孫 晴， 陳 平， 李再興， 陳曉飛， 張婉玉， 邢 茜， 祁浩杰

（1.天俱時工程科技集團有限公司， 河北 石家莊 050000；2.河北科技大學， 河北 石家莊 050091)

0 引言

隨著我國工業(yè)化進程快速推進， 廢水造成的污染也日益嚴峻[1]。 其中高鹽廢水占廢水總排放量的5%以上，并且以每年2%的速度快速上升[2]。 高鹽廢水是指總鹽(以NaCl 計)質(zhì)量分數(shù)大于或等于1%的廢水，其可使水體富營養(yǎng)化和土地鹽堿化。此類廢水主要來源于石油、造紙、印染、化工、制藥、食品加工等生產(chǎn)領(lǐng)域， 其中含有大量有機污染物和高濃度無機鹽[3-5]。 高鹽、高濃度廢水成分復雜、毒性大、難降解，其治理方法是制約工業(yè)發(fā)展的瓶頸問題[6]。

目前， 處理高鹽度廢水方法主要包括電化學氧化法、離子交換法、膜分離法、加熱蒸發(fā)法和生物處理法[7-9]。化學法和物理法有一定的局限性，如運行成本高，處理效果有限，通常只在特定條件下應用，無法大規(guī)模工業(yè)化應用；生物處理法無需提前除鹽，也無需稀釋進水，可直接用于含鹽廢水的處理。該方法可減少前期的資金投入和后期的運營成本， 而且無二次污染、節(jié)約水資源，是處理廢水的首選方法，也是近年來的環(huán)保熱點[10-11]。但鹽度過高容易破壞微生物細胞和胞內(nèi)生物酶，抑制微生物的生長和代謝，無法達到理想的降解效果[12]。 因此，有研究人員將耐鹽菌投加到活性污泥中或者生物反應器內(nèi)進行應用。李坤等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在MBBR 中接入耐鹽菌劑，不僅提高了COD 去除率， 生物膜處理體系也更加穩(wěn)定，能夠抵抗較高鹽度范圍波動。 代鵬飛等[14]將優(yōu)勢菌投加到SBR 中發(fā)現(xiàn)，COD 平均去除率為72.8%，比未投加微生物組提高了22%。 廖焰焰等[15]從處理醫(yī)藥廢水的活性污泥中馴化、 分離出一株高耐鹽菌株發(fā)現(xiàn)，該菌株可處理高鹽醫(yī)藥廢水，CODcr 去除率可達73.0%。由上可知，耐鹽菌的加入可改善鹽度對微生物的抑制作用， 大幅提升高鹽廢水中有機污染物的降解效率。 高效耐鹽菌在高鹽廢水處理中具有巨大的應用潛力[16]。

從某制藥廠二沉池中取出活性污泥，通過馴化、分離得到3 株耐鹽菌，最終篩選出一株高耐鹽菌。對該菌株進行形態(tài)學、 生理生化特性和16S rDNA 分析進行菌株鑒定， 研究不同環(huán)境因素對菌株降解性能的影響，并在實際高鹽廢水中進行應用驗證，以期為生物法處理難降解高鹽廢水提供高效菌種資源和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、全培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基均參照文獻《微生物學實驗》[17]。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于細菌培養(yǎng)；全培養(yǎng)基用于細菌富集；選擇性培養(yǎng)基用于細菌性能測定。

1.2 菌株篩選

馴化：實驗搭建反應器模擬MBBR 工藝，模擬廢水中（m(C)∶m(N)∶m(P)=100 ∶5 ∶1）底部曝氣好氧運行。根據(jù)COD 去除率和馴化情況逐步提高鹽濃度， 培養(yǎng)至填料掛膜情況良好， 鏡檢可見明顯菌膠團，即得到定向馴化的耐鹽菌群[18-20]。

篩選：用混勻器處理馴化后的污泥液，取上清液稀釋后涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，在溫度為30 ℃下培養(yǎng)至有明顯菌落。 挑取不同單菌落多次劃線培養(yǎng)至得到純化細菌。 梯度配制NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0 ～15%的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將純化菌株制成菌懸液，稀釋至合適倍數(shù)后涂布。 在30 ℃恒溫下培養(yǎng)72 h，用菌落數(shù)量表示菌株生長情況[21]。

