溫 月 胡誠誠 汪仁平 夏 勇 夏同勝 何明月 周永康 張童欣 張 軍 龐 宇 王 浩 沈新禹 聶海濤, 吳孝兵,

(1. 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 蕪湖 241000; 2. 安徽省揚(yáng)子鱷繁殖研究中心, 宣州 242000;3. 安徽師范大學(xué), 安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蕪湖 241000)

揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis)在脊椎動物分類上隸屬于爬行綱鱷目(Crocodylia), 主要分布在長江中下游地區(qū)。其作為中國特有的爬行動物, 由于自然棲息地持續(xù)喪失、斑塊化及人類的肆意獵殺造成了近代以來野生揚(yáng)子鱷數(shù)量持續(xù)下降, 導(dǎo)致現(xiàn)存野生數(shù)量非常稀少。1973年聯(lián)合國將其列為臨危種和禁運(yùn)種我國已經(jīng)把揚(yáng)子鱷列為國家一類保護(hù)動物,嚴(yán)禁捕殺[1]。為防止揚(yáng)子鱷滅絕, 目前采用人工繁殖的方式進(jìn)行保護(hù)。歷經(jīng)近半個(gè)世紀(jì)的人工繁育保護(hù), 其種群數(shù)量得到一定的提升, 但是由于性成熟周期較長(雌性成年個(gè)體約需8—10年、體長1.5 m、體重約36 kg)等原因, 能繁殖成年個(gè)體種質(zhì)資源尤為珍貴。近年來, 揚(yáng)子鱷的多父性交配體系[2]、精子儲存[3]和卵黃發(fā)生等繁殖特性已逐漸被人們認(rèn)知, 但其在性腺發(fā)育早期的配子發(fā)生進(jìn)程則很少有人關(guān)注。原始卵泡的形成和發(fā)育直接影響到雌性動物生育階段的可用卵泡數(shù)量, 是雌性動物繁殖階段中可利用的全部資源[4], 其在重點(diǎn)保護(hù)物種的標(biāo)簽下能繁殖的成年個(gè)體種質(zhì)資源更顯珍貴。但至今未見有關(guān)鱷目動物卵巢中卵母細(xì)胞巢形成、裂解及原始卵泡形成過程和分子機(jī)制系統(tǒng)的報(bào)道。如何通過原始卵泡庫資源的有效調(diào)控, 追求其終生生殖配子的利用最大化, 始終是揚(yáng)子鱷人工繁育與物種保護(hù)進(jìn)程所面臨的重要課題之一。

1989年, 科學(xué)家利用染色體步移法在果蠅中克隆到一個(gè)控制胚胎頭部正常發(fā)育的基因Forkhead(FKH), 并證明該基因的編碼蛋白是細(xì)胞核中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[5,6]。隨后, 人們在小鼠(Mus musculus)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、非洲爪瞻(Xenopus tropicalis)、酵母(Candida marina)和人(Homo sapiens)等幾乎所有真核生物中也都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)這類具有保守序列的蛋白或轉(zhuǎn)錄因子, 并將其統(tǒng)一命名為Fox基因[7]。其中FoxO(Forkhead boxclass O)是研究最多的亞族之一, 且已被證實(shí)作為在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭的轉(zhuǎn)錄因子, 通過調(diào)節(jié)凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、應(yīng)激抵抗、長壽、葡萄糖代謝及肌肉生長等相關(guān)基因的表達(dá), 發(fā)揮了廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[8]。目前FoxO轉(zhuǎn)錄因子只有4個(gè)家族成員, 分別為FoxO1(FKHR)、FoxO3a(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6, 盡管所有哺乳動物的FoxO家族都包含這4個(gè)成員, 但它們的編碼基因及染色體定位在不同物種中有很大差異[9]。FoxO蛋白是細(xì)胞存活的負(fù)調(diào)節(jié)因子, 通過抑制細(xì)胞増殖、細(xì)胞凋亡或促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯等機(jī)制調(diào)控哺乳動物的生殖細(xì)胞發(fā)育[10]。哺乳動物卵巢中含有大量處于不同發(fā)育階段的卵泡, 卵泡的發(fā)育既依賴于卵巢局部生長調(diào)控因子(如IGF-1和雌激素),又依賴于垂體分泌的促性腺激素(FSH和LH)。經(jīng)證明, 在雌性哺乳動物中FoxO蛋白可以通過多條通路對卵泡的生長、成熟和閉鎖進(jìn)行調(diào)控[11]。Richards等[12]最早發(fā)現(xiàn), 大鼠卵巢中FoxO轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性受IGF-1、雌激素及促性腺激素調(diào)控,表明這些內(nèi)分泌因素會影響FoxO功能的發(fā)揮。另有研究表明FoxO1-/-小鼠在出生前即死亡, 且值得注意的是, 所有雌性小鼠的卵巢都出現(xiàn)了全體卵泡激活發(fā)育的現(xiàn)象, 導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡、卵泡池過早耗盡和繼發(fā)性不孕[13]?；贔oxO1在生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等中的重要性研究, 其序列已在大鼠和家雞等模式動物或經(jīng)濟(jì)家畜動物中被成功克隆。然而, 截至目前, 少有揚(yáng)子鱷相關(guān)研究中關(guān)于FoxO基因表達(dá)調(diào)控的報(bào)道。

