王 映 胡玲紅 王化敏 陳良標(biāo) ,

(1. 上海海洋大學(xué)國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

對(duì)于水生生物而言, 水溫是物種生存范圍限制的主要決定因素之一[1]。對(duì)于魚(yú)類(lèi)而言, 魚(yú)的體溫取決于外部水環(huán)境的變化。溫度是其行為, 生理和分子過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[2]。當(dāng)溫度下降到生存范圍的極限時(shí), 會(huì)影響其呼吸系統(tǒng)和生理行為[3,4]。極低的溫度會(huì)直接導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)死亡, 這給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 探究魚(yú)類(lèi)低溫耐受性的分子機(jī)制對(duì)于漁業(yè)發(fā)展和科學(xué)研究都具有重要的意義。

盡管許多研究表明, 魚(yú)類(lèi)可以通過(guò)廣泛的生化、代謝和生理調(diào)節(jié)逐步建立寒冷的適應(yīng)性表型[5,6]。例如產(chǎn)生特定溫度的同工酶[6], 改變膜脂質(zhì)的含量和不飽和脂肪酸的水平[7], 合成分子伴侶[8], 改變線(xiàn)粒體的密度及其特性等[9]。 然而, 這需要經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的適應(yīng)演變過(guò)程。隨著轉(zhuǎn)錄組和基因組學(xué)在魚(yú)類(lèi)物種中的應(yīng)用, 一些南極魚(yú)類(lèi)的抗寒基因被相繼報(bào)道, 如Yang等[10]發(fā)現(xiàn)將南極魚(yú)(Lycodichthys dearborni)的Ⅲ型抗凍蛋白(AFP Ⅲ)四聚體導(dǎo)入煙草中能提高煙草的抗寒性能。將鱗頭犬牙南極魚(yú)(Dissostichus mawsoni)的CaM基因在斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎成纖維ZF4細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后能夠顯著提高細(xì)胞的抗寒能力[11], 將D. mawsoni的ZPC5基因在斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)表達(dá)后能提高胚胎的低溫耐受性[12], 這表明南極魚(yú)在適應(yīng)低溫環(huán)境的過(guò)程中進(jìn)化出了一些新基因用于抵抗極限低溫的侵襲。

Dusp1是一種雙特異性蛋白磷酸酶, 可對(duì)3個(gè)主要MAPK亞家族成員(MAPK/JNK, MAPK/p38和MAPK/ERK)中的蘇氨酸和酪氨酸殘基進(jìn)行去磷酸化[13]。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn), 低溫脅迫誘導(dǎo)了羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)和斑馬魚(yú)(D. rerio)鰓中dusp1的大量表達(dá), 這提示我們dusp1可能參與了魚(yú)類(lèi)的低溫抵抗性能。將斑馬魚(yú)細(xì)胞中的dusp1基因進(jìn)行敲降后, 發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下dusp1敲降的細(xì)胞凋亡比對(duì)照組顯著增多[15], 這表明dusp1參與了魚(yú)類(lèi)冷應(yīng)激過(guò)程, 并在低溫情況下對(duì)細(xì)胞有保護(hù)功能,但其具體的分子機(jī)制并不清楚。

伯氏肩孔南極魚(yú)(Trematomus bernacchii)是南極魚(yú)亞目南極魚(yú)科的一種魚(yú)類(lèi), 長(zhǎng)期生活在溫度極低的南極地區(qū), 是進(jìn)行低溫適應(yīng)性進(jìn)化研究的良好樣本。此外, 鑒于先前研究報(bào)道dusp1對(duì)低溫下斑馬魚(yú)細(xì)胞和胚胎具有應(yīng)激保護(hù)作用, 并且通過(guò)比對(duì)斑馬魚(yú)和南極魚(yú)dusp1基因序列發(fā)現(xiàn)其高度相似,因此我們推測(cè)生活在南極的伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因在寒冷應(yīng)激方面可能會(huì)發(fā)揮一定作用。因此,在本研究中, 通過(guò)對(duì)伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1編碼區(qū)的克隆, 并將其構(gòu)建到真核表達(dá)載體中, 在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后, 通過(guò)低溫脅迫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了dusp1基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的ROS含量變化和細(xì)胞凋亡情況, 同時(shí)探究了其相關(guān)的分子機(jī)制, 揭示了伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因在抗寒中的功能,為進(jìn)一步探究冷脅迫下硬骨魚(yú)類(lèi)dusp1的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所采用的伯氏肩孔南極魚(yú)是從南極中山站的海冰中鉆孔垂釣所得, 將其保存在?80℃冰箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后直至使用。

