黃 穎， 劉 歡， 趙桂琴， 王綺玉， 羅建民， 姚瑞瑞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州 730070)

皮燕麥(AvenasativaL.)和裸燕麥(AvenanudaL.)均為禾本科燕麥屬(AvenaL.)一年生草本植物[1]，前者為糧、飼兼用的世界型栽培植物，成熟時內(nèi)外稃與籽粒不易分離；后者又稱玉麥、莜麥、鈴鐺麥，為綠色營養(yǎng)保健作物，籽粒易與外稃分離[2]。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，燕麥種植面積逐年擴大，種子需求量也隨之增加，然而種子自生理成熟即發(fā)生不可逆的劣變，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)、育種中種質(zhì)資源的貯藏、開發(fā)和利用[3]。

種子老化是一個不可逆的過程，種子活力在生理成熟時達(dá)到頂峰，隨著貯存時間延長而降低，直至完全喪失。因此，燕麥種質(zhì)資源的耐貯藏性是決定燕麥種子品質(zhì)的一個重要因素。自然老化作為衡量燕麥耐貯藏性的直接方式，歷時較長，而人工老化歷時較短，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的耐貯藏性研究[4]，但是人工老化是否能夠代替自然老化尚存爭議。Balesevic等[5]對6個大豆(GlycinemaxL.)品種研究表明人工老化會加速氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的下降。高華偉等[6]研究表明人工加速老化與自然貯藏時的大豆種子老化進程有明顯的相關(guān)性。張雯靜等[7]發(fā)現(xiàn)自然老化大蔥(AlliumfistulosumL.)種子各項活力和生理生化特性下降明顯快于人工老化的種子。燕麥種質(zhì)在人工老化及自然老化保存過程中其群體的遺傳結(jié)構(gòu)是否得到完全的保持，種子貯藏、繁殖保存中發(fā)生的老化及劣變是否導(dǎo)致遺傳變異，對成功貯存種子具有重大的意義[4]。

簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記(Inter-simple sequence repeat，ISSR)最早是由Zietkiewicze等[8]在SSR的基礎(chǔ)上建立起來的，利用植物基因組自身SSR設(shè)計引物擴增重復(fù)序列間的區(qū)域，無需預(yù)先進行克隆和測序[4]，是一種簡單、可靠、高效、易于處理、應(yīng)用廣泛的DNA指紋技術(shù)[9]，近年被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性和遺傳完整性分析中。劉歡等已建立且優(yōu)化燕麥ISSR體系[10]。目前，國內(nèi)外利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)開展了關(guān)于水稻(OryzasativaL.)[11]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[12]和李(PrunussalicinaL.)[13]等多種植物種質(zhì)資源的遺傳完整性研究。石鳳玲等[12]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)探究不同老化種子的發(fā)芽率與其遺傳完整性變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)75.00%可以考慮作為紫花苜蓿種子繁殖更新的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過探討不同老化方法對不同燕麥種質(zhì)的貯藏過程中萌發(fā)特性，利用ISSR分子標(biāo)記分析老化對遺傳物質(zhì)的影響和差異，為制定適合燕麥種質(zhì)資源的保存和更新策略提供科學(xué)依據(jù)，并確定燕麥種質(zhì)資源的更新標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的皮燕麥品種為‘隴燕3號’，裸燕麥品種為‘白燕2號’，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供，各處理方案見表1，自然老化種質(zhì)材料收獲于2012—2018年，貯藏倉庫室內(nèi)全年通風(fēng)，年均溫保持在10℃～12℃、年平均相對濕度為45%～64%，試驗于2020年10月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實驗室進行，供試材料分別貯藏了2年、4年、6年和8年。

表1 燕麥種子的自然老化和人工老化處理Table 1 Treatment of Avena seeds under natural aging and artificial aging

參照鄭曉鷹提供的老化方法[14]，測定燕麥種子初始含水量，將2018年收獲的燕麥種子含水量調(diào)至10%～14%，置于人工老化箱中，設(shè)定溫度為45℃，相對濕度95%進行人工老化。設(shè)置老化時間為24～96 h，每24 h取樣一次，共4個處理，以2018年收獲的未經(jīng)人工老化的種子為對照(Control check，CK)。老化完畢，取出種子晾至含水量降為原狀態(tài)，在4℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1測定指標(biāo)與方法 按照《國際種子檢驗規(guī)程》規(guī)定[15]，采用培養(yǎng)皿紙上法進行發(fā)芽試驗，并逐日統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