本研究以初孵揚(yáng)子鱷性腺組織作為材料, 通過對Forkhead box家族蛋白-1(FoxO1)基因CDS區(qū)序列的克隆分析; 結(jié)合免疫組織化學(xué)對FoxO1蛋白在初孵鱷性腺復(fù)合體、胃、腸和肺臟等組織表達(dá)譜進(jìn)行研究; 利用免疫熒光和Western Blot技術(shù)對不同出殼后日齡(17d、63d和96d)雌鱷性腺組織中的FoxO1基因的蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行定位和定量研究。相關(guān)結(jié)果將為系統(tǒng)解析FoxO1蛋白在揚(yáng)子鱷卵子發(fā)生過程中的生物學(xué)功能提供參考, 對于豐富揚(yáng)子鱷卵子發(fā)生調(diào)控機(jī)制具有重要的生殖生物學(xué)理論研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

分別取來自安徽省宣城市揚(yáng)子鱷繁殖研究中心的17日齡、63日齡和96日齡3只初孵揚(yáng)子鱷, 迅速斷頭處死, 解剖取一部分幼鱷性腺組織液氮保存–80℃?zhèn)溆? 另取其性腺、胃、大腸和肺等外周組織, 經(jīng)多聚甲醛固定液處理后, 無水乙醇梯度脫水,透明、石蠟包埋, 用切片機(jī)連續(xù)切片(厚約6 μm), 于水浴鍋45℃清水展片并固定于潔凈載玻片上, 于60℃展烘箱中烘干2h, 可直接用于后續(xù)的研究。上述行為均得到了安徽師范大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

總RNA的提取與cDNA的合成取?80℃凍存的幼鱷性腺組織按TRIzol抽提方法, 獲得總RNA,并測其濃度(OD值在1.6—1.8)、純度及完整度后,參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA待用。

FoxO1基因cDNA序列的擴(kuò)增通過NCBI在鱷目中查找高度同源序列(登錄號: KY713605),運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)4對特異性引物(表 1), 以cDNA為模板進(jìn)行PCR(35個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)94℃,30s; 55℃, 30s; 72℃, 30s; 72℃終止延伸10min)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠驗(yàn)證條帶大小與引物設(shè)計(jì)條帶相符后, 送通用生物(安徽滁州)公司進(jìn)行測序并拼接后獲得揚(yáng)子FoxO1基因的完整CDS區(qū)序列。隨后利用DNAMAN軟件將測序得到的序列與在基因文庫中查找到的序列進(jìn)行同源性比對分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 引物序列信息Tab. 1 Information of primers sequences

免疫組化染色石蠟切片脫蠟脫水, 置于0.3%過氧化氫: 甲醇混合溶液中孵育30min, 清除內(nèi)源性過氧化物酶, 組織打孔后置于抗原修復(fù)液中微波加熱至沸騰, 滴加封閉液, 孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R, 1﹕300), 置于4℃冰箱過夜, 室溫孵育二抗(羊抗兔, 1﹕500)1.5h后, 用DAB試劑盒染色,蘇木素復(fù)染, 脫水透明封片, 光鏡下觀察并攝片?？瞻讓φ找訮BS代替。