1.3 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)特征和生理生化特性。將菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其菌落特征和菌體形態(tài)。參照《微生物技術(shù)》進行生理生化特性實驗[21]。

（2）菌株16s rDNA 基因序列分析。用DNA 試劑盒提取細菌基因組DNA。 使用16S rDNA 通用引物進 行 PCR 擴增。 擴增引物為27F （5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3） 和 1492R （5 -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3）， 擴增反應體系為50 μL。將擴增產(chǎn)物送上海派森諾基因科技有限公司完成16S rDNA 序列測定[22]。

1.4 菌株生長特性研究

為探究環(huán)境因素對復篩菌株的影響， 按照將菌懸液稀釋至108 CFU/mL 接入選擇性培養(yǎng)基， 分別設(shè)置好溫度、pH 值、接種量和鹽度梯度，在恒溫培養(yǎng)振蕩器以轉(zhuǎn)速為190 r/min 培養(yǎng)72 h，每24 h 取樣1次，分別測定OD600值和COD 濃度[23]。并在最適宜單因素條件下，測定細菌生長趨勢[17]。

1.5 菌株降解高鹽廢水的實際應用

從細菌斜面上挑取一環(huán)菌苔接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，200 r/min 搖床培養(yǎng)過夜。 將得到的培養(yǎng)液，稀釋至合適的接種濃度（108 CFU/mL）轉(zhuǎn)接到全培養(yǎng)基中。 180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h 得到放大培養(yǎng)的菌液。

菌株降解高鹽廢水實驗裝置示意見圖1。由圖1可以看出，該裝置采用有機玻璃反應器，有效容積為3 L。 首先將某制藥廠一車間和二車間的高鹽廢水分別加入1 號、2 號反應器中，調(diào)節(jié)pH 值至設(shè)定值，開啟曝氣泵，將DO 質(zhì)量濃度控制在4 ～5 mg/L。 再將體積分數(shù)為5%菌液接入1 號、2 號反應器中， 每隔24 h 測定1 次COD 值。 同時，以普通活性污泥處理一車間和二車間的高鹽廢水作為對照實驗，在3 號、4 號反應器中進行。

圖1 降解高鹽廢水實驗裝置示意

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

污泥馴化啟動初期， 測得NaCl 質(zhì)量濃度為4 224 mg/L，COD 質(zhì)量濃度為800 mg/L。 運行60 d后，NaCl 質(zhì)量濃度達到40 000 mg/L，進水COD 質(zhì)量濃度為2 000 mg/L，去除率穩(wěn)定在82.5%以上。 填料掛膜情況良好，鏡檢菌膠團明顯，得到定向馴化的耐鹽菌群。

經(jīng)過分離純化得到3 株細菌，分別命名為M01，M02，M03。耐鹽性測定實驗結(jié)果見表1。由表1 可以看出，菌株M02 在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0 ～12%的培養(yǎng)基上均能生長，說明該菌株具有耐高鹽能力，對鹽度有較寬的耐受范圍。 微生物的耐鹽能力是決定其在高鹽廢水中存活與繁殖的決定性因素，

表1 耐鹽性測定實驗結(jié)果%

2.2 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)特征和生理生化特性。 菌株M02的形態(tài)特征見圖2。 由圖2 可以看出，M02 菌落呈圓形邊緣完整，表面有光澤、光滑、濕潤、易挑起，不透明，呈白色，側(cè)面觀察為扁平狀，48 h 內(nèi)菌落直徑為1.67 ～1.90 mm。 在1 000 倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)呈短棒狀，兩端較圓滑，大小約為（2 ～4）μm× （3 ～6）μm。

圖2 菌株M02 的形態(tài)特征

菌株M02 生理生化特性見表2。

表2 菌株M02 的生理生化特性

（2）菌株16S rDNA 測序。菌株M02 PCR 電泳圖像見圖3。

圖3 PCR 產(chǎn)物電泳圖像

將測序得到的序列結(jié)果用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。 由圖4 可以看出，M02 核苷酸序列與Stenotrophomonas pavanii 的同源性達到98%，2種菌株親緣關(guān)系接近。 但本菌株的形態(tài)學特征和理化性質(zhì)與已經(jīng)報道的Stenotrophomonas pavanii 存在一定差異[24]，故鑒定為Stenotrophomonas pavanii 屬的一株潛在新菌， 命名為Stenotrophomonas pavanii M02， 于2021年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCC No.22898。