1.2 南極魚(yú)dusp1基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用TRIzol (Invitrogen, 美國(guó))試劑, 根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作從伯氏肩孔南極魚(yú)的肌肉組織中提取總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,采用分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))對(duì)RNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 日本)按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因(GenBank登錄號(hào):XM_034121366.1)的編碼序列設(shè)計(jì)特異性引物dusp11F和dusp1R1(表 1)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增, 隨后將目的基因的PCR產(chǎn)物純化后連接到pEASY?-T5 Zero克隆載體(Transgen, 北京), 轉(zhuǎn)化至Trans1-T1(Transgen, 北京)感受態(tài)細(xì)胞中, 將陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增dusp1基因的編碼序列(Coding sequence, CDS), 由于缺乏特異性抗體我們通過(guò)在終止密碼子之前加上一段商業(yè)化的HIS標(biāo)簽(表 1), 之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨后將目的條帶采用膠回收試劑盒(Omega, 美國(guó))進(jìn)行切膠回收純化, 利用In-Fusion?HD Cloning試劑盒(TaKaRa, 日本), 與實(shí)驗(yàn)室保存的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行無(wú)縫克隆連接, 所用的無(wú)縫克隆引物列于表 1中。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-T1 (Transgen, 北京)感受態(tài)細(xì)胞中, 經(jīng)涂板、菌落PCR驗(yàn)證、測(cè)序和陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后, 使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Promega, 美國(guó))提取質(zhì)粒, 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers for this study

1.3 293T細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析

將293T細(xì)胞置于含10%胎牛血清(Gibco, 美國(guó))和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone, 美國(guó))中,放置在溫度為37℃, 二氧化碳濃度為5%, 95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%—80%時(shí), 采用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行空載質(zhì)粒和pcDNA3.1-dusp1載體的轉(zhuǎn)染。為了檢測(cè)DUSP1蛋白和磷酸化p38蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了Western Blot分析, 收集轉(zhuǎn)染后48h的細(xì)胞用于DUSP1蛋白的表達(dá)分析, 隨后收集低溫脅迫下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行磷酸化p38蛋白分析, 采用PBS洗滌兩次后加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)收集細(xì)胞總蛋白, 采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))測(cè)定蛋白濃度, 之后將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白各取30 μg進(jìn)行Western Blot檢測(cè), 所用一抗為鼠抗HIS抗體(華安, 杭州)和p-p38抗體(華安,杭州), 二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(華安,杭州)。

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃最適生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)24h后采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蛋白在細(xì)胞中的定位情況, 具體操作為將生長(zhǎng)于6孔板中的細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30min。用PBS洗滌2次后, 采用通透封閉緩沖液(0.1%Triton X-100, 1%BSA)封閉30min。然后, 將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的細(xì)胞與針對(duì)HIS(1﹕100)的商業(yè)單克隆抗體(Abcam, 英國(guó))一起于37℃孵育1h。以10min的間隔用PBS洗滌細(xì)胞2次, 隨后與GFP-Alexa 488 偶聯(lián)的羊抗小鼠(Invitrogen, 美國(guó))二抗在室溫下孵育1h。采用PBS洗滌細(xì)胞兩次各5min, 用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, Sigma,美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞核染色5min, 水洗3次, 每次5min, 最后采用倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss, 德國(guó))觀察熒光在細(xì)胞中的分布情況并拍照。

