安 然

（沈陽科技學(xué)院， 遼寧 沈陽 110167）

微柱高效液相色譜（μ-High Performance Liquid Chromatography, μ-HPLC）是在傳統(tǒng)液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的[1]。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在了藥物檢測、食品安全、蛋白質(zhì)組分分析[2-3]等領(lǐng)域。毛細(xì)管色譜柱作為分離方法的核心，決定了分離效果的好壞。

最常用的色譜柱是毛細(xì)管填充柱。該柱在不同內(nèi)徑的毛細(xì)管內(nèi)填充十八烷基鍵和的硅膠顆粒（ODS）或者其他功能化的硅球等，這些小顆粒具有多孔性，可以根據(jù)實際情況進(jìn)行選擇或改性[4]且比較容易控制孔徑的大小。然而，填充柱在制備時需要燒制塞子，這一過程會破壞固定相表面的功能化基團(tuán)且影響柱子的滲透性，使填充柱應(yīng)用在毛細(xì)管電泳（CE）時容易產(chǎn)生氣泡。在一些液相色譜應(yīng)用中，燒制塞子也可能產(chǎn)生非特異性吸附，造成譜帶變寬。

整體柱通過原位聚合功能單體，使固定相與毛細(xì)管管壁進(jìn)行鍵和，該柱具有更高的相比和柱容量且無需燒制塞子。根據(jù)整體材料基質(zhì)的不同，整體柱分為有機(jī)-無機(jī)混合整體柱、無機(jī)硅膠整體柱和有機(jī)聚合物整體柱[4]。

無機(jī)柱采用溶膠-凝膠法制備而成，其最主要的物理化學(xué)變化就是水解縮聚反應(yīng)。該柱具有很好的抗溶脹性，而且空隙率高，具有較大通孔尺寸和骨架尺寸比值，可以在高流速和低背壓下提供高柱效[5]，但仍然存在一定的缺點，如制備過程復(fù)雜且難以控制，在干燥和焙燒過程中固定相極易產(chǎn)生開裂和變形彎曲、制備比較費(fèi)時、需要限制pH 使用范圍等。

有機(jī)柱是單體混合液及致孔劑通過熱引發(fā)，自由基引發(fā)或紫外光引發(fā)的方式在毛細(xì)管內(nèi)原位聚合反應(yīng)而成的。有機(jī)柱制備簡單，可以通過改變不同的功能單體來控制固定相表面的化學(xué)性質(zhì)，因而可選用的單體種類較多，pH 值適用范圍廣。但該柱在有機(jī)溶劑中易發(fā)生溶脹效應(yīng)影響柱子的重現(xiàn)性，機(jī)械穩(wěn)定性較差[6]。

有機(jī)-無機(jī)混合整體柱結(jié)合了有機(jī)柱和無機(jī)柱pH 適用范圍廣、機(jī)械穩(wěn)定性高、滲透性高的優(yōu)點，避免了填充柱需要燒制塞子，制備過程復(fù)雜的缺點，得到了很廣泛的應(yīng)用。比較常見的制備方法有以下幾種：

一步法[7]通常以四烷氧基硅烷和含一個有機(jī)功能基團(tuán)的三烷氧基硅烷Si(OR)3為原材料，運(yùn)用溶膠-凝膠法將有機(jī)功能基團(tuán)引入無機(jī)硅膠骨架中，從而避免了無機(jī)柱柱后修飾這一復(fù)雜過程，但是該方法依賴于帶有功能基團(tuán)的硅烷試劑，在一定程度上限制了一步法的應(yīng)用。

一鍋法[8]中有機(jī)單體和無機(jī)烷氧基硅烷通過原位縮合和共聚的方式將功能基團(tuán)鍵和在無機(jī)硅膠整體基質(zhì)中。該方法具有一定的可變性，可以通過采用不同的有機(jī)單體來制備具有不同性能的整體柱。然而，烷氧基硅烷的使用會導(dǎo)致硅烷醇基團(tuán)殘留在整體固定相表面，實際應(yīng)用中因產(chǎn)生非特異性吸附而造成峰拖尾或是譜帶展寬。

