王新潮，張?zhí)N哲，楊倩,2，盧鑫，徐慧，張偉,4,5

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院河北保定 071001; 2. 河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院河北保定 071002; 3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院 河北 滄州 061100; 4. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北 保定 071001; 5. 河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 保定 071001）

0 引 言

單增李斯特氏菌為需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于各類食品中[1-2]。感染該菌能引起流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥、胃腸炎等，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致死亡[3-4]。此外，該菌也是我國(guó)乳制品中致病菌檢測(cè)指標(biāo)之一。因此，開發(fā)快速靈敏檢測(cè)單增李斯特氏菌活菌，對(duì)于保障食品安全具有重要的意義[5]。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法結(jié)果可靠但耗時(shí)費(fèi)力[6]，快速檢測(cè)方法如PCR 可以快速檢出食品中的單增李斯特氏菌[7-8]。該方法需要昂貴的熱循環(huán)儀，操作復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究基于在前期研究中發(fā)現(xiàn)Bst DNA聚合酶擴(kuò)增DNA 的新特性，創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增（SRCA）檢測(cè)靶基因的新方法[9]。疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）作為一種能夠區(qū)分死活菌的核酸染料，目前已被廣泛報(bào)道并應(yīng)用[10-12]。本研究將實(shí)時(shí)熒光SRCA 技術(shù)（RF-SRCA）與PMA 結(jié)合，建立可實(shí)時(shí)檢測(cè)單增李斯特氏菌活菌的PMA-RFSRCA 方法，為食源性致病菌檢測(cè)提供新途徑、新策略。

1 材料與方法

1.1 試劑與試劑盒

細(xì)菌基因組提取試劑盒、PMA 染料、20×EvaGreen染料，北京索萊寶生物科技有限公司；PMD18-T 載體，大連寶生物工程有限公司；Bst DNA 聚合酶大片段，New England Biolabs；dNTP、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、膠回收DNA 試劑盒，天根生化科技有限公司；單增李斯特氏菌增菌肉湯（LB1），北京陸橋技術(shù)股份有限公司； 單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基， 法國(guó)CHROMAgar；正反引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

StepOne Plus 熒光定量PCR 儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司(ABI)；Synergy HTX 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；紫外凝膠成像分體系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；DDY-8C 型電泳儀，北京六一儀器廠；DK-8D 型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；TG16A 型離心機(jī)，上海盧湘儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

本研究所采用的的SRCA 方法僅需一對(duì)引物，無需人為環(huán)化及鎖式探針連接，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)雙鏈線性DNA 模板的等溫高效擴(kuò)增，目前已被成功用在多種致病菌的檢測(cè)[13-17]。該方法以單增李斯特氏菌溶血素基因(hlyA)作為靶基因，在GENbank 中挑選同源性較高的hlyA 基因序列（GENBANK 號(hào)：AF253320.1），利用DNAMAN 和Oligo7 軟件輔助篩選特異性引物，所得引物見表1。

表1 引物信息

1.3.2 活菌培養(yǎng)、DNA 模板與死菌的制備

將單增李斯特氏菌活化后接種到LB1 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行前增菌，在30 ℃下?lián)u床過夜培養(yǎng)，以此為菌原液，進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各梯度菌懸液制備DNA 模板。分別取500 μL 菌原液于1.5 mL 的離心管中，采用高溫煮沸法處理5 min，采用平板計(jì)數(shù)法評(píng)估致死效果，以確保無活菌生長(zhǎng)[18]。

1.3.3 PMA 處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.3.3.1 PMA 工作濃度的優(yōu)化

將1 mg PMA 染料溶于98 μL ddH2O，制備終濃度為20 mg/mL 母液，并放置-20 ℃冰箱中避光保存。取上述制備好的死菌菌懸液500 μL，分別加入不同體積的PMA 母液使其最終的工作濃度為0、10、20、30、40 μmol/L?；靹蚝蟀捣跤?0 min，隨后在距500 W鹵鎢燈20 cm 處進(jìn)行光反應(yīng)15 min。為了防止因強(qiáng)光照射導(dǎo)致溫度的升高，光反應(yīng)階段全部在冰上進(jìn)行。將處理好的菌懸液按照核酸提取試劑盒說明書提取DNA 并進(jìn)行PMA-RF-SRCA 反應(yīng)，通過觀察擴(kuò)增結(jié)果來確定PMA 抑制死菌DNA 擴(kuò)增的最適工作濃度。

1.3.3.2 PMA 暗孵育時(shí)間優(yōu)化

取制備好的死菌菌懸液500 μL，加入1.3.3.1優(yōu)化后的最適濃度的PMA，混勻后分別進(jìn)行暗孵育0、5、10、15、20 min。隨后在距500 W 鹵鎢燈20 cm 處進(jìn)行光反應(yīng)15 min，后續(xù)步驟與1.3.3.1 相同。

