1.2.4.1 棉酚標準工作曲線 配制摩爾濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mmol/L 的棉酚標準溶液，溶劑為0.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液，每個濃度設置三重復，經(jīng)HPLC 測定計算峰面積。色譜條件如下，色譜柱：Thermo Fisher Accucore C柱，流動相：0.2%磷酸-乙腈（20:80 V/V），流速：0.5 mL/min，紫外檢測波長：235 nm，進樣量：5 μL，柱溫：25 ℃。以棉酚標準液的摩爾濃度（mmol/L）為縱坐標，以峰面積為橫坐標，繪制標準曲線，并求得回歸方程為：y=（2×10）x-0.004，=0.999。

1.2.4.2 菌體生物量和棉酚降解率的測定 在以0.65 mmol/L 濃度的醋酸棉酚為唯一碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基中，接種YL01 單菌落，180 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)。同時設置不接菌的空白對照組，實驗組與空白組均設置三重復。通過平板稀釋計數(shù)法檢測其10 d 內(nèi)的生長情況。在第3、15、24、36、48、72、96、132、168、204、240 h 取100 μL 菌液，稀釋后取50 μL 涂布于1/4 LB 平板（稀釋倍數(shù)為10～10，以長出的單菌落數(shù)量在30～300 之間為宜），每個稀釋度設置三重復，置于28 ℃培養(yǎng)，1 d 后計菌落數(shù)，按下列公式進行計算：

同時取1 mL 菌液加入等體積的乙酸乙酯，渦旋充分萃取，靜置分層后取上清液，重復兩次后合并上清液，取1 mL 用氮氣吹干，用0.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液重新溶解后，經(jīng)HPLC 測定，將峰面積代入標準曲線回歸方程計算棉酚含量。根據(jù)下式計算降解率。

式（2）中：c為最后一天實驗組棉酚含量，mmol/L；c為第0 d 實驗組的棉酚含量，mmol/L。

1.2.5 YL01 底物譜分析 將新活化的單菌落，接種到添加2 mmol/L 不同底物（萘、聯(lián)苯、水楊酸、鄰苯二酚、原兒茶酸、龍膽酸、對苯醌）的MM 培養(yǎng)基中，通過測定OD觀察其是否生長。

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實驗 為將來大規(guī)模培養(yǎng)菌株sp. YL01，考慮使用廉價的原料，降低生產(chǎn)成本，確定玉米漿為氮源，探索YL01 的最佳碳源及碳源濃度條件。固定氮源為濃度40 g/L 的玉米漿，設置5 mmol/L 和10 mmol/L 濃度梯度的甘油、淀粉和葡萄糖為碳源，每組三重復，保持其余組分添加濃度與種子培養(yǎng)基濃度相同。分別接種，于28 ℃ 200 r/min 搖床過夜培養(yǎng)，除去過夜時間，每隔3 h 取樣測定吸光度OD，探究菌株在組分優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長情況。

1.2.7 固態(tài)發(fā)酵過程中蛋白含量以及棉酚降解效率測定

1.2.7.1 Bradford 法制作蛋白質(zhì)標準曲線 配制1 mg/mL 牛血清蛋白（BSA）標準品溶液，分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 的BSA 標準溶液，再分別加入0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 和0 mL 的雙蒸水，混勻后準確吸取40 μL 于離心管中，加入考馬斯亮藍試劑2 mL，混勻后遮光反應5 min，以雙蒸水為空白對照，在波長595 nm 處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，并求得回歸方程為：y=0.565x+0.108，=0.971。

1.2.7.2 固態(tài)發(fā)酵 稱量0.1156 g 醋酸棉酚，溶解到5 mL 丙酮中，在100 g 滅菌棉粕（精確至0.001 g）中逐滴加入棉酚溶液，拌勻后取12 g 棉粕接種YL01 菌液10 mL（接種量為7×10CFU），同時設置不加菌的空白對照組，實驗組與空白組均設置三重復。放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵。