免疫熒光染色石蠟切片脫蠟脫水, 置于0.3%過氧化氫: 甲醇混合溶液中孵育30min, 清除內(nèi)源性過氧化物酶, 組織打孔后置于抗原修復(fù)液中微波加熱至沸騰, 滴加封閉液, 孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R ,1﹕200), 置于4℃冰箱過夜, 37℃避光孵育二抗(羊抗兔, 1﹕500)1.5h后, 用DAPI避光復(fù)染細(xì)胞核, 用抗熒光淬滅劑封片液封片、光鏡下觀察并攝片。

Western Blot取?80℃凍存的17日齡、63日齡和96日齡幼鱷性腺復(fù)合體組織, 按RIPA裂解液抽提方法, 獲得總蛋白質(zhì), 經(jīng)SDS-PAGE電泳后將FoxO1及GAPDH內(nèi)參蛋白目的條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上, 封閉后, FoxO1目的條帶孵育兔源FoxO1一抗(Bioss, bs-9439R, 5%脫脂奶粉1﹕1000稀釋),GAPDH內(nèi)參蛋白條帶孵育鼠源GAPDH一抗(Bioss,D110016-0025, 1﹕2000), 在4℃條件下?lián)u床過夜, 在室溫條件下孵育二抗(5%脫脂奶粉1﹕2000稀釋)2h,用高靈敏ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1 揚(yáng)子鱷FoxO1基因CDS區(qū)序列的克隆

經(jīng)TA克隆測序和序列的拼接獲得長度為1941 bp的核苷酸片段、預(yù)測編碼646個(gè)氨基酸殘基, 蛋白理化預(yù)測分析表明揚(yáng)子鱷FoxO1蛋白等電點(diǎn)(isoelectric point; pI)和分子量(Mw)分別為4.88和162 kD。

2.2 FoxO1氨基酸序列同源性比對及構(gòu)建進(jìn)化樹

通過將揚(yáng)子鱷FoxO1基因的CDS區(qū)序列編碼的氨基酸序列與灣鱷(XP_019412112)、恒河鱷(XP_019359603)、密西西比短吻鱷(XP_014461938)、中華鱉(XP_014424549)、西部錦龜(XP_005285222)、原矛頭蝮(XP_015673988)、多疣壁虎(XP_015283276)、熱帶爪蟾(NP_001107165)、青鳉(NP_001098169)、小家鼠(AAI16898)、褐家鼠(XP_006252158)、智人(AAI26438)、原雞(NP_001074346)和斑胸草雀(ACK57931)的FoxO1蛋白及揚(yáng)子鱷FoxO4蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對后, 發(fā)現(xiàn)揚(yáng)子鱷的FoxO1基因的CDS區(qū)序列編碼的氨基酸序列與密河鱷等鱷目物種同源性為96.74%—92.21%; 與西部錦龜(85.87%)、中華鱉(85.34%)、原雞(85.65%)和斑胸草雀(85.02%)等物種的氨基酸同源性次之; 與智人(75.58%)、小家鼠(74.96%)、褐家鼠(74.81%)、熱帶爪蟾(72.79%)、壁虎(69.95%)和原矛頭蝮(68.61%)具有中等同源性; 而與青鳉的氨基酸同源性最低只有51.64%。此外, 經(jīng)與揚(yáng)子鱷FoxO4基因CDS區(qū)序列編碼的氨基酸比對發(fā)現(xiàn)兩者同源性僅為37.08%, 側(cè)面佐證所克隆序列確實(shí)為揚(yáng)子鱷FoxO1基因編碼序列。

利用DNAman軟件構(gòu)建脊椎動物FoxO1基因的分子進(jìn)化樹結(jié)果表明(圖 1), 揚(yáng)子鱷首先鱷目動物聚為一小類、再與斑胸草雀聚為第一大類、其他爬行類物種聚為第二大類, 提示鱷目物種FoxO1基因與鳥類的親緣關(guān)系相較中華鱉和原矛頭蝮等爬行動物更近。在其他脊柱動物中, 哺乳動物、硬骨魚和兩棲物種也各自聚類稱為子群, 表明FoxO1兼具功能保守性和種間特異性。