1.4 293T細(xì)胞低溫處理形態(tài)觀察和ROS檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和dusp1重組質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行18℃/10h、18℃/15h、13℃/10h和13℃/15h的低溫脅迫處理后, 采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。隨后吸棄培養(yǎng)基, 并用PBS輕輕清洗細(xì)胞,吸棄PBS后, 加入1 mL濃度為20 μmol/L的采用不含血清的培養(yǎng)基稀釋的ROS熒光探針DCFH-DA工作液。隨后將細(xì)胞放回相應(yīng)處理溫度的培養(yǎng)箱中避光孵育30min, 收集細(xì)胞至棕色避光管中并用PBS洗滌2次后每孔加入500 μL不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 采用流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6, 美國(guó))上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔, 并進(jìn)行3次生物學(xué)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基后, 加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次, 隨后加入0.25%的胰酶(不含EDTA)消化, 消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng), 看到細(xì)胞收縮變圓即可加入培養(yǎng)基終止以防止假陽(yáng)性。800 r/min離心5min后棄掉上清, 加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次, 加入100 μL1×Binding Buffer到含有1×105—5×105個(gè)細(xì)胞的棕色避光管中, 加入5 μL購(gòu)買(mǎi)于碧云天公司的碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色試劑室溫下避光染色10min, 后加入400 μL1×Binding Buffer, 采用流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6, 美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 細(xì)胞RNA的提取和caspase-3的定量PCR檢測(cè)

采用TRIzol (Invitrogen, 美國(guó))試劑, 提取各組細(xì)胞的RNA, 采用上述方法經(jīng)過(guò)質(zhì)檢和濃度測(cè)定后, 使用Prime Script RT試劑盒(TaKaRa, 日本), 將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master Kit(Roche, 瑞士)和Light-Cycler480(Roche, 瑞士)進(jìn)行qPCR分析, 以β-actin為參考基因(表 1), 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中caspase-3基因的所有轉(zhuǎn)錄本共有區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物(表 1),通過(guò)Pfaff[16]描述的方法定量基因的表達(dá)。

1.7 基因序列分析

通過(guò)ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)dusp1的開(kāi)放閱讀框及編碼的氨基酸序列; 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量, 理論等電點(diǎn), 不穩(wěn)定系數(shù),脂肪系數(shù)和親水性系數(shù)使用protparam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè); 使用NCBI的BLASTP程序搜索不同物種的dusp1同源基因序列。采用Mega7.0軟件和DNAMAN軟件對(duì)伯氏肩孔南極魚(yú)和其他物種的dusp1基因進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。用GraphPad Prism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及作圖, 當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著(以*表示), 當(dāng)P＜0.01時(shí)認(rèn)為差異極顯著(以**表示)。

2 結(jié)果

2.1 伯式肩孔南極魚(yú)dusp1基因的序列分析及同源比對(duì)

伯式肩孔南極魚(yú)dusp1基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)?128 bp, 編碼376個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)protparam在線(xiàn)軟件分析伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 其理論等電點(diǎn)為7.52, 不穩(wěn)定系數(shù)為57.62,脂肪系數(shù)為87.90, 親水性系數(shù)為–0.012, 表明其為親水性蛋白。通過(guò)多物種的氨基酸序列比對(duì)顯示,伯氏肩孔南極魚(yú)與人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的對(duì)應(yīng)物分別享有72.55%和70.92%的氨基酸相似性, 與青鳉(Oryzias latipes)和斑馬魚(yú)(D.rerio)享有88.15%和82.69%的同源性, 與斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)、尼羅羅非魚(yú)(O. niloticus)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)分別享有93.94%、91.22%、90.69%和86.28%的序列相似性, 這表明dusp1基因在哺乳類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中都具有序列的高度保守性。此外, 對(duì)其蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), 第67至第69位氨基酸為其核定位信號(hào)序列(Nuclear localization sequence,NLS: aa 67—69), 在其氨基酸272—277位的催化域中包含一個(gè)必需的半胱氨酸殘基(Cys272), 這在人、小鼠及其他比對(duì)的魚(yú)類(lèi)中都是相同的, 預(yù)示著該半胱酸殘基對(duì)于DUSP1結(jié)構(gòu)保持的重要性。