活力指數(shù)(VI)=∑Gt/Dt×S

式中：Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt為Dt相應(yīng)(t天)的發(fā)芽數(shù)，S為幼苗鮮重(g)。

浸出液電導(dǎo)率：隨機數(shù)取每品種50粒凈種子，浸入100 mL去離子水并封口，以去離子水為空白對照;于25℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h；浸種結(jié)束，立即測定溶液電導(dǎo)率[15]。

1.2.2燕麥種子基因組DNA提取 采用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP305)提取燕麥種子DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定DNA純度，于-20℃冰箱保存。

1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系和ISSR引物的篩選 參照哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR通用引物序列及劉歡[10]、郭紅媛[16]和余青青[17]等已發(fā)表的關(guān)于研究燕麥ISSR遺傳多樣性的文章，選出20條ISSR引物(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。ISSR-PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：12.5 μL 2× San Taq PCR Mix、40 ng模板DNA、4 μL引物(10 μmol·L-1)，用ddH2O補充至25 μL。在PCR熱循環(huán)儀器上進行PCR擴增，擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增結(jié)束后，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，點樣5 μL，以天根生化科技(北京)公司的2 000 bp Marker為對照，1×TAE為電泳緩沖液，電壓90 V，電流80 mA，電泳1 h，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表2 20條ISSR引物信息Table 2 Information on the 20 pairs of ISSR primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2010,NTSYS 2.1,POPGENE 32及SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然老化和人工老化對燕麥發(fā)芽率的影響

隨著老化處理時間的增加，2個燕麥品種的發(fā)芽率總體呈下降趨勢(圖1)。貯藏2～4年的‘隴燕3號’發(fā)芽率差異不顯著，均高于85.00%，隨后逐年下降，貯藏8年降至60.00%；而貯藏2年的‘白燕2號’發(fā)芽率為90.50%，隨后降幅逐年增大，貯藏8年發(fā)芽率降至49.00%。與自然老化相比，經(jīng)人工老化的‘隴燕3號’發(fā)芽率顯著下降(P<0.05)，各處理均與CK差異顯著(P<0.05)，AL1發(fā)芽率較CK下降了71.35%；隨著人工老化進程加深，‘白燕2號’發(fā)芽率呈先升后降的趨勢，人工老化處理24 h的種子發(fā)芽率為91.00%，略高于CK，經(jīng)人工老化處理72 h后發(fā)芽率顯著下降(P<0.05)，經(jīng)人工老化處理96 h降至54.00%。由此看來，自然老化對‘白燕2號’的發(fā)芽率影響更大，人工老化對‘隴燕3號’發(fā)芽率影響更大。

圖1 自然老化和人工老化對燕麥種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect on germination ratio of Avena under natural aging and artificial aging

2.2 自然老化和人工老化對燕麥種子活力指數(shù)的影響

隨著老化時間的增加，種子活力指數(shù)總體呈下降趨勢(圖2)。自然老化對‘白燕2號’種子活力指數(shù)影響顯著，貯藏2年的‘白燕2號’種子活力指數(shù)顯著高于‘隴燕3號’(P<0.05)；隨著貯藏時間的延長，自然老化下的‘隴燕3號’的活力指數(shù)下降不顯著，而‘白燕2號’種子活力指數(shù)降幅逐年增大，貯藏8年的‘白燕2號’種子活力指數(shù)降至4.16，略低于‘隴燕3號’。經(jīng)人工老化處理24 h的燕麥種子與CK相比下降顯著(P<0.05)，隨著人工老化時間的增加，‘白燕2號’種子活力指數(shù)的降幅逐漸增大(P<0.05)，‘隴燕3號’則下降較為緩慢。

圖2 自然老化和人工老化對燕麥種子活力指數(shù)的影響Fig.2 Effect on vigor index of Avena under natural aging and artificial aging

