武南南， 封芮芮， 張 宇， 李 光， 曹濟民， 殷麗天△

(1. 山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學教育部重點實驗室， 細胞生理學山西省重點實驗室， 太原 030001； 2. 西南醫(yī)科大學心血管醫(yī)學研究所， 醫(yī)學電生理學教育部重點實驗室， 四川 瀘州 646000)

焦慮障礙在世界范圍內的患病率逐年升高，其相關臨床和基礎研究也受到廣泛關注[1]。焦慮的特征是持續(xù)的覺醒、警惕和恐懼，由多個腦區(qū)介導，如杏仁核、終紋床核、前額葉皮層和海馬等[2]，其中杏仁核被認為是調節(jié)焦慮的關鍵腦區(qū)。同時，大量證據支持多個神經遞質系統(tǒng)參與焦慮發(fā)生-焦慮緩解過程[3]，以往對于焦慮及情感障礙發(fā)病機制的研究主要集中在5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)等遞質通路。盡管目前對焦慮障礙的研究已受到重視，但苯二氮卓類、5-HT抑制劑等仍是目前主要的治療方式，存在治療效果差或復發(fā)等問題。所以，有必要深入地闡明焦慮及情感障礙發(fā)病機制，從分子角度尋找安全有效的藥物和治療方法[4]。

突觸結合蛋白1(Synaptotagmin 1，Syt1)是synaptotagmin蛋白家族的成員，在前腦、中腦以及大多數腦干和脊髓神經元中表達[5]。Syt1在突觸胞吐和其他類型的Ca2+誘導的分泌過程中充當Ca2+感受器[5]，使神經遞質的釋放與動作電位(APs)同步，既是鈣離子快速釋放的感受器，又是自發(fā)和延遲異步釋放的抑制劑[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在許多突觸中Syt1的基因缺失可以取消快速同步釋放成分，并且導致自發(fā)和異步釋放的幾倍增強[6]。Syt1、Synaptophysin和SNAP-25等突觸相關蛋白的表達水平與學習和記憶呈正相關，但與焦慮和運動活動呈負相關[7]。在人類和嚙齒動物的相關研究顯示，杏仁核是焦慮環(huán)路中的一個關鍵節(jié)點。臨床研究發(fā)現(xiàn)杏仁核的體積與焦慮水平正相關[8]，并且社交焦慮癥患者杏仁核的激活會增加[9]。此外，焦慮性刺激后Fos蛋白免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)將嚙齒動物暴露于產生焦慮的環(huán)境中杏仁核被激活[10]，并且使用藥物失活杏仁核有抗焦慮作用[11]。谷氨酸(glutamate，Glu)是人腦內最主要的興奮性神經遞質，由突觸前膜釋放，經突觸間隙與突觸后膜上的受體結合產生活化作用。Glu在大腦中的分布很廣泛，約85%的突觸是Glu能的[12]。杏仁核Glu含量升高可以導致神經元興奮性增強，進而引起焦慮水平的增加。在動物實驗中，通過阻斷NMDA受體能夠有效降低應激引起的焦慮程度。并且，應激所導致的Glu能神經系統(tǒng)功能增強可引起細胞內鈣離子濃度升高和神經毒性，進而影響相關腦區(qū)的正常功能，這也可能與某些焦慮障礙的發(fā)病有關[13]。

基因敲除(gene knockout)是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，達到阻止基因表達的作用。本研究擬采用Syt1基因敲除的雜合子(Syt1+/-)和野生型小鼠為實驗對象，通過曠場、高架十字迷宮和強迫游泳實驗來初步探究Syt1+/-小鼠的焦慮樣行為改變，分析Syt1在多個焦慮相關腦區(qū)的表達情況，并研究其杏仁核區(qū)谷氨酸的含量變化，旨在為Syt1導致焦慮樣行為及其發(fā)病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

曠場實驗設備、高架十字迷宮實驗設備、強迫游泳設備和視頻采集與存儲系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司；冰凍切片機購自德國Leica公司；超高效液相色譜儀購自美國Thermo Scientific公司；質譜儀購自美國AB SciexTM公司。Syt1抗體購自中國Proteintech公司；Alexa Fluor 594標記的驢抗兔抗體購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗動物

以基因型Synaptotagmin 1敲除(Syt1+/-)及同窩野生型(wild type，WT)雄性小鼠為研究對象。Syt1+/-小鼠由本實驗室曹濟民課題組提供，該鼠種原由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司協(xié)助建立。新生小鼠PCR基因型鑒定后使用。所有動物飼養(yǎng)于SPF級動物房。溫度為(22±1)℃，保持12 h的照明/黑暗晝夜節(jié)律，自由進食和飲水。

