李樹森，肖然，孫二娜，任怡鎂，王辰元

（1.蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司，北京 101100；2.中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系，北京 100191）

益生元是指能夠通過選擇性地促進人體腸道內(nèi)某種或某幾種微生物生長或發(fā)揮其活性，且不被人體所消化的食物成分[1]。廣義的益生元包括低聚糖、植物多酚、小分子蛋白和維生素等[2]。其中水溶性低聚糖是目前研究和使用最多的益生元類型。已有研究證明攝入一定劑量的益生元可以顯著改善宿主體內(nèi)腸道環(huán)境，提升腸道益生菌的比例[3]。

除單獨使用外，益生元與特定益生菌組合可以形成合生元，其生物活性要強于單獨的益生菌或益生元[4]。合生元中的低聚糖能夠特異性地促進組合中的益生菌生長，促進其代謝產(chǎn)物分泌[5]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是目前最常用的益生菌，菊粉、低聚半乳糖、低聚果糖是最為常見的與其搭配的益生元[6,7]。除此之外，低聚木糖和低聚甘露糖雖然在合生元制劑中使用較少，但有研究發(fā)現(xiàn)其對雙歧桿菌的益生活性高于常見的其他益生元，因此對其與相應益生菌協(xié)同增效的研究也日益增多[8,9]。

以往對益生菌、益生元發(fā)酵特性的研究是通過單一菌株發(fā)酵體系來實現(xiàn)的[10]。這種方法能較好地分析二者間的作用關系，但卻缺乏腸道內(nèi)復雜環(huán)境的評價維度，無法真實模擬體內(nèi)多菌群交互作用下合生元的促腸道益生菌增殖活性。近年來，隨著體外胃腸道模擬技術的不斷發(fā)展，現(xiàn)階段對于消化道內(nèi)的化學環(huán)境模擬已能夠實現(xiàn)，而對于消化道內(nèi)動力學系統(tǒng)的模擬還處于摸索階段[11]。Abbeele等人通過利用成人健康糞便在體外建立了結腸環(huán)境下的菌群模擬體系，研究比較了阿拉伯木糖和菊粉對菌群的調(diào)節(jié)作用[12]。該模型可以較好地反映多菌群環(huán)境下益生元對腸道益生菌的作用效果。但該體系與傳統(tǒng)合生元篩選方法是否存在結果上的差異還缺乏理論研究[13]。本研究通過建立結腸模擬發(fā)酵體系，分別比較了乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）發(fā)酵下和結腸模擬菌群微生態(tài)體系下5種低聚糖對益生菌的益生活性，以期通過本研究為合生元篩選的體外模型體系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌MN-Gup（Bifidobacteriumanimalis subsp.lactisMN-Gup），由蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司提供；低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖和菊粉，純度在85%～90%，購自保齡寶生物股份公司；低聚甘露糖，購自西安源森生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq，購自日本Takara公司；細菌基因組提取試劑盒（DP302），購自天根生化科技（北京）有限責任公司；菌群定量標準質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

LightCycler480實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；SpectraMax多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司。

1.2 益生菌增殖活性的測定

將保存的乳雙歧桿菌MN-Gup菌株在無菌條件下接種到MRS完全培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)活化24h，然后再接種到MRS完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)活化24h，重復以上步驟活化3代。待菌種充分恢復活力后，取含有10mL MRS培養(yǎng)基的試管接種MN-Gup活化菌液，接種后使樣品中菌液濃度為1×108cfu/mL，然后分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露糖和菊粉，設定添加1.5%葡萄糖和無碳源培養(yǎng)基為對照組，厭氧培養(yǎng)24h。參考Palframan等人的方法[14]，用益生指數(shù)（Prebiotic index，PI）來表示每種益生元的益生活性，PI計算公式如下：

1.3 腸道微生態(tài)體外模擬模型的建立

參考石夢玄等人的方法[15]，按磷酸氫二鉀3.5g/L、磷酸二氫鉀10.9g/L、碳酸氫鈉2g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨2g/L、黏蛋白1g/L、半胱氨酸0.5g/L、吐溫-80 2mL/L配制結腸模擬發(fā)酵液，按質(zhì)量比分別添加1.5%的低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、低聚果糖、低聚甘露糖和葡萄糖，混勻后滅菌備用。

取3名成年人糞便稱重，混合后按1:5質(zhì)量比用生理鹽水進行稀釋，漩渦震蕩。經(jīng)500g離心5min去除大的沉淀物，得菌群懸液。按8:1:1體積比依次添加結腸發(fā)酵液、菌群懸液和MN-Gup菌體懸液，使每組MNGup終濃度為1×108cfu/mL，然后以搖床37℃、轉速90厭氧培養(yǎng)8h。按DNA提取試劑盒操作步驟提取發(fā)酵液總DNA，并測定其DNA濃度。