2.2 載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)及細(xì)胞定位分析

以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了表達(dá)南極魚(yú)dusp1基因的真核表達(dá)載體(圖 1A), 分別將空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后, 通過(guò)免疫熒光檢測(cè)了蛋白的分布情況, 發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)分布在細(xì)胞核中, 之后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率約為80%, 而在對(duì)照組中未觀察到熒光信號(hào)(圖 1B)。為了驗(yàn)證dusp1基因在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況, 分別收集了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行Western Blot分析, 結(jié)果顯示, 在41 kD處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶, 但在轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞中未檢測(cè)到 (圖 1C)。這表明, 伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因在293T細(xì)胞中成功地進(jìn)行了表達(dá), 可進(jìn)行下一步的功能驗(yàn)證。

圖1 dusp1的載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)分布Fig. 1 Vector construction and the distribution of dusp1 protein expression in cells

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

為探索伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因在低溫下發(fā)揮的功能, 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24h將過(guò)表達(dá)dusp1組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞放入18℃和13℃低溫培養(yǎng)箱中分別處理10h和15h后對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察, 結(jié)果表明(圖 2), 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在18℃/10h后出現(xiàn)皺縮, 細(xì)胞呈梭形分布, 少量細(xì)胞開(kāi)始變圓, 細(xì)胞觸角數(shù)量減少, 而過(guò)表達(dá)dusp1組僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)輕微皺縮。在18℃/15h后轉(zhuǎn)染空載組中有大量細(xì)胞變圓, 細(xì)胞觸角大量收縮, 細(xì)胞聚攏成團(tuán), 而轉(zhuǎn)染dusp1組僅有少量細(xì)胞皺縮變圓, 仍有大量細(xì)胞觸角分布。在13℃/10h后轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞均變圓呈斑塊狀聚集, 少量細(xì)胞死亡并從皿底脫落,過(guò)表達(dá)dusp1組細(xì)胞此時(shí)開(kāi)始變圓, 在皿底仍分布有少量細(xì)胞觸角, 在13℃/15h后轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞碎裂, 大量細(xì)胞死亡并從皿底脫落, 轉(zhuǎn)染dusp1組細(xì)胞此時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)斑塊狀聚集, 僅有少量細(xì)胞死亡。以上結(jié)果表明南極魚(yú)dusp1的過(guò)表達(dá)能夠減輕低溫脅迫對(duì)細(xì)胞形態(tài)的損傷, 對(duì)于維持細(xì)胞形態(tài)完整具有重要作用。

圖2 不同溫度處理下細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析Fig. 2 Cell morphological analysis at different treatment temperatures

2.4 ROS檢測(cè)

ROS在低溫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。采用熒光探針DCFH-DA對(duì)過(guò)表達(dá)dusp1組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞中的ROS進(jìn)行了標(biāo)記, 并采用流式細(xì)胞儀對(duì)兩組細(xì)胞中ROS含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在18℃/10h和18℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞中ROS含量與過(guò)表達(dá)dusp1組相比分別上調(diào)了約2.9倍和1.7倍(圖 3B、3C和3F), 在13℃/10h和13℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞中ROS含量比過(guò)表達(dá)dusp1組高約1.4和1.7倍(圖 3D、3E和3F), 這表明南極魚(yú)dusp1在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可減輕低溫刺激下ROS的積累。

圖3 不同溫度處理下細(xì)胞ROS含量變化Fig. 3 Intracellular ROS detection of cells under different temperature conditions