1.2.7.3 棉粕中棉酚含量的測定 從第0 d 開始，每48 h 取1 g 樣品加入14 mL 丙酮后進行渦旋，超聲輔助萃取，靜置取上清1 mL 氮吹至干，用0.2%磷酸-乙腈（15:85 V/V）溶液溶解后，經(jīng)HPLC 測定峰面積，代入標準曲線回歸方程計算棉酚含量。

1.2.7.4 棉粕粗蛋白的提取 準確稱取1 g 棉柏樣品，粉碎過80 目篩，按1:15（W/V）的料液比加水渦旋5 min，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)體系pH 至11.5，50 ℃浸提2 h，6000 r/min 離心10 min，分離得上清液，再往殘渣中加10 mL 水渦旋2 min，50 ℃浸提過夜，6000 r/min 離心10 min，分離得上清液，合并兩次提取液。

1.2.7.5 棉粕蛋白含量的測定 取40 μL 棉粕蛋白提取液，加水稀釋至2 mL，再取40 μL 稀釋液和2 mL 考馬斯亮藍試劑混合，遮光反應5 min 后在波長595 nm 處測吸光值。平行重復三次，以40 μL 水和2 mL 考馬斯亮藍試劑混勻后調(diào)零。將吸光度代入標準曲線回歸方程計算蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 棉酚降解菌株的篩選

從土樣中篩選到一株以棉酚為唯一碳源生長的菌株，并將其命名為YL01。菌株YL01 在無機鹽固體培養(yǎng)基上菌落濕潤、粘稠、邊緣整齊，如圖1。在光學顯微鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)球形。

圖1 YL01 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacterium YL01

2.2 棉酚降解菌的鑒定

2.2.1 菌株YL01 革蘭氏染色鑒定 對棉酚降解菌YL01 進行革蘭氏染色，呈現(xiàn)紅色，因此鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌（G），如圖2。

圖2 YL01 革蘭氏染色鑒定Fig.2 Gram staining identification of bacterium YL01

2.2.2 YL01 生理生化特征 YL01 能在5、10、41 ℃生長，不能在50 ℃生長，能水解尿素，不能產(chǎn)吲哚，也不能使L-鳥氨酸脫羧（見表1），這些特征與相同。但是YL01 能利用L-阿拉伯糖、淀粉和葡萄糖生長，而.不能；YL01 能在5 ℃生長，能利用L-鼠李糖、D-果糖、淀粉和葡萄酸鈣，而1GBT 不能；YL01 不能利用松三糖，而1GBT、可以。YL01 能在41 ℃生長、能水解尿素、能利用淀粉、葡萄糖、葡萄酸鈣和檸檬酸鈉生長，而不能；YL01 不能產(chǎn)吲哚，也不能使L-鳥氨酸脫羧，而可以。經(jīng)過全基因組測序，YL01 的DNA 的GC 含量為55.64%，與.NBRC 14939 的55.4% GC 含量相接近。結果表明，YL01 的生理生化性質(zhì)與和較為接近。

表1 YL01 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of YL01

2.2.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建將測得的16S rRNA 序列與NCBI GenBank 中所有已測定的原核生物的16S rRNA 序列進行比對，與IL11 的一致性達到99%以上。使用MEGA7.0 軟件處理所得數(shù)據(jù)，得到了YL01及相關菌株的進化距離并構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。初步鑒定YL01 為拉烏爾菌屬（sp.）。

圖3 菌株YL01 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strainYL01

2.3 YL01 抗生素抗性分析

在1/4 LB 培養(yǎng)基中添加不同的抗生素，通過測定OD觀察YL01 生長情況，結果顯示菌株可以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，表明其具有氨芐青霉素的抗性，而對氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素、萘啶酸、慶大霉素、鏈霉素均無抗性（表2）。因此YL01在環(huán)境中釋放較為安全，具有較好的應用前景。

表2 YL01 在含有不同抗生素的1/4 LB 培養(yǎng)基中的生長情況Table 2 Growth of YL01 in 1/4 LB medium containing different antibiotics

2.4 YL01 生長曲線和對棉酚的降解效果

在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中，YL01 從24 h開始進入生長對數(shù)期，第168 h 生物量達到最大值并進入穩(wěn)定期（圖4）。第10 d 棉酚降解率為48%。由于底物棉酚難溶于水，當用丙酮溶解后加入液體培養(yǎng)基會形成渾濁的懸濁液，無法使用分光光度計測定OD了解菌體生長情況，因此采用平板稀釋涂布計數(shù)法來監(jiān)測菌體生長，菌落總數(shù)統(tǒng)計檢測存在一定計數(shù)誤差。