硅球包夾整體柱將功能化的小顆粒包夾在可陷入的基質(zhì)中[9]，運(yùn)用不同的基質(zhì)可以陷入不同的填充材料，而且合成的包夾整體柱都與其相應(yīng)的填充柱具有相似的特性。然而，硅酸鹽基質(zhì)對固定相有一定的屏蔽作用，且在NH4OH 沖洗期間，容易產(chǎn)生水解，因而用硅酸鹽作為陷入基質(zhì)的包夾柱保留值明顯比填充柱小。有機(jī)多孔聚合物在陷入基質(zhì)方面有著很大的應(yīng)用價值[10]。高度交聯(lián)的聚合物在致孔劑的存在下形成連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)，使溶液能夠順利通過。然而，在顆粒之間行成的聚合物不僅會使包夾柱產(chǎn)生不必要的高背壓，還會掩蔽填充顆粒的官能團(tuán)。

為克服目前整體柱存在的主要缺點，本實驗制備了一種有機(jī)-無機(jī)混合整體柱。這種整體柱是在填充了裸硅球的毛細(xì)管中通過熱引發(fā)使功能單體甲基丙烯酸（MAA）、2-二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯（DAMA）和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）原位聚合的。由于整體柱中所有的功能性聚合物都是由硅球作為載體的，所以把這種整體柱稱為硅球擔(dān)載聚合物整體柱，簡稱擔(dān)載柱（supported column,S-column）。在優(yōu)化了擔(dān)載柱的制備條件之后，從機(jī)械穩(wěn)定性、滲透性、溶脹行為、柱效等方面對其進(jìn)行了評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HH-501 型超級恒溫水?。ń饓邪姿鸩龑嶒瀮x器廠，江蘇）；自組裝液相色譜系統(tǒng)：Model 500液相色譜泵（Lab Alliance, USA）,手動進(jìn)樣閥（三通），Micro 21 UV-01 紫外-可見光檢測器（Jasco，日本）；KYKY-1000B 型掃描電子顯微鏡（SEM，中國科學(xué)院科學(xué)儀器廠）；微型精密酸度計（B-212，日本）；雙通道色譜工作站（N3000，浙江大學(xué)）。

裸硅球顆粒（直徑5 μm，深圳高比科技有限公司）；石英毛細(xì)管（內(nèi)徑250 μm，外徑375 μm，河北永年）；甲基丙烯酸（MAA，ACRōS，美國）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA， ACRōS，美國）；γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS，武漢凱博實驗儀器有限公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，上海化學(xué)試劑有限公司）；2-二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯（DAMA，ACRōS，美國）；環(huán)己醇（化學(xué)純，天津富辰化學(xué)試劑廠）；甲醇（分析純，天津富辰化學(xué)試劑廠）；其他無機(jī)試劑均為分析純。

1.2 硅球擔(dān)載聚合物整體柱的制備

取7 cm 內(nèi)徑為250 μm，外徑為375 μm 的石英毛細(xì)管，利用真空吸入法填入直徑為5 μm 的裸硅球，并對毛細(xì)管及硅球進(jìn)行預(yù)處理。準(zhǔn)確稱量一定量的AIBN（引發(fā)劑）于離心管中，之后向離心管內(nèi)移取一定量的MAA（單體），DAMA（單體），EDMA（致孔劑），環(huán)己醇（致孔劑）和水（致孔劑），向聚合反應(yīng)混合液中通入氮氣并超聲振蕩5 min，制成反應(yīng)液a。移取一定量的甲醇（致孔劑）于離心管中，除氣泡后制成反應(yīng)液b。用注射器將其注入到填充了硅球的毛細(xì)管中，兩端塞上硅膠塞密封后置于恒溫水浴中反應(yīng)。待反應(yīng)完成，用甲醇溶液沖洗整體柱，以除去未反應(yīng)的單體及致孔劑，最終制成硅球擔(dān)載聚合物整體柱。

有機(jī)聚合物對硅球的包覆情況通過致孔劑的組成比例、單體總濃度和聚合反應(yīng)時間來控制，并通過壓力-流速曲線以及擔(dān)載柱橫截面的掃描電鏡圖確定最佳制備條件。經(jīng)驗證，該柱最佳條件為：致孔劑組成，V（水）∶V（甲醇）∶V（環(huán)己醇）=1∶1∶8；單體總質(zhì)量分?jǐn)?shù)T= 25%（C= 30%，V（MAA）∶V（DAMA）∶V（EDMA）=3∶3∶2；引發(fā)劑AIBN 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%;反應(yīng)時間5 h；反應(yīng)溫度：60 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅球擔(dān)載聚合物整體柱的表面形態(tài)

