李 欣 孫靖輝 王春梅 陳建光 敬 舒 李 賀 （北華大學藥學院，吉林 132013）

衰老是生物體不可避免的自發(fā)現(xiàn)象，伴有組織和器官的逐漸退化。隨著全球人口老齡化程度日趨增加，對抗衰老藥物及保健食品的研究已成為熱點［1］。關于衰老發(fā)生的機制，二十世紀六十年代，HARMAN 提出了自由基衰老學說，他認為當機體內(nèi)產(chǎn)生自由基后，會對機體細胞和組織造成持續(xù)傷害，導致機體的衰老［2］。同期，美國病理學家WOLFORD［3-4］首次提出了免疫衰老的學說，該學說認為機體的衰老是由機體免疫功能的衰退導致的，即免疫系統(tǒng)從根本上決定了機體的衰老。在衰老動物模型方面，有研究表明，D-gal 誘導的衰老動物和自然衰老動物具有較多的相似特征，已被廣泛應用于抗衰老相關藥物的研究［5-7］。胸腺作為機體內(nèi)重要的中樞免疫器官，其功能狀態(tài)對機體的免疫功能有直接的影響，而D-gal 會使胸腺發(fā)生退行性變化，出現(xiàn)胸腺組織萎縮，功能減弱，免疫功能衰退，進而導致免疫衰老［8-11］。

傳統(tǒng)中藥華中五味子（schisandra sphenanthera rehd.et Wils）已作為可用于保健食品的中藥，在抗氧化、保護肝臟損傷等方面具有諸多研究和應用［12-16］。安五脂素是華中五味子木脂素標志性單體化合物成分，然而，目前關于其功效的研究較少［17-19］。前期研究發(fā)現(xiàn)安五脂素對D-gal 誘導的衰老小鼠肝臟組織、腦組織和脾臟組織具有顯著的保護作用，有很強的抗衰老作用，但其對胸腺組織的影響目前尚未見報道［20-22］。因此，本研究旨在明確安五脂素對衰老小鼠胸腺組織的保護作用，并探討其可能的作用機制，為研究和開發(fā)抗衰老及改善免疫功能的藥物和保健食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，6~8 周齡，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（吉）：2017-0005。

1.1.2 試劑 安五脂素購自四川省成都普菲德生物技術有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）購自山東濰坊力特復合材料有限公司；D-gal 購自美國Sigma 公司；IL-2 試劑盒和 IFN-γ 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司；SOD試劑盒和MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ECL 顯色液購自碧云天生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 將80 只健康ICR小鼠隨機分為5組，空白對照組（灌胃羧甲基纖維素鈉，生理鹽水皮下注射，10 ml/kg），模型組（灌胃羧甲基纖維素鈉，220 mg/kg D-gal 皮下注射，10 ml/kg）和安五脂素低、中、高劑量組（分別灌胃1、2和4 mg/kg安五脂素，并皮下注射 220 mg/kg D-gal，10 ml/kg），每組16 只，灌胃和皮下注射1 次/d，持續(xù)給藥42 d。每天觀察并記錄各組小鼠的身體狀況，每隔3 d 稱1次體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 安五脂素對小鼠胸腺指數(shù)的影響 1.2.1所述的每組小鼠連續(xù)給藥，42 d后稱取體質(zhì)量，在末次給藥后30 min 后處死小鼠，取出胸腺組織，去除周圍組織，經(jīng)生理鹽水洗滌后用濾紙吸干，稱取胸腺組織重量并計算胸腺指數(shù)，根據(jù)以下公式：胸腺指數(shù)（%）=胸腺重量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.3 安五脂素對小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影響 1.2.1 所述的每組小鼠連續(xù)灌胃42 d，末次給藥后30 min 后，取外周血標本，3 500 r/min 離心10 min，收集上清，通過ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 的含量。具體方法參照各試劑盒說明書。

1.2.4 安五脂素對小鼠胸腺組織病理學的影響按1.2.1所述的每組小鼠隨機選取3只，同1.2.2方法取出胸腺組織，將其置于10%的中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切成5~10 μm厚的切片。切片進行HE 染色，在光學顯微鏡下進行常規(guī)組織學檢查。