1.3.3.3 PMA 光反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

取制備好的死菌菌懸液500 μL，加入1.3.3.1 優(yōu)化后的最適濃度的PMA，混勻，采取1.3.3.2 優(yōu)化后的最適暗孵育時(shí)間進(jìn)行孵育，隨后于冰上分別進(jìn)行光反應(yīng)0、5、10、15、20 min。后續(xù)步驟與1.3.3.1 相同。

1.3.4 PMA-RF-SRCA 方法建立

通過優(yōu)化得出PMA-RF-SRCA 最佳的反應(yīng)體系為：dNTPs 5 μL（0.5 mmol/L）、Mg2+3 μL（5.96 mmol/L）、10×Buffer2.5μL（1×）、FWP 與RVP 各1.5 μL（0.6 mmol/L）、模板2 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL（0.32 U/μL）、甜菜堿溶液3 μL（0.6 mol/L）、20×Eva Green 熒光染料1.25 μL（1×），用ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃，10 s；62 ℃，1 min，設(shè)定40 個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集；最后80 ℃，5 min 終止反應(yīng)。

1.3.5 PMA-RF-LAMP 方法建立

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[19]建立PMA-RF-LAMP 方法。反應(yīng)體系為：dNTPs 4 μL（1.6 mmol/L），F(xiàn)3 和B3 各0.5 μL（0.2 μmol/L），F(xiàn)IP 和BIP 各1 μL（1.6 μmol/L），甜菜堿4 μL（0.8 mol/L），Mg2+1 μL（8 mmol/L），Bst DNA聚合酶0.5 μL（0.16 U/μL），10 × ThermoPol 緩沖液2.5 μL（1×），20 × Eva Green 熒光染料1.25 μL（1×），用ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 s；65 ℃，1 min，設(shè)定40 個(gè)循環(huán)，同時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集；最后80 ℃，5 min 終止反應(yīng)。

1.3.6 SRCA 產(chǎn)物測(cè)序分析

SRCA 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后，在紫外燈下自下而上選取3 條清晰條帶，按照膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，之后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、純化等操作，最后送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.7 PMA-RF-SRCA 特異性試驗(yàn)

采用建立好的PMA-RF-SRCA 方法，針對(duì)6 株單增李斯特氏菌和12 株非單增李斯特氏菌分別提取模板DNA，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。菌株信息和結(jié)果如表2 所示。

表2 本研究用到的菌種及其來源和檢測(cè)結(jié)果

1.3.8 純培養(yǎng)物靈敏度試驗(yàn)

選取單增李斯特氏菌CMCC 54001 作為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，取100 μL 菌懸液進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)，得知濃度為3.9 × 108CFU/mL，用無菌LB1 液體培養(yǎng)基進(jìn)行10 倍梯度稀釋，獲得濃度為3.9×107～3.9 CFU/mL 的菌懸液。用試劑盒提取DNA 模板后進(jìn)行PMA-RFSRCA 反應(yīng)，通過分析實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線確定該方法的靈敏度。

1.3.9 人工污染乳檢出限試驗(yàn)

本研究中使用純牛奶（購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校┳鳛榧訕?biāo)樣品，試驗(yàn)前先按照《GB 4789.30-2016》[20]對(duì)所用樣品進(jìn)行檢測(cè)，以確定純牛奶中不含單增李斯特氏菌。取上述所得已知濃度的菌懸液1 mL 分別加入24 mL 的陰性樣品中，制備成1.56 × 107～1.56 CFU/mL 的人工污染樣品，用試劑盒提取DNA 模板后進(jìn)行PMARF-SRCA 和PMA-RF-LAMP 反應(yīng)，比較兩種方法的檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA 處理?xiàng)l件的優(yōu)化

疊氮溴化丙錠（PMA）可以穿透死菌或者膜損傷菌體的細(xì)胞膜，與DNA 結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，致使死菌或者膜損傷菌體的DNA 無法進(jìn)行擴(kuò)增，只有活菌的DNA 才能進(jìn)行正常的擴(kuò)增，以此達(dá)到區(qū)別死菌和活菌的目的。在使用不同濃度的PMA 處理死菌后，PMA-RF-SRCA 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。隨著PMA終濃度逐漸提高，死菌DNA 的擴(kuò)增起峰時(shí)間明顯增長(zhǎng)，這充分說明PMA 與死菌的DNA 交聯(lián)并抑制后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。此外，當(dāng)PMA 終濃度達(dá)到30 μmol/L時(shí)，無熒光信號(hào)。因此，本文選取30 μmol/L 為PMA處理死菌的最佳濃度。

圖1 PMA 工作濃度優(yōu)化

2.2 PMA 暗孵育及光反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

在暗孵育時(shí)PMA 可以侵入死菌的細(xì)胞膜并與dsDNA 交聯(lián)，當(dāng)進(jìn)行光照處理時(shí)PMA 分子中疊氮基團(tuán)能夠和DNA 骨架上的碳?xì)浠衔锝宦?lián)形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合物，從而抑制死菌DNA 的擴(kuò)增反應(yīng)。而殘留在溶液中未結(jié)合的PMA 分子在強(qiáng)光照射下迅速分解成無交聯(lián)活性的羥胺化合物，避免與后續(xù)提取的活菌DNA 結(jié)合，以防出現(xiàn)漏檢[21]。