通過對比圖1A 和圖1B、1C，可以觀察到小硅球表面包覆著一層薄薄的聚合物且厚度不超過1 μm，聚合物并沒有在硅球中間形成，而是與硅球聯(lián)結(jié)在一起，形成了一個整體，且形成顆粒的徑向分布與填充柱相似。圖1A 顯示聚合物以納米小顆粒的形式聚合在硅球表面，有效的增大擔(dān)載柱固定相的比表面積，從而可以增大擔(dān)載柱的柱容量。

圖1 擔(dān)載柱（A），有機(jī)柱（B）和裸硅球（C）的掃描電鏡圖（放大3 000 倍）

2.2 機(jī)械穩(wěn)定性和滲透性

擔(dān)載柱的機(jī)械穩(wěn)定性和滲透性是通過如圖2 所示壓力-流速關(guān)系曲線來進(jìn)行評價的。有機(jī)柱在壓力為0.83～7.93 MPa 的條件下，呈現(xiàn)出了很好的線性關(guān)系，當(dāng)壓力大于7.93 MPa 時，流速不再隨著壓力的增大而增大，而且曲線的斜率逐漸接近壓力軸一側(cè)，由此可以證明此時有機(jī)柱的部分固定相已經(jīng)發(fā)生了坍塌。而擔(dān)載柱，當(dāng)壓力從0.52 MPa 增加到15.17 MPa 時，流速隨著壓力的增加而增加，很好的證明了該柱具有很高的機(jī)械穩(wěn)定性。當(dāng)壓力大于15.17 MPa 時，擔(dān)載柱固定相從毛細(xì)管中被沖出來，這可能是因為固定相與毛細(xì)管壁是靠與有機(jī)柱相似的聚合反應(yīng)鍵和到一起的。而對于傳統(tǒng)的填充柱來說，由于塞子的存在，填充的硅球不容易被沖出毛細(xì)管外，但是當(dāng)壓力超過填充硅球的壓力時，柱內(nèi)填充的顆粒會越來越緊，從而引起背壓過高的問題。

圖2 有機(jī)柱（A）和擔(dān)載柱（B）的壓力對流速關(guān)系曲線

2.3 柱效

圖3 所示是擔(dān)載柱（A）和有機(jī)柱（B）在200～900 nL·min-1的流速區(qū)間內(nèi)檢測5 mM NO2-的Van Deemter 曲線。

圖3 擔(dān)載柱（A）和有機(jī)（B）的 Van Deemter 關(guān)系曲線

擔(dān)載柱曲線的形狀與填充柱相似，在400 nL·min-1的流速下有最小理論塔板高度（Hmin=8 μm）。有機(jī)柱的曲線在300 nL·min-1的時候有最小理論塔板高度（Hmin= 16 μm）。相同情況下，在所有的流速中，擔(dān)載柱測量出的柱效均比有機(jī)柱高。尤其在最佳流速之后，擔(dān)載柱柱效的損失比有機(jī)柱慢，由此可以證明擔(dān)載柱的傳質(zhì)阻力比有機(jī)柱小很多，該特點使擔(dān)載柱相對于有機(jī)柱更適用于在高流速下進(jìn)行快速分析。

3 結(jié) 論

本實驗通過與相應(yīng)的有機(jī)聚合物整體柱在色譜性能與機(jī)械性能等方面進(jìn)行對比，對制備的擔(dān)載柱進(jìn)行了評價。實驗證明，與傳統(tǒng)的有機(jī)柱相比，擔(dān)載柱的機(jī)械穩(wěn)定性高，不易溶脹和縮聚，柱容量高以及柱效高。以上優(yōu)點說明擔(dān)載柱有很大的潛力廣泛應(yīng)用于微柱液相色譜以及毛細(xì)管固相萃取中，特別是應(yīng)用于液相色譜的梯度洗脫中。