2.3 自然老化和人工老化對燕麥種子細(xì)胞膜透性的影響

隨著老化時間的增加，燕麥種子浸提液電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(圖3)。不同老化方法下‘白燕2號’的電導(dǎo)率均高于‘隴燕3號’，自然老化下‘隴燕3號’的電導(dǎo)率增長緩慢，貯藏8年的‘隴燕3號’電導(dǎo)率與對照差異顯著(P<0.05)；自然老化下‘白燕2號’的電導(dǎo)率總體呈先下降后上升的趨勢，‘白燕2號’種子貯藏4年，電導(dǎo)率開始顯著上升(P<0.05)，貯藏8年的‘白燕2號’細(xì)胞透性增大，電導(dǎo)率增至47.13 μS·cm-1。人工老化對‘隴燕3號’種子電導(dǎo)率影響不顯著；經(jīng)人工老化24 h的‘白燕2號’電導(dǎo)率顯著高于CK，人工老化24 h后上升緩慢；2種供試燕麥在人工老化96 h后電導(dǎo)率差異達(dá)到最大，‘隴燕3號’的電導(dǎo)率僅為‘白燕2號’的40.22%。

圖3 自然老化和人工老化對燕麥種子電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect on electrical conductivity of Avena under natural aging and artificial aging

2.4 種子基因組DNA質(zhì)量和純度檢測

用于分子標(biāo)記的燕麥種子DNA，條帶清晰，OD260/OD280介于1.8～2.0，DNA純度較好，沒有雜質(zhì)污染。老化處理對DNA分子量無明顯變化，條帶無明顯降解現(xiàn)象(圖4)。

圖4 自然老化和人工老化下燕麥的基因組DNA圖譜Fig.4 The genomic DNA of Avena under natural aging and artificial aging

2.5 自然老化和人工老化下燕麥種子ISSR-PCR多態(tài)性及其直觀分析

由表3可知，自然老化和人工老化下2個燕麥品種的種子基因組DNA由不同ISSR引物擴增出的條帶數(shù)不同(8～16條)，10條引物共檢測出108個位點，多態(tài)性位點85個，總多態(tài)性位點達(dá)78.70%。

表3 ISSR引物擴增結(jié)果及其多態(tài)性Table 3 Amplification results and polymorphism of ISSR primers used in this study

通過POPGENE 32對基因多樣性指數(shù)分析表明(表4)，L(自然老化的’隴燕3號’群體)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性(H)、香農(nóng)指數(shù)(I)值均為最高，分別為1.225 2，1.164 0，0.093 5和0.136 1。與L群體相比，AL，B和AB的Na，Ne，H和I均有所下降，各群體遺傳參數(shù)排序均為L > AL > B > AB?？梢姡斯だ匣瘜?個燕麥品種遺傳物質(zhì)的損傷比自然老化更大。

表4 應(yīng)用ISSR標(biāo)記對4個處理群體的遺傳參數(shù)分析Table 4 ISSR Genetic parameters analysis of four different treated populations

對不同老化處理下燕麥種子群體的基因組DNA進行ISSR-PCR擴增，引物UBC885和引物UBC889可以較為明晰的展示燕麥種子老化處理前后較為ISSR-PCR圖譜變化(圖5)。引物UBC885擴增出來的燕麥種子基因組片段長度主要集中在100～750 bp的范圍內(nèi)，‘隴燕3號’種子經(jīng)人工老化后條帶逐漸模糊，大分子條帶逐漸變暗，小分子條帶變亮且伴有條帶增加現(xiàn)象；引物UBC889擴增片段長度主要集中在100～2 000 bp的范圍內(nèi)，‘白燕2號’經(jīng)人工老化處理48 h和72 h后，在250～500 bp出現(xiàn)特有帶。從擴增圖譜來看，隨著老化時間的延長，部分小分子條帶逐漸變淡，100～500 bp出現(xiàn)DNA片段的缺失和增加現(xiàn)象，且DNA片段的缺失和增加都是隨機的，這種現(xiàn)象在人工老化下更為明顯。

圖5 引物UBC885(上)、UBC889(下)對自然老化和人工老化處理燕麥種子的ISSR-PCR圖譜Fig.5 ISSR amplification patterns of UBC885(upper) and UBC889(below) primers to different aging populations of Avena under natural aging and artificial aging