添加終濃度為30 μmol/L 的PMA 后，經(jīng)過不同時(shí)間的暗孵育后，如圖2 所示，結(jié)果表明：當(dāng)暗孵育時(shí)間為10 min 時(shí)，未出現(xiàn)熒光信號(hào)，這說明10 min 的暗孵育足以使PMA 與死菌DNA 完全交聯(lián)，同時(shí)不影響活菌DNA 擴(kuò)增。因此，選取10 min 為PMA-RFSRCA 的最佳暗孵育時(shí)間。

圖2 PMA 暗孵育時(shí)間優(yōu)化

添加終濃度為30 μmol/L 的PMA，并進(jìn)行10 min的暗孵育后，置于冰上進(jìn)行不同時(shí)間的光反應(yīng)。如圖3所示，結(jié)果表明：在0～20 min 的光反應(yīng)過程中死菌DNA 擴(kuò)增的起峰時(shí)間顯著增加，其增加趨勢(shì)與光反應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)光反應(yīng)時(shí)間為15 min 時(shí)，PMA 對(duì)于死菌DNA 擴(kuò)增的抑制效果最為明顯。雖然更長(zhǎng)的光反應(yīng)時(shí)間也具有同樣的抑制效果，但是基于節(jié)省時(shí)間的理念，本方法選取15 min 作為光反應(yīng)的最佳時(shí)間。

圖3 PMA-RF-SRCA 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及測(cè)序結(jié)果

圖3 PMA 光反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

2.3 PMA-RF-SRCA 擴(kuò)增產(chǎn)物及特異性分析

PMA-RF-SRCA 的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的梯形條帶。自上而下第一條擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為76 bp，第二條擴(kuò)增片段包括兩段76 bp 長(zhǎng)度的目的片段以及添加片段。第三條擴(kuò)增片段包括三段76 bp 長(zhǎng)度的目的片段以及兩段添加片段。這符合理論的擴(kuò)增方式，因此，該方法的擴(kuò)增結(jié)果正確。

特異性試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。6 株單增李斯特氏菌均為陽性結(jié)果，而12 株非單增李斯特氏菌均為陰性結(jié)果。結(jié)果表明，該引物對(duì)具有良好的特異性。

2.4 靈敏度分析

將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液（菌液濃度為：3.9 ×108CFU/mL）進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋后，使用試劑盒提取DNA 進(jìn)行PMA-RF-SRCA 檢測(cè)。由圖5 得知，濃度為3.9 × 107～3.9 CFU/mL 的菌懸液均有熒光信號(hào)。因此，所建立的PMA-RF-SRCA 方法檢測(cè)活菌的靈敏度為3.9 CFU/mL。

圖5 PMA-RF-SRCA 方法靈敏度分析

2.5 人工污染乳的檢出限分析

將加標(biāo)后的牛奶按照試劑盒要求進(jìn)行DNA 提取，分別進(jìn)行PMA-RF-LAMP 和PMA-RF-SRCA反應(yīng)。PMA-RF-SRCA 擴(kuò)增結(jié)果如圖6（a）所示，在1.56×107～1.56×10 CFU/mL 的范圍內(nèi)均能發(fā)生擴(kuò)增，但是當(dāng)菌液濃度降低至1.56 CFU/mL 時(shí)，未出現(xiàn)擴(kuò)增的熒光信號(hào)，故該方法的檢出限為1.56×10 CFU/mL。同樣對(duì)于PMA-RF-LAMP 反應(yīng)如圖6（b）所示，當(dāng)菌液濃度為1.56 CFU/mL 時(shí)也未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，因此，PMA-RF-SRCA 方法和PMA-RF-LAMP 方法具有同樣的檢出限。

圖6 檢出限分析

3 結(jié) 論

本研究利用PMA 能特異區(qū)分死活菌的特性與RF-SRCA 結(jié)合，建立了一種新的檢測(cè)單增李斯特氏菌活菌的方法即PMA-RF-SRCA。通過對(duì)PMA 處理?xiàng)l件的優(yōu)化得出最佳處理方案：PMA 終濃度30 μmol/L、暗孵育10 min、光反應(yīng)15 min。結(jié)果表明在此條件下該方法具有良好的區(qū)分死活菌的檢測(cè)效果，引物特異性良好，純培養(yǎng)物靈敏度為3.9 CFU/mL，加標(biāo)樣品檢出限低至1.56 × 10 CFU/mL，本方法的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法且與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中分子方法檢測(cè)能力相當(dāng)[22]?？傊狙芯拷⒘艘环N靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)食品中單增李斯特氏菌活菌的PMARF-SRCA 方法，為其他食源性致病菌的活菌檢測(cè)提供了新思路，對(duì)保障食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和參考價(jià)值。