1.2.5 安五脂素對小鼠胸腺組織中SOD 活力和MDA 含量的影響 按照1.2.2 所述方法分離出小鼠胸腺組織，將其用生理鹽水制為10%的胸腺勻漿。通過WST-1（水溶性四氮唑）法檢測SOD 活性，通過TBA（硫代巴比妥酸）法檢測MDA 含量，具體方法參照各試劑盒說明書進行。

1.2.6 安五脂素對小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 及 Bax 蛋白表達的影響 每組小鼠末次給藥30 min 后，按照1.2.2 所述方法分離出小鼠胸腺組織，按比例加入裂解液，冰上裂解1 h，高速離心（10 min，12 000 r/min），吸取上清液，測定胸腺組織蛋白濃度，以10%電泳凝膠電泳分離Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2 和 Bax 蛋白。電轉(zhuǎn)移 2 h至聚丙二氟乙烯膜，Tris 緩沖液（TBS-T）漂洗5 min，在含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h。室溫孵育后棄去封閉液，分別加入一抗 Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、Caspeas3（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000），4 ℃溫育過夜后，TBS-T洗5 次×5 min。加入二抗（1∶5 000）溫育 2 h，TBS-T 洗5次×5 min，最后加入顯色液ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。小鼠胸腺指數(shù)，血清中IL-2 和IFN-γ 含量，胸腺組織中的 SOD 活力、MDA 含量及 Western blot 的實驗數(shù)據(jù)用表示，每組中的樣本數(shù)用n表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 安五脂素對小鼠胸腺指數(shù)的影響 結果如圖1所示，與CON 組相比，MOD 組小鼠胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與MOD 組比較，安五脂素中劑量組和高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。安五脂素各劑量組小鼠胸腺指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 安五脂素對小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量的影響 結果如圖2 所示，與CON 組比較，MOD 組小鼠血清中IL-2 和IFN-γ 含量顯著減少（P＜0.01），給予安五脂素后各劑量組小鼠血清中IL-2 含量均顯著升高（P＜0.01），IFN-γ 含量在安五脂素低劑量組和高劑量組顯著升高（P＜0.05）。安五脂素各劑量組兩兩比較，IL-2 和IFN-γ 含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 安五脂素對小鼠血清中IL-2和IFN-γ含量的影響Fig.2 Effects of Anwulignan on serum IL-2 and IFN-γ contents in serum of mice

2.3 安五脂素對小鼠胸腺組織病理變化的影響為了評價安五脂素對胸腺組織形態(tài)學的影響，對各組小鼠胸腺進行HE 染色，并在光學顯微鏡下觀察胸腺組織形態(tài)的變化。實驗結果如圖3 所示，在CON 組中，皮質(zhì)髓質(zhì)分界清晰，胸腺細胞密集分布，沒有巨噬細胞，胸腺小體分散分布，大小不等，可見少數(shù)胸腺上皮細胞；MOD 組小鼠的胸腺皮質(zhì)顏色淡染，胸腺細胞數(shù)目減少，且在皮質(zhì)深層可觀察到巨噬細胞吞噬正常胸腺細胞，髓質(zhì)中胸腺小體數(shù)目減少；安五脂素低劑量組與MOD 組相比，胸腺細胞和胸腺小體數(shù)目明顯增多，且吞噬現(xiàn)象得到明顯緩解；安五脂素中劑量組與MOD 組相比，上述現(xiàn)象有一定程度的緩解，但效果不如安五脂素低劑量組明顯；安五脂素高劑量組與MOD 組相比，胸腺細胞和胸腺小體數(shù)目減少，吞噬現(xiàn)象緩解，胸腺上皮細胞增生。

圖3 安五脂素對小鼠胸腺組織病理學改變的影響（×200）Fig.3 Effects of Anwulignan on histopathology changes in thymus tissue of mice（×200）

2.4 安五脂素對小鼠胸腺組織中SOD 活力及MDA含量的影響 結果如圖4 所示，與CON 組相比，MOD 組小鼠胸腺組織中SOD 活力顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）。給予安五脂素后，中劑量組和高劑量組胸腺組織中SOD 活力顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。安五脂素三個劑量組組間比較顯示：高劑量組胸腺中MDA含量與低劑量組相比顯著降低（P＜0.01），其他安五脂素劑量組對SOD 活力的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 安五脂素對小鼠胸腺組織中SOD活力和MDA含量的影響Fig.4 Effects of anwulignan on activity of SOD and content of MDA in thymus tissue of mice