1.4 腸道菌群增殖測定

參照Abbeele等人的方法，按表1所示設計引物[13]。取合成的擬桿菌屬（Bacteroidetes）、厚壁菌屬（Firmicutes）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp）和阿克曼菌屬（Akkermansiamuciniphila）的標準質(zhì)粒模板，按10倍比例稀釋為8個點，按1μL模板、上下游引物0.5μL、8μL水、10μLSYBR酶配制成20μL/孔的反應體系。擴增條件：95℃ 10min，60℃退火30s，72℃擴增30s，40個循環(huán)，95℃熱變性15s，溶解曲線溫度95℃。以CQ值為縱坐標、模板DNA濃度的Lg值為橫坐標，建立標準曲線。相同條件下，根據(jù)下列公式計算樣品中目標菌群的比例。

表1 腸道菌群菌屬PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，單因素方差分析（ANOVA）用于比較不同組之間的差異。結果以平均值±標準差表示，a、b、c、d表示不同組之間的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的影響

如圖1所示，本研究比較了不同益生元促乳雙歧桿菌MN-Gup增殖活性的差異，結果表明低聚半乳糖具有更顯著的促增殖活性，其PI值為2.18±0.19，其次為低聚木糖（1.68±0.15），低聚果糖和低聚甘露糖促增殖活性最低。PI可以反映不同益生元被特定菌株選擇性利用的程度，從該結果看乳雙歧桿菌MN-Gup對低聚半乳糖利用率更高，更適合作為其益生元搭配使用。

圖1 不同益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup的益生指數(shù)

2.2 不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道益生菌生長的影響

菌群中除雙歧桿菌外，乳桿菌屬也是主要的腸道有益菌[1]。如圖2所示，通過比較乳雙歧桿菌MN-Gup搭配不同益生元組合對糞便菌群中益生菌的影響發(fā)現(xiàn)，低聚木糖組合促雙岐作用顯著高于其他益生元，其對雙歧桿菌增殖的促進效果是低聚半乳糖的6倍。即在體外模擬腸道微生態(tài)體系下，低聚木糖更適宜作為MN-Gup的合生元來調(diào)節(jié)腸道雙歧桿菌，而低聚半乳糖組則顯著提高了乳桿菌比例。

圖2 不同合生元組合對腸道益生菌比例的影響

本試驗比較單一益生元對乳雙歧桿菌MN-Gup的益生效果時發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖促增殖最強，而在菌群中低聚木糖對雙岐菌屬的益生效果似乎更顯著。這可能是因為菌群中其他種類的雙歧桿菌對低聚木糖的利用率更高，具體原因需要進一步分析。這也從側面反映出了多菌群體系下研究益生元的益生功能與單菌株發(fā)酵體系是可能存在差異的，相比較而言腸道微生態(tài)模擬體系可能更接近合生元在體內(nèi)作用時的真實環(huán)境。

2.3 不同乳雙歧桿菌合生元組合對腸道厚壁/擬桿菌群比例、阿克曼菌（AKK）生長的影響

阿克曼菌被視為潛在的益生菌，研究表明其對機體慢性炎癥改善、肥胖和糖尿病的改善具有積極作用[16]。如圖3所示，各合生元組對AKK菌群占比影響不大，表明這5種低聚糖組合并不會顯著影響AKK菌群比例。與葡萄糖對照組相比，各合生元組均顯著增加了厚壁/擬桿菌群的比值，其中菊粉組效果最為顯著。

厚壁菌屬和擬桿菌屬兩者之和約占整個腸道菌群的90%，二者平衡對于腸道健康尤為重要[17]。當厚壁菌屬占比較大時，機體容易發(fā)生肥胖；而擬桿菌屬占比增加則與腸炎和IBD的發(fā)生率呈正相關[18]。從圖3結果上看，各益生元組合均能夠提升厚壁/擬桿菌群比值，而菊粉組能顯著提升厚壁/擬桿菌群比例。目前還缺乏正常人群體內(nèi)厚壁/擬桿菌群比值與機體健康的關系，對于正常人來說二者比值高低并不能直接判斷菌群是否健康，需要結合其他機體指標和特征進行甄別。

圖3 不同合生元組合對腸道AKK菌群和厚壁/擬桿菌群比例的影響

3 結論

本研究設計了基于體外腸道微生態(tài)模擬方法的益生元篩選方法，通過提取成年人糞便菌群后進行體外發(fā)酵，研究比較了不同合生元組合對腸道有益菌和重要菌群的調(diào)控作用，并與單菌株發(fā)酵體系的結果進行比較。結果表明低聚木糖與乳雙歧桿菌MN-Gup組合后可顯著提升菌群中雙歧桿菌的比例，而單菌株發(fā)酵體系下低聚半乳糖更能促進MN-Gup的生長。各合生元組合對阿克曼菌的比例并無顯著影響。本研究結果證明了體外腸道微生態(tài)模擬體系作為合生元篩選的新方法，可以從更多維度對合生元進行篩選，后續(xù)可根據(jù)不同目的結合菌群特點，建立不同類型人群的體外篩選模式。