圖4 菌株M02 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株生長特性研究

溫度對菌株M02 影響情況見圖5。 由圖5 可以看出，當培養(yǎng)溫度為10 ℃時，菌株生長緩慢。隨著溫度升高， 菌株生長繁殖速度迅速提升，COD 去除率隨之升高； 當溫度升至30 ℃時， 細菌增長量最大，COD 最終去除率可達90.9%；當溫度繼續(xù)升至40 ℃時， 細菌生長速度明顯減緩，COD 最終去除率也降至63.3%。 說明溫度可顯著影響細菌的合成代謝，當溫度低時，細菌的生長和生化反應速率變慢。 溫度每升高10 ℃，生化反應速率增加一倍[25]。 但溫度不可能無限升高， 因為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)對溫度極為敏感，過高溫度將造成不可逆破壞，致使細菌死亡。 因此，確定菌株最適宜生長溫度為30 ℃。

圖5 溫度對菌株M02 的影響

pH 值對菌株M02 影響情況見圖6。由圖6 可以看出，在偏酸性環(huán)境內(nèi)細菌增量較低；在中性偏堿性環(huán)境內(nèi)細菌增量明顯變大， 當pH 值為7 ～8 時，COD 最終去除率均達到91%以上；在堿性環(huán)境內(nèi)細菌生長速度再次減緩， 當pH 值分別為9，10 時，COD 去除率分別降低為85%和78%。 培養(yǎng)環(huán)境的pH 值可引起細胞膜電荷的變化，細胞膜電位改變不僅影響細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收還改變了微生物體內(nèi)各種生化酶的活性。細菌的生長受到抑制，去除率也隨之降低。因此，為保證細菌生長且具有較高的降解潛力，確定最適宜培養(yǎng)pH 值為7 ～8。

圖6 pH 值對菌株M02 的影響

接種量對菌株M02 影響情況見圖7。 由圖7 可以看出， 在培養(yǎng)初期， 接種量超過7%以上的OD600值增長速度明顯高于其他對照組。 隨著培養(yǎng)時間增長，接種量分別為10%和15%的OD600值逐漸減小，COD 去除率持續(xù)降低； 接種量為2%～7%的OD600值和COD 去除率穩(wěn)定增長，在48 h 時COD 去除率分別為62.9%，86.2%，92.2%。 由此說明接種量過小停滯期延長；增大接種量，在前期可提高細菌生長速率，但隨著培養(yǎng)時間延長，單位細菌可利用的基質(zhì)和溶解氧相應減少出現(xiàn)菌體自溶，且菌體破裂后的胞內(nèi)物使COD 濃度持續(xù)升高。 故在特定范圍內(nèi)，接種量越大去除效果越好。 因此，確定最適接種量為7%。

圖7 接種量對菌株M02 的影響

鹽度對菌株M02 影響情況見圖8。 由圖8 可以看出， 在不同鹽度環(huán)境下，COD 去除率有著顯著差別。 當NaCl 的質(zhì)量分數(shù)為1%～4%時，細菌快速進入對數(shù)期，降解性能強，COD 最終去除率超過90%。隨著鹽度增加，菌株適應期延長，經(jīng)過調(diào)整后繼續(xù)生長， 但去除率明顯降低。 NaCl 的質(zhì)量分數(shù)為1%～12%時，菌株M02 均可生長且有降解性能，表明細菌耐鹽范圍廣。在低鹽度時，降解性能隨著鹽度的增加而增大； 當NaCl 的質(zhì)量分數(shù)增至7%以上時，高鹽濃度抑制了降解酶活性從而影響細菌的新陳代謝。 同時，在高滲透壓的脅迫下細胞逐漸脫水，細胞質(zhì)壁分離死亡。 因此，確定最適宜NaCl 的質(zhì)量分數(shù)為1%～4%。