行為學實驗采用8周齡小鼠，分為2組：WT組(n=10)和Syt1+/-組(n=9)。免疫熒光實驗由8周齡WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只，取前額葉皮層、海馬、杏仁核、伏隔核、紋狀體和腹側被蓋區(qū)等腦組織檢測Syt1蛋白的表達情況。神經遞質檢測選取8周齡WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只取前額葉皮層、海馬和杏仁核組織檢測谷氨酸含量。所有實驗動物的飼養(yǎng)和使用嚴格遵守相關條例。實驗過程嚴格按照山西省動物倫理協(xié)會指導原則操作。

1.3 曠場實驗

將小鼠放置在一個正方體黑色塑料箱(50 cm×50 cm)中，使其自由探索5 min。使用行為學實驗系統(tǒng)記錄并進行分析小鼠總運動距離、中心區(qū)停留的時間和運動距離、中心區(qū)停留時間所占比例和外周區(qū)域運動時間。每只小鼠測試完成后清理設備，待完全干燥后進行下一只實驗。

1.4 高架十字迷宮實驗

實驗時將小鼠放在中央正方形區(qū)同一位置，面朝閉合臂，允許其自由探索迷宮5 min。采用行為學實驗系統(tǒng)分析記錄測試過程中的運動活動(開臂與閉臂中移動的距離)，以及進入開臂與閉臂的次數和在其中停留的時間。每只小鼠測試完成后清理設備，待完全干燥后進行下一只實驗。

1.5 強迫游泳實驗

被試小鼠放置在一個玻璃透明圓柱體(直徑10 cm，高35 cm)中，裝水(25 cm，25℃)5 min，軟件視頻記錄不動時間(immobility)。結束后將小鼠放回到干凈的籠子里，擦干并烘干小鼠毛發(fā)。換水清理，再進行下一只實驗。

1.6 免疫熒光染色

采用8周齡WT和Syt1+/-雄性小鼠各5只，取前額葉皮層、海馬、杏仁核、伏隔核、紋狀體和腹側被蓋區(qū)進行免疫熒光實驗。小鼠麻醉后經心內灌注0.9%生理鹽水，然后灌注4%多聚甲醛，取腦。用冰凍切片機切成30 μm厚度的切片。選取腦片，冰PBS洗滌3次，用0.3% Triton X-100在37℃滲透10 min，然后與10%驢血清在37℃孵育30 min，使用Syt1抗體(1∶200)孵育過夜。PBS洗滌3次后，Alexa Fluor 594二抗(1∶1 000)在37℃孵育90 min。顯微照片是用熒光顯微鏡分析獲得(每組5只，每只動物取3幅圖像)。使用Image J軟件計數，Graphpad Prism 8軟件統(tǒng)計分析。

1.7 神經遞質檢測

8周齡WT和Syt1+/-小鼠各5只，用于神經遞質檢測。小鼠頸椎脫臼處死后，迅速取出腦組織，冰上快速分離前額葉皮層、海馬和杏仁核，用冰PBS沖洗隨后保存于-80℃冰箱待檢測。采用液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS)方法檢測小鼠前額葉皮層、海馬及杏仁核的Glu含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 免疫熒光染色

熒光顯微鏡下，在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側被蓋區(qū)神經元細胞質內可見紅色熒光免疫反應陽性產物為Syt1蛋白。與WT組相比，各腦區(qū)Syt1+/-組Syt1陽性細胞數存在不同程度的顯著減少(圖1)。統(tǒng)計結果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前額葉皮層(P<0.01)、海馬(P< 0.01)、杏仁核(P<0.01)，伏隔核(P<0.01)，紋狀體(P<0.01)和腹側被蓋區(qū)(P<0.01)Syt1陽性細胞數顯著減少(表1)。

Fig. 1 The expressions of Syt1 in prelimbic cortex (PL), hippocampus (HIP), amygdala (AMY), accumbens nucleus (ACB), caudoputamen (CP) and ventral tegmental area (VTA) detected by immunofluorescence assay in WT mice (n=5) and Syt1+/- mice (n=5， Bars=20 μm, immunofluorescence ×40)

Tab. 1 Syt1 positive cells in different brain regions of WT and Syt1+/- mice n=5)

2.2 曠場實驗

在曠場實驗(open field, OF)中，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠在暴露于新環(huán)境時表現(xiàn)出更少的總運動距離(P<0.01，表2)。Syt1+/-小鼠在新環(huán)境中心停留的時間、中心區(qū)運動距離均明顯低于WT小鼠(P<0.01)，并且在中心區(qū)停留時間的百分比也明顯降低(P<0.01)。然而在曠場周邊，Syt1+/-小鼠比WT小鼠停留的時間更長(P<0.01)。這些數據表明，缺乏Syt1的小鼠具有高焦慮的特征。