圖1 揚(yáng)子鱷FoxO1基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of amino acid sequence of FoxO1 gene in Alligator sinensis

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

FoxO1mRNA在初孵揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體和外周組織的表達(dá)譜結(jié)果如圖 2所示, 在初孵揚(yáng)子鱷外周組織中FoxO1mRNA表達(dá)情況為在大腸、肺臟和胃組織中有強(qiáng)或較強(qiáng)的表達(dá), 在性腺復(fù)合體中有強(qiáng)表達(dá)。FoxO1蛋白在初孵揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體和外周組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖 3所示, 在光鏡下, 腎上腺小體由類固醇生成細(xì)胞群和嗜鉻細(xì)胞群組成。類固醇生成細(xì)胞群位于腎上腺小體周圍,細(xì)胞排列緊密、成索團(tuán)狀分布、細(xì)胞呈立方形或柱狀, 胞質(zhì)染色淺、呈網(wǎng)絡(luò)狀, 細(xì)胞核呈圓形或卵圓形、位于細(xì)胞中央、染色深。結(jié)果表明FoxO1蛋白在性腺復(fù)合體的皮質(zhì)部、髓質(zhì)部和腎上腺部位均有表達(dá), 在性腺復(fù)合體中, FoxO1蛋白在腎上腺類固醇合成細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá), 在性腺皮質(zhì)部表達(dá)量顯著高于髓質(zhì)部(髓質(zhì)與皮質(zhì)部的間隔用虛線表示), 且其在性腺皮質(zhì)部中的表達(dá)主要位于前體顆粒細(xì)胞(顆粒細(xì)胞核型呈卵圓形、前體顆粒細(xì)胞核型呈立方或不規(guī)則形)。其中腎上腺類固醇合成細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞中均呈強(qiáng)表達(dá)(圖 2B), 性腺皮質(zhì)部的表達(dá)量顯著高于髓質(zhì)部且其在性腺皮質(zhì)部中的表達(dá)主要位于前體顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞(圖 2C);FoxO1蛋白在肺間質(zhì)中有較強(qiáng)表達(dá), 肺泡外圍細(xì)胞有強(qiáng)表達(dá)(圖 2D); FoxO1蛋白在大腸內(nèi)縱肌層及外縱肌層部分細(xì)胞有表達(dá)(圖 2E); 黏膜肌層部分細(xì)胞團(tuán)及大腸絨毛上皮有分布均勻的較強(qiáng)表達(dá)(圖 2F);FoxO1蛋白在胃體的漿膜層、黏膜下層和環(huán)肌層均有較強(qiáng)表達(dá)(圖 2G)。

圖2 FoxO1在揚(yáng)子鱷外周組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律Fig. 2 Temporal and spatial expression of FoxO1 in the peripheral tissues of Alligator sinensis

2.4 FoxO1蛋白在不同出殼后日齡雌性揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體中的時(shí)空變化規(guī)律

分別以17、63和96日齡雌性揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體組織為對象, 對FoxO1蛋白的免疫熒光信號定位情況進(jìn)行檢測。如圖 3所示, FoxO1蛋白在不同時(shí)期性腺組織中的免疫陽性信號在性腺皮質(zhì)部、髓質(zhì)部中、中腎和腎上腺等處均有不同程度表達(dá), 但其表達(dá)模式存在時(shí)期差異。17日齡性腺組織中的FoxO1主要表達(dá)于腎上腺和中腎區(qū), 且顯著高于63日齡和96日齡的性腺組織相應(yīng)區(qū)域。FoxO1在17日齡性腺皮質(zhì)部表達(dá)量極微弱, 隨著性腺發(fā)育過程表達(dá)逐漸上調(diào), 在63日齡性腺皮質(zhì)部呈無規(guī)則隨機(jī)分布, 在96日齡性腺皮質(zhì)部中, 其熒光信號分布趨向于卵母細(xì)胞發(fā)育程度更高的位置。熒光定量結(jié)果表明17、63和96日齡性腺組織中的FoxO1基因mRNA豐度差異不顯著, 與此不同Western blot結(jié)果表明: 17、63和96日齡性腺組織中的FoxO1表達(dá)量呈先上升后下降的變化模式, 表現(xiàn)為63日齡FoxO1基因表達(dá)量顯著高于17日齡和96日齡。

