王申偉 ，王瓊 ，陳軍童 ，趙艷艷

（1.河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，許昌 461000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450000）

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎病的主要病理特征，其輕重程度是各種腎臟疾病向腎功能的惡化程度的關(guān)鍵因素，成為了威脅世界公共健康的主要疾病之一[1-2]。腎小管上皮細(xì)胞向上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要是上皮細(xì)胞的黏附能力降低，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)增加，基底膜破壞以及細(xì)胞侵襲和遷移能力增加[3-4]。上皮質(zhì)間質(zhì)轉(zhuǎn)化受許多細(xì)胞因子的調(diào)控，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），是一種致纖維化因子，研究表明其對腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[5]。因此，阻斷或抑制TGF-β1的作用已成為防治腎間質(zhì)纖維化的重要靶點(diǎn)。

淫羊藿苷是淫羊藿中重要有效成分，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕等作用[6]。研究表明，淫羊藿苷對肝、腎等臟器具有保護(hù)作用，對防治腎纖維化具有較好的療效[7]。但淫羊藿苷對腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用尚不明確?；诖?，本研究采用人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2），通過TGF-β1誘導(dǎo)后，分別采用不同濃度的淫羊藿苷干預(yù)后，觀察細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)因子α-SMA、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（ECad）、波形蛋白（Vim）以及Samd信號通路的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及試劑盒 HK-2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。FBS胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基和 0.05%的胰蛋白酶（Gibco，Waltham，MA）；淫羊藿苷（Sigma-Aldrich）；TGF-β1（廣州聚研生物有限公司）；Trizol試劑和 BCA 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，lnc.）；CCK-8 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；0.25%甲紫溶液（索萊寶科技有限公司）；Transwell小室（密理博科技有限公司）；PrimeScriptTM RT 試劑盒（Takara Biotechnology）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）；RIPA緩沖液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、SDS-PAGE和PVDF膜（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人 α-SMA、E-cadherin、vimentin、Smad2/3、p-Smad2/3和 GAPDH單分子抗體（Abcam）；兔抗鼠二抗（Cell Signaling Technology）；超敏發(fā)光液ECL（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞通過常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37℃恒溫，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。隔日進(jìn)行傳代1次，實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 將HK-2細(xì)胞接種于6孔板，待其長至密度40%～50%后，將其分為空白對照組、TGF-β1 組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40μmol/L）組。TGF-β1組是將10 μg/L的TGF-β1干預(yù)HK-2細(xì)胞 24 h。TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組是 HK-2細(xì)胞在 10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo) 24 h后，換成 10、20、40 μmol/L 的淫羊藿苷干預(yù) 24 h?？瞻讓φ战M是未干預(yù)的HK-2細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞增殖 將空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組在鋪于96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)量為5 000個/孔。每1組均需要設(shè)立6個復(fù)孔用于計(jì)算該組平均值。在各組藥物干預(yù)過后，添加CCK-8試劑，每孔10 μL/孔。在37℃孵育2 h，放入酶標(biāo)儀內(nèi)，450 nm檢測各孔OD值，分析各組細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 待空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L） 組的 HK-2細(xì)胞長至80%～90%，用10 μL槍頭尖端在培養(yǎng)皿中央垂直劃一道痕跡，用PBS洗去脫壁的細(xì)胞，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24 h后，放于倒置顯微鏡觀察劃痕兩側(cè)細(xì)胞遷移的距離，遷移率=（劃痕寬度0 h-劃痕寬度12 h/24 h）/劃痕寬度0 h×100%。該實(shí)驗(yàn)需獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組。TranswellTM 小室上層表面加入100 μL 的基質(zhì)膠（Matrigel），搖勻后放置培養(yǎng)箱40 min。將100 μL不含血清培養(yǎng)基稀釋淫羊藿苷分別至 10、20、40 μmol/L 以及添加 10 μg/L TGF-β1，調(diào)整HK-2細(xì)胞密度至每毫升3×105個，取500 μL接種至上層。每組設(shè)立3個復(fù)孔。培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將小室取出，用甲醇固定15 min后，風(fēng)干后，再向孔內(nèi)添加2.5 mL/L甲紫溶液染色30 min。將小室放在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野（×200），拍照記錄遷移下室的細(xì)胞總數(shù)。該實(shí)驗(yàn)需獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR法檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平 將空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組的細(xì)胞收集后，通過Trizol試劑分別提取各組總RNA。通過NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測RNA純度和濃度，使用總RNA逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增為cDNA（反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 60 min，85 ℃ 5 min）。20 μL PCR 反應(yīng)體系：0.4 μL 目的模板cDNA，10 μL SYBR-Green qPCR Master Mix 和對應(yīng)的上下游引物各 0.4 μL，8.8 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火 45 s，72℃ 延伸 30 s，共計(jì) 40個循環(huán)，在 ABI 7500 fast儀器中進(jìn)行。以GAPDH作為mRNA的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，基因表達(dá)結(jié)果均以2-ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)所有PCR引物序列見表1。