2.5 安五脂素對小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3、Bcl2和Bax蛋白表達的影響 本研究應用Western blot 方法對各組小鼠胸腺組織的相關蛋白表達進行觀察。結果如圖5A、C，與CON 組比較，MOD 組Nrf2 和HO-1 的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），Keap1 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；給予安五脂素后，各劑量組Nrf2、HO-1 的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Keap1的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。與安五脂素低劑量組相比，安五脂素中劑量組胸腺中Nrf2、HO-1和Caspase3 的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；安五脂素高劑量組胸腺中Nrf2 的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。安五脂素中劑量組及高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖5 安五脂素對小鼠胸腺組織中Keap1、Nrf2、HO-1、Caspase3，Bcl2和Bax蛋白表達的影響Fig.5 Effects of Anwulignan on Keap1，Nrf2，HO-1，Caspase3，Bcl2，and Bax protein of mice

如圖 5B、D 所示，與 CON 組比較，MOD 組 Bax 和Caspase3 的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl2 的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。給予安五脂素后，各劑量組Caspase3 的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Bax 在安五脂素低劑量組和中劑量組的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而Bcl-2 在安五脂素中劑量組和高劑量組的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與安五脂素中劑量組相比，安五脂素高劑量組小鼠胸腺中Bcl2和Caspase3的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；安五脂素低劑量組胸腺中Caspase3蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其余安五脂素給藥組兩兩比較對上述指標的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

近年來，現(xiàn)代醫(yī)學通過從大體結構到微觀結構，從整體到細胞甚至基因?qū)λダ系陌l(fā)生機理進行了一系列研究，已形成了多種理論學說，其中衰老的自由基學說和免疫衰老學說是衰老過程中具有代表性的學說［23-24］。自由基衰老學說認為自由基是引起氧化應激的重要因素，大量的自由基在體內(nèi)的積累破壞了機體器官的結構和功能，造成了機體的損傷和衰老［25］。免疫衰老學說認為隨著衰老的發(fā)展，胸腺等免疫器官逐漸萎縮，免疫細胞發(fā)生退化性改變，導致免疫功能減退，免疫相關疾病發(fā)病率增多［1，22］。D-gal 是一種還原性糖，是構建衰老模型的經(jīng)典方法。過量的D-gal會導致機體自由基增多，引起氧化應激反應，從而造成與自然衰老相似的機體損傷，包括胸腺等免疫器官在內(nèi)的機體多個器官的損傷［26-28］。本研究連續(xù)皮下注射D-gal 后，小鼠胸腺指數(shù)顯著降低，胸腺結構受到損傷，這與既往研究報道一致［29-32］。而預防性給予安五脂素后，D-gal誘導的衰老小鼠胸腺萎縮及胸腺結構損傷被顯著改善，具有顯著的胸腺保護功能。IL-2 和IFN-γ 是由活化的淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，體現(xiàn)出輔助性T 細胞的主要生物學效應，是機體重要的免疫功能指標［33-34］。在免疫衰老中，以T 細胞功能受損最為明顯，IL-2 和IFN-γ 隨年齡的增長產(chǎn)生減少，目前被認為是免疫老化的主要分子基礎［35-36］。本研究結果顯示，在給予安五脂素后，小鼠血清中IL-2 和IFN-γ含量增多，提示安五脂素可能通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)IL-2和IFN-γ的水平，進而改善其免疫功能。

SOD 是機體最主要的抗氧化酶，在生物氧化過程中能夠有效地清除自由基［37-39］。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，是反應自由基所致的機體損傷的重要指標，其含量隨著機體的衰老程度而升高［40-41］。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)，安五脂素能夠明顯提高D-gal誘導衰老小鼠血清、肝臟組織、腦組織和脾臟組織中SOD活性，降低MDA的含量［20-22］。本實驗對D-gal處理小鼠胸腺組織的檢測結果與上述結果完全一致，進一步證實安五脂素在D-gal 誘導衰老小鼠中表現(xiàn)出顯著的抗氧化作用，該作用可能是安五脂素保護胸腺損傷的主要原因之一。