Tab. 2 Open field test of WT mice and Syt1+/- mice

2.3 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗(elevated plus maze，EPM)中，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的“開臂進入次數”較WT小鼠顯著降低(P<0.05)，進入中心區(qū)的次數也顯著降低(P<0.05，圖2A)；開臂移動距離顯著降低(P<0.01，圖2B)；“開臂滯留時間”較WT小鼠顯著降低(P<0.01)，而“閉臂滯留時間”較WT小鼠顯著升高(P<0.01，圖2C)。圖2D，E顯示WT和Syt1+/-小鼠在實驗中的運動軌跡。總而言之，EPM測試表明Syt1+/-小鼠的焦慮水平有所升高。

Fig. 2 Syt1+/- mice showed decreased open arm entries and spent less time in open arm of EPM

2.4 強迫游泳實驗

強迫游泳實驗(forced swim test，F(xiàn)ST)中，WT小鼠的不動時間為(269.0±4.3)s，Syt1+/-小鼠的不動時間為(291.3±1.6)s。結果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的不動時間顯著增加(P<0.01)。

2.5 神經遞質檢測

結果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前額葉皮層和海馬中Glu的含量無統(tǒng)計學差異。而Syt1+/-小鼠杏仁核Glu的含量較WT小鼠顯著增加(P< 0.01，表3)。

Tab. 3 The concentrations of glutamate in the prelimbic cortex (PL)，hippocampus (HIP) and amygdala (AMY) of WT mice and Syt1+/- mice (μg/g, n=5)

3 討論

在中樞神經系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)Syt1在阿爾茨海默癥和癲癇疾病中的潛在功能[14,15]，而在焦慮、抑郁等情感障礙類疾病中未見研究。我們的研究利用多個行為學實驗探討Syt1對小鼠焦慮樣行為的影響。曠場實驗利用小鼠對新奇環(huán)境的探索心理和空曠環(huán)境的厭惡恐懼間的平衡來評價小鼠的焦慮狀態(tài)[16]，可以用于廣泛性焦慮測試[17]。Syt1+/-小鼠在曠場實驗中表現(xiàn)出在中央區(qū)域運動距離與時間的明顯降低，總運動距離有所降低，可見其自發(fā)活動有所降低，提示缺乏Syt1的小鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度和自主性降低，探究性活動能力下降，焦慮情緒增強，其趨避性的結果可以提示進一步深入研究焦慮，抑郁相關實驗[18]。在EPM實驗中，Syt1+/-小鼠表現(xiàn)出進入開臂次數減少，在開臂運動時間與運動距離降低。Syt1+/-小鼠對開臂的厭惡情緒會強于對新環(huán)境的好奇，提示小鼠處于焦慮狀態(tài)[19]。而在強迫游泳實驗中，Syt1+/-小鼠較WT小鼠不動時間延長，表明其求生欲望下降，易出現(xiàn)抑郁情緒。以上行為學實驗提示，Syt1+/-小鼠的焦慮水平，抑郁程度有所增加。

通過免疫熒光染色觀察到，Syt1在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側被蓋區(qū)均有較高的表達量。與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的Syt1陽性細胞數在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側被蓋區(qū)均有不同程度的降低，平均敲除率為67.2%。表明實驗所采用Syt1+/-小鼠可以穩(wěn)定的降低Syt1蛋白表達，符合本研究的前提和需求。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)的一部分，是產生情緒，識別情緒和調節(jié)情緒，控制學習和記憶的腦部組織。我們的結果顯示，被測腦區(qū)中杏仁核Syt1表達量較高，而在敲除鼠中其敲除比例也呈較高水平(81.3%)。這從側面證實，Syt1缺失對于小鼠焦慮行為的影響與杏仁核密切相關。

在中樞神經系統(tǒng)中，Glu是重要的興奮性神經遞質，Glu能系統(tǒng)與焦慮密切相關。而中央杏仁核Glu的增加介導焦慮樣行為，杏仁核Glu含量的增加可能與焦慮發(fā)生有關，這可能是杏仁核的高度激活促進了焦慮樣行為[20]。我們的實驗檢測了兩組小鼠多個腦區(qū)Glu的含量，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠Glu的含量在杏仁核顯著增加，而在前額葉皮層和海馬無顯著差異。因此推測，杏仁核中Syt1缺失導致神經元自發(fā)和異步釋放的增加，促進Glu水平的升高，而這可能是小鼠呈現(xiàn)出多種焦慮樣行為的潛在原因。

綜上所述，Syt1部分缺失小鼠存在較明顯的焦慮、抑郁、自主性和探索性下降等行為，其可能機制為杏仁核中Glu自發(fā)和異步釋放的增加，這對焦慮障礙的發(fā)病機制和治療提供了新的潛在靶點和研究思路。而進一步揭示Syt1在焦慮等情緒調控中的作用及其具體機制，將為相關精神類疾病的治療提供新途徑。