圖3 FoxO1在揚(yáng)子鱷性腺組織中的時(shí)空表達(dá)規(guī)律Fig. 3 Temporal and spatial expression of FoxO1 in the ovarian tissues of Chinese Alligator

3 討論

3.1 Forkhead box (Fox)蛋白家族的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能

Forkhead box (Fox)蛋白家族因能引起果蠅“叉頭”突變而得名, 是一類DNA結(jié)合域具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子, 通過與靶基因啟動子中的叉頭轉(zhuǎn)錄因子識別位點(diǎn)結(jié)合, 進(jìn)一步抑制或激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮生物學(xué)功能。Fox含19個(gè)亞家族, 其中作為研究最為透徹的FoxO亞家族中成員中高度同源的FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6四個(gè)亞型, 已被證實(shí)在哺乳動物[14]和秀麗線蟲[15]等低等生物中廣泛存在。FoxO1是進(jìn)化上保守的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO亞家族的成員, 有研究發(fā)現(xiàn)其在胰島素和生長因子對葡萄糖穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞分化等生命活動的影響過程中發(fā)揮重要作用[16], 且對葡萄糖代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激抵抗等過程也發(fā)揮重要影響。近年來對FoxO1的研究大多集中于小鼠、豬、牛、羊等哺乳動物, 尚未見關(guān)于該基因的序列和功能在鱷目動物中的相關(guān)報(bào)道。本研究通過揚(yáng)子鱷FoxO1編碼區(qū)序列的克隆和序列特征分析, 檢測其在外周組織中的表達(dá)分布,結(jié)合其在性腺早期發(fā)育過程中的時(shí)空變化規(guī)律研究進(jìn)一步探究其在揚(yáng)子鱷卵子發(fā)生進(jìn)程中的功能。

FoxO1是FoxO亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員, 其與成肌細(xì)胞分化及脂肪細(xì)胞代謝有關(guān), 并作為潛在因子參與骨骼肌的分化及Ⅰ型肌纖維基因的表達(dá), 因此是研究肌肉及脂肪組織發(fā)育和代謝的重要候選因子[17]。FoxO1對肌細(xì)胞的分化及脂肪細(xì)胞的代謝有著一定的作用, 其能促進(jìn)脂細(xì)胞的分化[18]、影響骨骼肌的生長發(fā)育[19]和Ⅰ型肌纖維基因的表達(dá)[20]。大量研究表明FoxO轉(zhuǎn)錄因子也是控制胚胎發(fā)生的重要物質(zhì), 對所有的胚原基層和器官的發(fā)育都是必需的[21]。在哺乳動物中, FoxO亞家族中的FoxO1、FoxO3和FoxO4廣泛表達(dá)于全身組織, 而FoxO6主要表達(dá)在腦的特定區(qū)域[22]。由此可推斷其在動物的生長發(fā)育方面也發(fā)揮了重要作用。楊燕軍[17]研究發(fā)現(xiàn)FoxO1基因在初生豬(1日齡)和成年豬(9月齡)的肝、肺、腎、脾、心、胃、皮下脂肪、肌肉等組織中均有表達(dá), 只是表達(dá)豐度隨發(fā)育階段和組織的不同而具有差異。王玲[23]研究發(fā)現(xiàn)FoxO1基因在新生犢牛各個(gè)組織中如腹內(nèi)脂肪、小腸淋巴結(jié)、肺、脾、胸腺、胃、腎、肝和心均有表達(dá), 但在不同組織中的表達(dá)量有差異, 這可能與FoxO1基因在有機(jī)體各組織器官中的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白在初孵鱷肺、胃和大腸中均有較強(qiáng)或強(qiáng)表達(dá), 說明其在初孵鱷的生長、代謝中可能有著某些特定的功能, 如促進(jìn)組織的生長發(fā)育與成熟、直接或間接介導(dǎo)各組織的協(xié)調(diào)工作等。但是對揚(yáng)子鱷的相關(guān)研究尚未取得足夠證據(jù), 相關(guān)問題仍需更多的研究去發(fā)現(xiàn)。