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

為檢測(cè)低溫脅迫下細(xì)胞的凋亡情況, 采用PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡率(圖 4), 在低溫18℃/10h和18℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載組細(xì)胞死亡率分別為(8.42±0.03)%和(16.8±2.15)%, 過(guò)表達(dá)dusp1組細(xì)胞死亡率分別為(2.29±0.03)%和(10.3±1.07)%, 在13℃/10h和13℃/15h處理后, 轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞死亡率分別為(19.3±3.15)%和(25.3±3.78)%, 過(guò)表達(dá)dusp1組細(xì)胞死亡率分別為(16.4±2.21)%和(20.2±2.37)%。所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組(P＜0. 05)。由以上結(jié)果可知過(guò)表達(dá)dusp1基因可顯著減少低溫下細(xì)胞的凋亡率。

圖4 不同溫度處理下細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig. 4 Cell apoptosis under different temperature conditions

2.6 相關(guān)凋亡基因表達(dá)情況檢測(cè)

ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)引起促凋亡基因p38的積累從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡, 而caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子。我們通過(guò)Western Blot和RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了過(guò)表達(dá)dusp1組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組細(xì)胞在低溫脅迫下p38的磷酸化水平和caspase-3的mRNA水平(圖 5)。結(jié)果表明, 在低溫脅迫后, 過(guò)表達(dá)dusp1組細(xì)胞中p38的磷酸化水平和caspase-3的mRNA水平顯著低于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組, 這表明過(guò)表達(dá)dusp1能有效抑制促凋亡基因的表達(dá),緩解細(xì)胞在低溫下的死亡進(jìn)程。

圖5 p38磷酸化水平和caspase-3的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)Fig. 5 The levels of phosphorylated p38 and the mRNA expression of caspase-3

3 討論

雙特異性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,dusp1)也稱(chēng)作絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)是一組既可以使酪氨酸殘基去磷酸化, 又可使絲氨酸/蘇氨酸殘基去磷酸的酶分子[17]。這些酶分子的結(jié)構(gòu)高度保守, 均包含非催化的N端結(jié)構(gòu)域和C端的催化結(jié)構(gòu)域。后者包含高度保守的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性位點(diǎn)序列(I/V)HCXAGXXR(S/T/G)。N端結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)保守的模塊序列, 稱(chēng)為激酶相互作用基序(KIM), 該序列介導(dǎo)MAPK底物的差異識(shí)別和結(jié)合, 并且還包含決定亞細(xì)胞定位的核定位(NLS)或輸出(NES)信號(hào)[18]。在本研究中,通過(guò)氨基酸序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)在第67至第69位氨基酸發(fā)現(xiàn)其核定位信號(hào)序列(RRR), 表明了dusp1定位于細(xì)胞核中, 這與我們的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果一致。在人和小鼠的N端保守模塊中該序列組成為RRRAK, 其中位于第57位的賴(lài)氨酸殘基(Lys57)可被P300乙酰化, 增強(qiáng)其與p38的相互作用,從而增加其磷酸酶活性并中斷MAPK信號(hào)傳導(dǎo)[19]。在本研究中, 伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1在其N(xiāo)端的保守模塊序列為RRRAR, 將賴(lài)氨酸突變?yōu)榫彼?Arg,R), 但與人和小鼠相比, 均同為堿性氨基酸。因此,筆者推測(cè)其在魚(yú)類(lèi)中的功能與哺乳動(dòng)物類(lèi)似, 該精氨酸也可能介導(dǎo)其與p38的相互作用從而影響MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。此外, 在其氨基酸272-277位的催化域中包含一個(gè)必需的半胱氨酸殘基(Cys272), 這與人和小鼠相同[20]。所有這些證據(jù)都表明dusp1在人類(lèi)、小鼠和魚(yú)類(lèi)中都享有高度的保守性, 可能執(zhí)行相似的功能。