表1 實(shí)時熒光定量PCR所需的引物序列

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將空白對照組、TGF-β1 組、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組細(xì)胞液氮碾磨后，用 RIPA 緩沖液和PMSF抑制蛋白降解液（100∶1）將樣本裂解后提取各組總蛋白。通過BCA試劑檢測蛋白質(zhì)的總濃度，將各組的總蛋白濃度調(diào)為一致，將其于100℃進(jìn)行變性后保存至-20℃。SDS-PAGE電泳分離總蛋白后，將其轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。然后用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min后，將其放入對應(yīng)的一抗（α-SMA、E-cadherin、vimentin、Smad2/3、p-Smad2/3 和 GAPDH）和一抗稀釋混懸液（1∶1 000）中，4℃孵育過夜。再用TBST洗滌3次，放入二抗和二抗稀釋液（1∶4 000）混懸液中，室溫孵育 2 h。TBST洗滌3次，每次10 min，將超敏發(fā)光液ECL滴在膜上，放入化學(xué)發(fā)光成像儀（Invitorgen，USA）進(jìn)行蛋白顯影。通過Image J軟件進(jìn)行分析結(jié)果，相對蛋白表達(dá)以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2增殖能力 CKK-8的結(jié)果表明，與空白對照組比較，TGF-β1組的細(xì)胞增殖水平顯著增加（P＜0.05）。與TGF-β1組比較，隨著淫羊藿苷干預(yù)濃度的增加，細(xì)胞增殖水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖影響（±s）

表2 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05。

組別 數(shù)量 增殖水平，OD值空白對照組 3 1.042±0.065 TGF-β1 組 3 1.863±0.094*淫羊藿苷組（10 μmol/L） 3 1.316±0.081#淫羊藿苷組（20 μmol/L） 3 1.259±0.082#淫羊藿苷組（40 μmol/L） 3 1.221±0.062#

2.2 淫羊藿苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2侵襲能力 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組（P＜0.05）。TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于TGF-β1組（P＜0.05），隨著淫羊藿苷干預(yù)濃度增加，細(xì)胞侵襲數(shù)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1A和表3。

圖1 5組HK-2細(xì)胞的侵襲情況（×200）

表3 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力影響（±s）

表3 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力影響（±s）

注：5組HK-2細(xì)胞侵襲數(shù)量的柱狀圖分析（與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05）。

組別 數(shù)量 侵襲數(shù)量，個空白對照組 3 71.2±5.12 TGF-β1組 3 201.1±9.24*淫羊藿苷組（10 μmol/L） 3 141.8±7.81#淫羊藿苷組（20 μmol/L） 3 112.3±6.28#淫羊藿苷組（40 μmol/L） 3 99.4±4.17#

2.3 淫羊藿苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組比較，TGF-β1組在24 h內(nèi)遷移率顯著增加（P＜0.05）。與TGF-β1 組比較，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組在24 h內(nèi)遷移率顯著下降（P＜0.05）。隨著淫羊藿苷增加，遷移率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2A和表4。

圖2 24 h 5組HK-2細(xì)胞的遷移情況（×40）

表4 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞侵襲能力影響（±s）%

注：5組24 h HK-2細(xì)胞劃痕率的柱狀圖分析（與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05）。

組別 數(shù)量 遷移率空白對照組 3 42.5±3.27 TGF-β1組 3 68.1±2.41*淫羊藿苷組（10 μmol/L） 3 48.3±1.19#淫羊藿苷組（20 μmol/L） 3 44.3±1.83#淫羊藿苷組（40 μmol/L） 3 43.7±2.71#

2.4 淫羊藿苷抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力 實(shí)時定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，TGF-β1組的 α-SMA、vimentin蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），而E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與 TGF-β1組比較，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L） 組的 α-SMA、vimentin 蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白和 mRNA 表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 3A 和表 5、6。

表5 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 蛋白表達(dá)情況的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05。

組別 數(shù)量 α-SMA vimentin E-cadherin空白對照組 3 0.171±0.041 0.221±0.036 1.150±0.095 TGF-β1 組 3 0.761±0.078*1.052±0.096*0.123±0.018*淫羊藿苷組（10 μmol/L） 3 0.421±0.056#0.398±0.059#0.942±0.048#淫羊藿苷組（20 μmol/L） 3 0.362±0.049#0.371±0.079#0.891±0.078#淫羊藿苷組（40 μmol/L） 3 0.331±0.059#0.302±0.094#0.921±0.099#

表6 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 基因表達(dá)情況的影響（±s）

表6 不同濃度淫羊藿苷對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 基因表達(dá)情況的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05。