3.2 Forkhead Box (Fox)蛋白家族在雌性生殖系統(tǒng)中的功能報(bào)道

FoxO1在許多細(xì)胞類型中表達(dá)并參與了包括細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和氧化應(yīng)激抵抗在內(nèi)的諸多生物學(xué)過程[24], 其中FoxO1已被證實(shí)能夠通過影響卵巢卵泡的啟動、發(fā)育、成熟及閉鎖過程影響動物的繁殖性能。有研究指出FoxO1在多種哺乳動物的卵泡中均有表達(dá), 也有研究發(fā)現(xiàn),FoxO1mRNA在卵巢中表達(dá)豐富[25], 此外, 對香豬[26]的卵巢卵泡細(xì)胞進(jìn)行免疫組化時(shí)發(fā)現(xiàn)FoxO1在香豬卵泡的多個(gè)發(fā)育階段的顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá);在原始卵泡、次級卵泡和三級卵泡中顆粒細(xì)胞的表達(dá)弱; 在大腔卵泡的顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有較強(qiáng)的表達(dá); 在閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度減弱;凋亡顆粒細(xì)胞中沒有檢測到FoxO1的表達(dá)且有隨卵泡發(fā)育逐漸增強(qiáng)的趨勢。Tarnawa等[27]對多種哺乳動物使用免疫組化方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)FoxO1在不同動物卵泡的不同發(fā)育階段的顆粒細(xì)胞中表達(dá)情況均不同, 表現(xiàn)為原始卵泡前體顆粒細(xì)胞不表達(dá),而在發(fā)育中及更高級發(fā)育卵泡顆粒細(xì)胞中特異表達(dá)。還有研究表明,FoxO1對小鼠[15]、牛[23]的卵泡細(xì)胞的凋亡起到促進(jìn)作用, 過表達(dá)FoxO1后發(fā)現(xiàn)小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡水平顯著增加。以上研究結(jié)果表明FoxO1對目前已知的部分哺乳動物的卵泡發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。卵巢實(shí)質(zhì)是由外周的皮質(zhì)和中央的髓質(zhì)構(gòu)成, 皮質(zhì)部中含有不同發(fā)育階段的卵泡。本研究發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白在初孵揚(yáng)子鱷的性腺組織的皮質(zhì)部及髓質(zhì)部均有表達(dá)且皮質(zhì)部表達(dá)量明顯高于髓質(zhì), 皮質(zhì)部中主要表達(dá)于前體顆粒細(xì)胞, 這與毛文智等[28]在小尾寒羊的研究中指出卵泡閉鎖進(jìn)程易發(fā)生于如次級卵泡和三級卵泡這兩類發(fā)育程度較高的卵泡中, 申明[15]以小鼠為研究對象得出FoxO1的高表達(dá)就會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡閉鎖的結(jié)論相呼應(yīng), 皮質(zhì)部中含有顆粒細(xì)胞以及發(fā)育程度較高的卵泡, 故FoxO1在皮質(zhì)部有較高表達(dá)。在本研究中還發(fā)現(xiàn)FoxO1蛋白在性腺組織中的表達(dá)模式存在著時(shí)期差異, 在揚(yáng)子鱷性腺發(fā)育進(jìn)程中, FoxO1的表達(dá)逐漸趨向于卵母細(xì)胞發(fā)育程度更高的位置, 這與上文中所提到的多種哺乳動物不同發(fā)育階段卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)情況的結(jié)果相接近[27]。由此猜想其對卵泡及其周圍組織的發(fā)育成熟具有一定影響, 可以推測FoxO1在爬行動物揚(yáng)子鱷和其他哺乳動物的卵母細(xì)胞發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡以及卵泡閉鎖過程中扮演著重要的角色, 說明FoxO1在揚(yáng)子鱷和其他哺乳動物的生殖生理調(diào)控方面發(fā)揮了一定的作用, 但是其調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。后續(xù)繼續(xù)追蹤FoxO1蛋白在雌性揚(yáng)子鱷性腺發(fā)育各個(gè)階段的定位、遷移及定量表達(dá)信息并結(jié)合FoxO1蛋白編碼基因?qū)用娴南嚓P(guān)分析, 可對FoxO1蛋白對揚(yáng)子鱷性腺發(fā)育的影響有更深層的發(fā)現(xiàn)。