研究表明ROS是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的介質(zhì)之一, 在細(xì)胞死亡信號(hào)通路中扮演了重要角色。在自然界中, 植物在遭受低溫刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致ROS含量的大量積累[21]。在細(xì)胞中, Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn), 冷刺激是導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞和斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞中ROS積累的主要因素。此外, Chen等[23]通過(guò)對(duì)生活在極限溫度下的南極魚(yú)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)許多抑制ROS的基因大量上調(diào), 這表明在寒冷脅迫下ROS的積累是一種普遍現(xiàn)象。但ROS的過(guò)度積累則會(huì)造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷, 進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)低溫刺激會(huì)導(dǎo)致對(duì)照組細(xì)胞中ROS的大量上調(diào),而在過(guò)表達(dá)伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1的細(xì)胞中ROS含量顯著低于對(duì)照組, 細(xì)胞凋亡率也顯著減少, 這表明在低溫刺激下dusp1會(huì)減輕細(xì)胞中ROS的積累,并在長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理中有利于緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生, 延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)長(zhǎng)。

絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一類(lèi)中央信號(hào)分子, 由P38、ERK和JNK 三個(gè)亞家族組成, 可對(duì)多種刺激作出反應(yīng), 控制著不同的細(xì)胞過(guò)程, 包括增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡[24]。據(jù)報(bào)道, 細(xì)胞中p38/MAPK或其上游激酶的活化可誘導(dǎo)凋亡, 而阻斷p38/MAPK的活化可防止多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生[25—27]?；钚匝?ROS)可以激活p38, 從而觸發(fā)隨后的凋亡程序, 例如某些細(xì)胞中caspase蛋白酶家族的激活。Caspase蛋白酶家族包括10個(gè)以上的成員, 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的下游執(zhí)行者。其中,caspase-3被認(rèn)為是蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分, 并在凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[28]。我們先前的研究表明低溫刺激會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS的積累進(jìn)而誘導(dǎo)p38/MAPK的表達(dá), 觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22]。在本研究中我們通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中p38的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)南極魚(yú)dusp1的過(guò)表達(dá)顯著降低了細(xì)胞中p38的磷酸化水平和caspase-3的表達(dá)。由于dusp1是一種特異性的使p38去磷酸化而失活的酶分子,因此, 我們認(rèn)為在對(duì)照組細(xì)胞中由于低溫刺激導(dǎo)致了ROS的積累引起p38的過(guò)度激活加劇了細(xì)胞凋亡進(jìn)程致使caspase-3過(guò)度活化。而在實(shí)驗(yàn)組中dusp1的過(guò)表達(dá)可通過(guò)滅活過(guò)度活化的p38進(jìn)而減緩低溫刺激下caspase-3的激活進(jìn)程來(lái)緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

先前的研究表明對(duì)斑馬魚(yú)細(xì)胞進(jìn)行dusp1基因敲降后, 在低溫脅迫下, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡顯著高于對(duì)照組[15], 這表明伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因與斑馬魚(yú)dusp1基因在功能上有一定的保守性, 但其具體的分子調(diào)控機(jī)制并不清楚。本研究首次證明了dusp1通過(guò)P38/MAPK信號(hào)通路參與了魚(yú)類(lèi)細(xì)胞冷應(yīng)激的調(diào)控, 為探究dusp1在低溫下調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的分子機(jī)制提供了新的證據(jù)。

綜上所述, 本研究首次報(bào)道了伯氏肩孔南極魚(yú)dusp1基因在低溫應(yīng)激過(guò)程中可以緩解細(xì)胞受低溫侵襲的程度, 并且這種保護(hù)作用主要是通過(guò)抑制p38/MAPK的過(guò)度磷酸化實(shí)現(xiàn)的, 表明了伯氏肩孔南極魚(yú)的dusp1基因在抗寒功能中具有重要作用,為探究極地魚(yú)類(lèi)低溫適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制研究提供了新的證據(jù)同時(shí)也為進(jìn)一步探究冷脅迫下硬骨魚(yú)類(lèi)dusp1的功能奠定了基礎(chǔ)。