組別 數(shù)量 α-SMA vimentin E-cadherin空白對照組 3 0.326±0.097 0.301±0.036 1.000±0.080 TGF-β1 組 3 0.612±0.096*0.735±0.038*0.452±0.018*淫羊藿苷組（10 μmol/L） 3 0.333±0.056#0.401±0.059#0.812±0.058#淫羊藿苷組（20 μmol/L） 3 0.362±0.037#0.399±0.079#0.851±0.078#淫羊藿苷組（40 μmol/L） 3 0.328±0.031#0.362±0.044#0.892±0.048#

2.5 淫羊藿苷阻礙TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2中Smad信號通路 Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，TGF-β1組的p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值顯著增加（P＜0.05）。與 TGF-β1組比較，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）組的 p-Smad2/3/Smad2/3蛋白顯著降低（P＜0.05）。與 TGF-β1+淫羊藿苷（20 μmol/L）組比較，TGF-β1+淫羊藿苷（40 μmol/L）組和 TGF-β1+淫羊藿苷（10 μmol/L）組的 p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和表7。

圖4 不同濃度的淫羊藿苷對Smad信號通路Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表達(dá)情況

表7 不同濃度的淫羊藿苷對p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值比較（±s）

表7 不同濃度的淫羊藿苷對p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 TGF-β1 組比較，#P＜0.05。

組別 數(shù)量 p-Smad2/3/Smad2/3空白對照組 3 0.421±0.079 TGF-β1 組 3 0.875±0.082*TGF-β1+淫羊藿苷（10 μmol/L）組 3 0.484±0.023#TGF-β1+淫羊藿苷（20 μmol/L）組 3 0.503±0.048#TGF-β1+淫羊藿苷（40 μmol/L）組 3 0.442±0.052#

3 討論

近年來，盡管慢病腎臟病的治療效果取得進(jìn)展，但仍合適的藥物和方法對慢病腎臟病患者進(jìn)行有效的根治，由于腎間質(zhì)內(nèi)的纖維化加劇，最終發(fā)展為終末期腎病[8]。腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是活化的肌成纖維細(xì)胞的重要來源，其主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的黏附性降低，α-SMA的表達(dá)能力減低以及細(xì)胞的遷移和侵襲能力增加[4，10]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生過程需要多種分子參與，如TGF-β1，其作為最強(qiáng)的促纖維化因子，在腎臟纖維化中表達(dá)量增加，可通過Smad信號通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[11-12]。在TGF-β1的誘導(dǎo)下，腎小管上皮細(xì)胞表型發(fā)生變化，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)量減少，間充質(zhì)標(biāo)志性蛋白α-SMA的表達(dá)量增加，其機(jī)制主要是由于TGF-β1激活轉(zhuǎn)錄因子Smad2/3磷酸化，繼而與Smad4共同活化形成低聚復(fù)合體，啟動核轉(zhuǎn)錄信號，最終調(diào)控腎臟上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)[5，13]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)后，HK-2細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力明顯增加，并且α-SMA、vimentin蛋白和mRNA表達(dá)量增多，E-cadherin蛋白和基因表達(dá)量減少，表明TGF-β1刺激后HK-2細(xì)胞發(fā)生了EMT，提示構(gòu)建成功腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后，HK-2細(xì)胞中Smad信號通路被激活，p-Smad2/3與Smad2/3的比值明顯增加，這說明，TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中可能是通過激活Smad信號通路而影響其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力。

淫羊藿苷作為淫羊藿主要的有效成分之一，具有滋腎壯陽，保護(hù)腎臟等功能[14]。研究表明：淫羊藿苷對減輕慢性腎衰竭大鼠的腎臟組織纖維化，抑制腎小管萎縮[15]。淫羊藿苷可抑制由TGF-β1刺激的腎成纖維細(xì)胞的增殖和內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)，對腎纖維化具有較好的效果[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10、20、40 μmol/L的淫羊藿苷均可以抑制 TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力，并且隨著淫羊藿苷濃度的增加，其對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的抑制能力無明顯變化。本實(shí)驗(yàn)Western blot和qPCR結(jié)果顯示，α-SMA、vimentin蛋白和基因表達(dá)量減少，E-cadherin蛋白和基因表達(dá)量增加，說明淫羊藿苷可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，但不會隨著淫羊藿苷濃度增加而抑制能力增加。為了進(jìn)一步探究淫羊藿苷對HK-2細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究檢測Smad信號通路的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10、20、40 μmol/L 的淫羊藿苷均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞的Smad信號通路的傳導(dǎo)，主要是p-Smad2/3與Smad2/3蛋白比值明顯降低。

綜上所述，TGF-β1可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其可通過激活Smad2/3的磷酸化，從而引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)因子表達(dá)發(fā)生變化。淫羊藿苷能顯著逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及增殖，侵襲和遷移能力，本研究也證實(shí)淫羊藿苷可通過抑制Smad2/3的磷酸化，從而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子α-SMA、vimentin和E-cadherin的表達(dá)，從而影響腎小管上皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力。由于腎纖維化形成的機(jī)制十分復(fù)雜，與多種細(xì)胞因子和信號通路相關(guān)，因此，淫羊藿苷對治療腎纖維化的效果和作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。