3.3 Forkhead Box (Fox)蛋白家族在雌性卵子發(fā)生過程中的功能報(bào)道

哺乳動物卵巢內(nèi)卵子發(fā)生過程受到多種因素的影響, 如內(nèi)分泌、旁分泌、自身調(diào)節(jié)因子及環(huán)境等的協(xié)同作用。Richards等[12]最早發(fā)現(xiàn), 大鼠卵巢中FoxO轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性受IGF-1、雌激素及促性腺激素調(diào)控, 表明這些內(nèi)分泌因素會影響FoxO功能的發(fā)揮, 國內(nèi)的研究者騰云以小鼠為研究對象發(fā)現(xiàn)FSH對閉鎖卵泡中FoxO1的表達(dá)有明顯的抑制作用[11], 進(jìn)一步證實(shí)了Richards等[12]的結(jié)論。FoxO1磷酸化的抑制能增強(qiáng)離體培養(yǎng)小鼠顆粒細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子PCNA和Ccnd-2基因的表達(dá),進(jìn)而阻滯細(xì)胞發(fā)生凋亡[29], 而這一過程也是FSH通過AKT/FoxO1信號通路調(diào)控相關(guān)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平完成的?？梢哉f明,FoxO1基因的表達(dá)水平與體內(nèi)激素、信號通路等密切相關(guān)。本研究對17、63和96日齡雌性揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體FoxO1mRNA進(jìn)行了熒光定量PCR檢測, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明17、63和96日齡性腺組織中的FoxO1基因mRNA豐度差異不顯著。同時(shí)對這3個(gè)時(shí)期的雌性揚(yáng)子鱷性腺復(fù)合體FoxO1蛋白進(jìn)行Western blot半定量檢測, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FoxO1蛋白在初孵揚(yáng)子鱷性腺組織中的表達(dá)量存在著時(shí)期差異。17、63和96日齡性腺組織中的FoxO1表達(dá)量呈先上升后下降的變化模式, 表現(xiàn)為63日齡FoxO1基因表達(dá)量顯著高于17日齡和96日齡。熒光定量PCR和 Western Blot結(jié)果存在差異, 可能原因分析如下兩點(diǎn): (1)所研究的基因可能存在著轉(zhuǎn)錄后修飾; (2)所取實(shí)驗(yàn)材料均為實(shí)驗(yàn)室前期所培養(yǎng)孵化的揚(yáng)子鱷, 在不同的卵子發(fā)生時(shí)期過程中的性腺復(fù)合體組織, 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會在配子發(fā)生過程中發(fā)生顯著的變化, 其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性也會發(fā)生相應(yīng)的改變; 而在染色質(zhì)重構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中表觀遺傳修飾發(fā)揮了不可或缺的重要的作用,據(jù)此可以推測, 在揚(yáng)子鱷的配子發(fā)生發(fā)育過程中,表觀遺傳信息有可能發(fā)生了較大的變化。FoxO1與顆粒細(xì)胞上FSH 受體密切相關(guān), 鑒于FoxO1作為信號通路中的關(guān)鍵一員, 其表達(dá)量變化及與上下游基因的相互作用對卵子發(fā)生過程中有重要影響。在個(gè)體發(fā)育過程中, 其表達(dá)量水平會發(fā)生一定變化,呈現(xiàn)一定的時(shí)期差異, 但是其變化原因還有待進(jìn)一步研究。推測隨著揚(yáng)子鱷的發(fā)育, 體內(nèi)有關(guān)雌性激素發(fā)生變化, 從而導(dǎo)致FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量發(fā)生變化, 進(jìn)而調(diào)控雌性生殖生理過程。然而, 參與卵子發(fā)生過程中的一些信號通路, 尤其是一些新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍不明確, 探索這些信號通路在卵子發(fā)生, 以及FoxO1在揚(yáng)子鱷生殖生理調(diào)控中的分子機(jī)制仍將是今后研究的熱點(diǎn)。