2.6 老化處理下燕麥種子與對照間的遺傳相似性

各老化處理間遺傳相似系數(shù)(表5)表明，自然老化各處理均與對照差異不顯著；人工老化各處理與對照間遺傳相似系數(shù)最大的是24 h的處理，遺傳相似系數(shù)為0.864 9，最小的是處理96 h，遺傳相似系數(shù)為0.681 2。人工老化低于48 h的處理與對照間的遺傳相似系數(shù)差異不顯著，人工老化處理72 h種子受到的傷害較大，與對照之間的遺傳相似系數(shù)差異顯著(P<0.05)，可見人工老化處理的臨界值介于48～72 h。人工老化對燕麥種子遺傳特征的影響大于自然老化。

表5 不同老化時間燕麥與對照間的遺傳相似系數(shù)Table 5 The genetic similarity coefficient between aging treatments and control treatments of Avena under different aging time

2.7 老化處理下燕麥種子ISSR標(biāo)記的聚類分析

NTSYS分析16份老化燕麥材料間遺傳相似系數(shù)(GS)結(jié)果表明，其變化范圍為0.504 5～0.973 0(表6)。老化處理下燕麥種子ISSR標(biāo)記的聚類分析如圖6所示，在遺傳相似系數(shù)0.800 0時聚為兩大類，‘隴燕3號’和‘白燕2號’的種子老化材料分別聚為一類?！]燕3號’各處理在遺傳相似系數(shù)為0.855 0時，自然老化處理(L1，L2，L3和L4)和人工老化處理(AL1，AL2，AL3和AL4)各歸為一類，在遺傳相似系數(shù)為0.930 0，人工老化處理中AL4單獨聚為一類?！籽?號’在遺傳相似系數(shù)為0.880 0聚為兩類，第一類為自然老化處理(B1，B2，B3和B4)，第二類是人工老化處理(AB1，AB2，AB3和AB4)。最終，在最高遺傳相似系數(shù)0.980 0時，僅AL2和AL3聚為一類?？梢?，不同品種的燕麥遺傳距離差異較大，同一品種在不同老化方法下遺傳相似度較低；長時間(≥72 h)的高溫高濕老化對‘隴燕3號’和‘白燕2號’種子的遺傳完整性保持具有較大的負(fù)面作用。

表6 自然老化和人工老化下燕麥的遺傳相似系數(shù)Table 6 The Genetic coefficient of the oat samples under natural aging and artificial aging

圖6 基于ISSR分子標(biāo)記的燕麥老化種子材料聚類分析Fig.6 Cluster analysis of aged oat seeds based on ISSR marker

3 討論

種子活力是檢驗種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，種子萌發(fā)是種子活力的具體表現(xiàn)，高活力的種子具有更好的生長優(yōu)勢，生產(chǎn)潛能和耐貯藏性[18]。本研究中影響燕麥種子萌發(fā)的主要因素為自然老化與人工老化處理的時間。隨著貯藏時間和人工老化的延長，‘隴燕3號’和‘白燕2號’種子活力均呈明顯的下降趨勢，相對電導(dǎo)率上升，這與大豆[6]和水稻[11]的相關(guān)研究結(jié)果一致。人工老化處理24 h的‘白燕2號’種子發(fā)芽率略高于未老化處理，這可能與種子休眠有關(guān)，燕麥屬于非深度休眠植物，貯藏年限較短的種子存在休眠或生理后熟現(xiàn)象，而短時間內(nèi)溫度升高可能激活了種子內(nèi)部某些酶的活性[19]，從而提高了種子發(fā)芽率。自然老化和人工老化下‘隴燕3號’種子活力指數(shù)明顯低于‘白燕2號’種子，這可能是因為‘隴燕3號’是皮燕麥，其外稃的機械約束作用在一定程度上延遲了種子的發(fā)芽時間。