圖4 YL01 的生長曲線和底物棉酚濃度隨時間的變化Fig.4 The growth curve of YL01 and the change of substrate gossypol concentration with time

2.5 YL01 底物譜分析

在無機鹽培養(yǎng)基中添加不同的底物（濃度均為2 mmol/L），觀察YL01 7 d 內(nèi)的生長情況，結果顯示其除了可以利用棉酚外，還能利用鄰苯二酚、原兒茶酸和對苯醌作為唯一碳源生長，不能利用萘和聯(lián)苯作為唯一碳源生長（表3）。說明菌株YL01 可能以鄰苯二酚或原兒茶酸開環(huán)途徑代謝棉酚，可能存在多條與芳香族化合物代謝相關的基因簇，但是降解途徑不經(jīng)過萘和聯(lián)苯，具體開環(huán)方式仍需進一步研究。

表3 YL01 在不同底物中的生長情況Table 3 The growth of YL01 in different substrates

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源實驗

在不同碳源（甘油、淀粉、葡萄糖）組成的培養(yǎng)基中，YL01 均在第9 h 進入對數(shù)生長期（圖5），在第27 h 生物量達到最大值，其在10 mmol/L 葡萄糖中OD最高，可以達到11.5。但是考慮到原料價格成本因素，確定5 mmol/L 淀粉為最適碳源培養(yǎng)YL01用于后續(xù)固態(tài)發(fā)酵實驗。

圖5 YL01 在不同碳源中的生長情況Fig.5 Growth of YL01 in different carbon sources

2.7 固態(tài)發(fā)酵效率及蛋白含量變化

對棉粕固態(tài)發(fā)酵不僅能降低棉酚含量，還可提高其營養(yǎng)價值，改善飼料適口性，同時檢驗YL01的實際脫毒效果。與空白對照組相比，8 d 內(nèi)棉酚含量極顯著降低（＜0.01），降解率為43%（圖6），同時蛋白含量增加了10%（圖7）。隨著時間延長棉粕中水分蒸發(fā)會使其質(zhì)量減少，帶來棉酚含量的上升，考慮到這一點，實際降解率應高于測定值。蛋白含量的增加是由于在發(fā)酵的過程中，菌株分泌的各種酶。由于菌體接種量較小，僅為5.83×10CFU/g，通過加大接種量可以提高固態(tài)發(fā)酵過程中對棉酚的降解率。為了排除棉粕中土著菌株和高溫高壓對棉酚含量的影響，本實驗將棉粕滅菌后額外加入棉酚，在部分已發(fā)表的文獻中，固態(tài)發(fā)酵實驗并沒有這一步操作，其真實降解效率值得商榷。

圖6 棉粕中棉酚含量隨時間的變化Fig.6 Changes of gossypol content in cottonseed meal with time

圖7 棉粕中蛋白含量隨時間的變化Fig.7 Changes of protein content in cottonseed meal with time

3 結論

從土壤中篩選分離到一株以棉酚為唯一碳源生長的菌株，經(jīng)16S rRNA 基因測序和生理生化鑒定，鑒定其為sp.。YL01 在以棉酚為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中生長10 d，棉酚的降解率為48%；接種該菌株到棉粕中，固態(tài)發(fā)酵8 d 后棉酚的降解率達43%，蛋白含量增加10%。YL01 與其他拉烏爾菌屬的種在進化上親緣關系較遠，是否是一個新種，需要進一步實驗研究。本研究在以棉酚為唯一碳源的培養(yǎng)基中測定菌株的生長和對棉酚的降解，還同時測定了液體培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵條件下的棉酚降解效率，二者互相印證了該菌對棉酚的降解能力。本研究提供了更多降解棉酚的微生物菌種資源，對運用生物技術消除棉粕中棉酚具有潛在的應用前景，也為進一步開展棉酚的微生物降解機理研究奠定了基礎。