Nrf2/ARE 通路是最為重要的內(nèi)源性抗氧化應激調(diào)節(jié)通路，當細胞損傷時，Nrf2上調(diào)并激活下游抗氧化酶，增強細胞對氧化應激的耐受能力［42-44］。研究表明，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)Nrf2 的活性，可有效對抗氧化應激損傷，進而減輕機體免疫器官損傷［45-46］。Keap1 是Nrf2 負調(diào)控因子，HO-1 是體內(nèi)較強的抗氧化劑，受 Nrf2 的調(diào)控［47］。本研究結果顯示，經(jīng) D-gal處理后，小鼠胸腺組織Keap1表達水平顯著升高，而Nrf2 及HO-1 表達水平顯著降低。而給予安五脂素能夠下調(diào)D-gal 處理的衰老小鼠胸腺組織中Keap1蛋白的表達水平，而上調(diào)Nrf2，HO-1 蛋白的表達水平，提示安五脂素可能通過激活Nrf2/ARE 信號通路而發(fā)揮抗氧化作用，進而改善D-gal對小鼠胸腺組織的損傷。

大量氧自由基可以通過脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)及酶變性和DNA 損傷等途徑導致細胞凋亡，而組織細胞凋亡是機體衰老的主要特征之一［48-49］。免疫細胞凋亡與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)密切相關，是評價免疫功能變化的重要指標［50］。作為細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，以Bcl2 為代表的抗凋亡蛋白以及以Bax 為代表的促凋亡蛋白的表達水平高低決定細胞凋亡發(fā)生的走向［51-53］。研究表明，凋亡最終由Caspase 家族完成，而Caspase3 處于Caspase 級聯(lián)反應的中心位置，是最重要的細胞凋亡調(diào)控蛋白［54］。有研究表明，Nrf2 可以通過與Bcl2 基因相關反應元件結合，調(diào)控Bcl2 表達和細胞凋亡過程。而通過使用Nrf2 抑制劑，可以使Bcl2 表達減少，Bax 表達增加，促進凋亡的發(fā)生［55-56］。本研究結果顯示，D-gal 處理后，小鼠胸腺組織Bax 及Caspase3 表達水平顯著升高，而Bcl2 表達水平顯著降低。給予安五脂素能夠上調(diào)D-gal 處理小鼠胸腺組織中Bcl2 的表達水平，下調(diào)Bax 及Caspase3 的表達水平，提示安五脂素可能通過抑制D-gal 處理小鼠胸腺組織的細胞凋亡進而發(fā)揮相關的保護作用，該抗凋亡作用可能與安五脂素激活Nrf2，進而調(diào)控Bcl2 的表達有關，其相關機制將在后續(xù)研究中進行深入探討。

本研究選擇1、2及4 mg/kg 3個劑量觀察安五脂素對D-gal 處理小鼠胸腺損傷的保護作用。結果顯示，高劑量組安五脂素對各檢測指標的影響差異均具有統(tǒng)計學意義。通過3 個劑量組組間比較，不同劑量組小鼠胸腺 MDA 含量、Nrf2、HO-1 及 Bcl2、Caspase3表達水平差異有統(tǒng)計學意義。提示安五脂素對D-gal 誘導小鼠胸腺損傷的保護作用可能與劑量大小有關。但值得注意的是，安五脂素對小鼠胸腺指數(shù)、IL-2 和 IFN-γ 含量、SOD 活力等指標的影響在3 個劑量組組間比較時差異無統(tǒng)計學意義，這可能由于安五脂素針對不同指標的劑量效應關系不同所致，也可能與實驗本身的靈敏度不同有關，其具體的劑量效應關系及相關機制尚需進一步深入探討。

綜上，本研究證實了安五脂素對D-gal致衰老小鼠的胸腺組織具有保護作用，該作用可能與安五脂素激活Nrf2/ARE 通路，進而在衰老小鼠胸腺組織中發(fā)揮的抗氧化及抗凋亡作用有關。