人工老化因其耗時短、便于操作和可重復(fù)性高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于牧草種子耐貯性的相關(guān)研究。許多試驗表明，人工老化和自然老化的老化進程有一定的相關(guān)性，但也有研究表明，人工老化和自然老化兩種老化進程的遺傳基礎(chǔ)不同[20]。遺傳參數(shù)分析顯示：人工老化群體的遺傳參數(shù)較自然老化群體有所下降。由此看來，人工老化對燕麥種子遺傳物質(zhì)的損傷比自然老化更大，這可能由于人工老化更易導(dǎo)致燕麥種質(zhì)群體的部分等位基因缺失，降低其遺傳完整性，推測人工老化不能完全代替自然老化進行種子的耐貯性研究。當(dāng)前我國種質(zhì)資源保存工作的核心是維持種質(zhì)資源的遺傳完整性，即貯藏和繁殖更新過程中保持最小的遺傳變異，維持等位基因頻率分布的穩(wěn)定和群體的基因頻率分布以及遺傳結(jié)構(gòu)完整[21]。自然老化和人工老化下燕麥種子ISSR-PCR圖譜顯示：隨著貯藏時間和高溫高濕老化處理時間的延長，條帶趨于模糊，且伴有條帶數(shù)目減少和增加，說明老化時間的延長會引起遺傳變異。方青慧等[22]發(fā)現(xiàn)老化使燕麥種子中醇溶蛋白含量降低，也證實了老化對燕麥的遺傳完整性具有負(fù)面影響。在美洲狼尾草(PennisetumglaucumL.)[23]、水稻[11]和扁蓿豆(MedicagoruthenicaL.)[24]的遺傳完整性研究中也發(fā)現(xiàn)種子老化會降低種質(zhì)資源的種子活力，染色體畸變增多，同時伴隨著遺傳完整性的下降[25]。

種子老化會引起染色體畸變和DNA損傷，破壞基因組的完整性，為了保持種質(zhì)資源遺傳完整性，必須考慮更新種質(zhì)資源庫的臨界發(fā)芽率[26]。目前，各國種質(zhì)資源更新的臨界發(fā)芽率的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，如印度的臨界發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)為75.00%[27]，英國為70.00%，美國為50.00%[28]，而我國牧草中心庫將更新種質(zhì)資源庫的臨界發(fā)芽率定為60.00%[29]。本研究中貯藏時間不超過4年的2個燕麥品種的種子及人工老化0～48 h的‘白燕2號’發(fā)芽率均高于84.00%，可以保持較高的遺傳多樣性，而人工老化72 h，遺傳完整性顯著下降，此時‘白燕2號’發(fā)芽率降至79.50%。由此看來，‘隴燕3號’和‘白燕2號’的貯藏時間應(yīng)保持在1～4年，不宜超過6年，據(jù)此推測應(yīng)試燕麥品種的發(fā)芽率臨界值在79.50%～84.00%。人工老化下‘隴燕3號’各處理發(fā)芽率均低于30.00%，完全喪失了種用價值，建議采用高溫高濕老化方法對該種質(zhì)進行耐貯性研究時將老化時間縮短在24 h內(nèi)。未來尋找燕麥種質(zhì)資源更新的具體臨界發(fā)芽率和相應(yīng)的種質(zhì)資源貯存時間，還需要細(xì)化種子老化的時間梯度，將形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化研究相結(jié)合，采取更加先進的技術(shù)，并對遺傳參數(shù)進行更深入的分析。

4 結(jié)論

隨著老化程度加深，2個燕麥品種的種子活力和遺傳完整性逐漸降低?！]燕3號’比‘白燕2號’更耐貯，人工老化對種子遺傳物質(zhì)的損傷比自然老化更大，可見其不能完全替代自然老化。高溫高濕老化處理‘白燕2號’種子的臨界值介于48～72 h，貯藏時間不超過4年的‘隴燕3號’和‘白燕2號’種子及人工老化0～48 h的‘白燕2號’種子發(fā)芽率均高于84.00%，可以保持較高的遺傳多樣性，人工老化72 h后‘白燕2號’種子發(fā)芽率降至79.50%，與未經(jīng)人工老化處理的種子遺傳相似系數(shù)差異顯著，說明應(yīng)試燕麥種質(zhì)的發(fā)芽率臨界值介于79.50%～84.00%之間，建議將‘隴燕3號’和‘白燕2號’的貯藏時間保持在1～4年，不宜超過6年。