圖8 NaCl 濃度對菌株M02 的影響

最適單因素條件下，細菌生長趨勢見圖9。 由圖9 可以看出， 菌株M02 在2 h 內(nèi)迅速進入對數(shù)期細菌量快速增長，在20 ～96 h 內(nèi)為穩(wěn)定期，細菌量保持在3.16×107～3.37×107CFU/mL。 該細菌延遲期短、生長迅速，對數(shù)生長期與穩(wěn)定期相對長，在處理廢水時可快速發(fā)揮作用， 持續(xù)且穩(wěn)定地消耗有機污染物[26]。

圖9 菌株M02 生長曲線

2.4 菌株降解高鹽廢水的實際應用

制藥廠2 種廢水的檢測結(jié)果見表3。 圖1 實驗裝置中的1 號、3 號反應器內(nèi)為一車間高鹽廢水，2號、4 號反應器內(nèi)為二車間高鹽廢水。其中1 號、2 號反應器按照2.3 生長特性研究得到培養(yǎng)條件， 將培養(yǎng)溫度控制在30 ℃， 廢水pH 值調(diào)節(jié)至7.5， 菌株M02 按照體積分數(shù)為7%的接種量分別接入2 個反應器內(nèi)，曝氣培養(yǎng)運行72 h。3 號、4 號反應器按照活性污泥法曝氣培養(yǎng)運行72 h。

表3 高鹽廢水檢測結(jié)果mg·L-1

2 種廢水用細菌M02 和活性污泥法處理的效果對比情況見圖10。 由圖10 可以看出，一車間廢水用菌株M02 處理時，24 h 的COD 去除率為55.3%，48 h 達到最大值92.0%， 而活性污泥法對COD 最大去除率僅為57.8%； 二車間廢水用菌株M02 處理時，COD 去除率在72 h 內(nèi)達到最大值93.8%，而活性污泥法對COD 最大去除率僅為33.9%。 2 種廢水均為高鹽水，活性污泥法對COD 的去除率均明顯低于菌株M02， 因為高鹽抑制了活性污泥中細菌的新陳代謝，甚至導致菌體死亡從而降低了有機物的降解率，而菌株M02 可在鹽度為1%～12%之間生長且具有降解性能，處理藥廠2 種廢水的降解率均為92%以上， 再次印證該菌株在高鹽條件下能夠有效降解COD。 菌株M02 處理高鹽廢水72 h 時，二車間廢水的去除率比一車間廢水去除率高1.8%，說明在細菌最適耐鹽范圍內(nèi)，有機物濃度增大，單位微生物可利用的底物增多， 有利于細菌的生長和有機物的去除。同樣2 種廢水用活性污泥處理時，鹽度越高，降解性能越差。 以上說明菌株M02 在高鹽環(huán)境中能夠維持自身的新陳代謝， 可有效降低廢水中COD濃度，處理效果顯著優(yōu)于活性污泥法，適合高鹽工業(yè)廢水的處理。

圖10 菌株M02 與普通活性污泥對高鹽廢水降解的比較

3 結(jié)論

通過對處理制藥廢水的活性污泥進行馴化、篩選得到一株耐高鹽優(yōu)勢菌株。經(jīng)過形態(tài)學、生理生化實驗和16S rDNA 序列分析， 確定該菌株為寡養(yǎng)單胞菌屬的一株潛在新菌， 將其命名為Stenotrophomonas pavanii M02，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為CGMCC No.22898。

菌株M02 可在NaCl 質(zhì)量分數(shù)為0 ～12%的環(huán)境中生長，具有廣譜耐鹽性。采用單因素實驗法研究不同培養(yǎng)條件對菌株降解模擬高鹽廢水的影響，確定最適宜培養(yǎng)條件：pH 值為7 ～8, 溫度為30 ℃, 接種量為7%，NaCl 的質(zhì)量分數(shù)為1%～4%。 該菌株延遲期短，對數(shù)生長期與穩(wěn)定期長，在處理廢水時可快速發(fā)揮作用，持續(xù)且穩(wěn)定地消耗有機污染物。

將菌株M02 處理某制藥廠2 個車間的高鹽廢水， 對COD 最大去除率分別為92.0%和93.8%，比活性污泥法對COD 去除率提高34.2%和59.9%。 在實際廢水處理中，該菌株具有高效降解性能，可大幅提高生物法處理難降解高鹽廢水的效果， 對工業(yè)廢水降解具有實際應用價值。