王翠麗

(1.南寧師范大學(xué)地理與海洋研究院，廣西南寧 530000；2.北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530000)

近江牡蠣()屬無(wú)脊椎()雙殼綱()貝類(lèi)，自身缺乏獲得性免疫，單純依靠固有免疫系統(tǒng)防御疫害。C型凝集素(C-type lectin，CTL)是固有的免疫重要因子，可通過(guò)糖識(shí)別域(carbohydrate recognition domain，CRD)中Ca結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸殘基的側(cè)鏈羰基與微生物表面N-氨基半乳糖或甘露糖等結(jié)合形成復(fù)合體，激活下游信號(hào)傳遞，促進(jìn)機(jī)體對(duì)外來(lái)入侵病原微生物清除，因此Ca結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸基序可決定CTL的糖結(jié)合活性和特異性。

已有研究顯示，脊椎動(dòng)物CTL中Ca結(jié)合位點(diǎn)2第1位氨基酸基序?yàn)镋PN(谷氨酸-脯氨酸-天冬酰胺)或QPD(谷氨酰胺-脯氨酸-天冬氨酸)，而無(wú)脊椎動(dòng)物除了以上2種，還可以是EPD(谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)、QPG(谷氨酰胺-脯氨酸-甘氨酸)、QPS(谷氨酰胺-脯氨酸-絲氨酸)和YPD(酪氨酸-脯氨酸-天冬氨酸)等；其第2位關(guān)鍵氨基酸基序也不局限于脊椎動(dòng)物的WND(色氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸)，而可以是WHD(色氨酸-組氨酸-天冬氨酸)、WSD(色氨酸-絲氨酸-天冬氨酸)、WID(色氨酸-異亮氨-天冬氨酸)和WRD(色氨酸-精氨酸-天冬氨酸)等。推測(cè)無(wú)脊椎動(dòng)物Ca結(jié)合位點(diǎn) 2 氨基酸基序的多樣性將賦予其更廣泛和更多樣化的糖結(jié)合活性。因此，筆者以近江牡蠣為研究對(duì)象，開(kāi)展了CTL的CRD病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)結(jié)合譜及抑菌活性研究，試驗(yàn)首先克隆其CTL基因，明確CRD結(jié)構(gòu)域及Ca結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸基序；其次通過(guò)體外重組CTL的CRD結(jié)構(gòu)域蛋白，揭示其PAMPs結(jié)合譜及抑菌活性；研究結(jié)果將為深入了解CTL在無(wú)脊椎動(dòng)物近江牡蠣固有免疫防御機(jī)制中的重要作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。近江牡蠣成貝(約2年齡)采自廣西欽州灣茅尾海的2個(gè)養(yǎng)殖區(qū)(108°35′08″E，21°43′00″N和108°51′ 58″E，21°39′ 21″N)，養(yǎng)殖海水條件：溫度分別為31.5 ℃和31.7 ℃，鹽度分別為17.7‰和17.9‰，pH分別為7.72和7.81，電導(dǎo)率分別為28.86和29.17 μs/cm。樣品采集完畢立即送回實(shí)驗(yàn)室處理。

主要試劑。Trizol試劑，購(gòu)自MRC公司；氯仿、異丙醇、乙醇，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；DEPC水，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；QIA quick Gel Extraction 試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司；rE、10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker 2000、PMD19-T Vectors，購(gòu)自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、X-gal、IPTG、氨芐青霉素，購(gòu)自北京全式金公司；TIAN Script RT cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自康為試劑公司；SYBR?Select Master Mix試劑盒，購(gòu)自ABI公司；Anti-6x His tag antibody一抗、Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗，購(gòu)自Abcam公司；畢赤酵母、耶羅維亞酵母、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、大腸桿菌及所用擴(kuò)增引物，購(gòu)自Invitrogen公司。

主要儀器。渦旋振蕩儀(型號(hào)為QL-902)，購(gòu)自海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)為Bio-Rad iMark)、電泳儀(型號(hào)為Powerpac HV 164-5056)、梯度熱循環(huán)儀(型號(hào)為T(mén)100TM)，購(gòu)自Bio-Rad公司；高速離心機(jī)(型號(hào)為5415D)、離心機(jī)(型號(hào)為mini spin plus)、紫外分光光度計(jì)(型號(hào)為Bio Photometer)，購(gòu)自Eppendorf公司；超微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào)為NanoDrop-1 000)，購(gòu)自NanoDrop公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為Syngene Genius)，購(gòu)自Syngene公司；低溫恒溫槽(型號(hào)為DC-1006)，購(gòu)自無(wú)錫沃信儀器有限公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)為7500 FAST)，購(gòu)自IBM公司；生物安全柜(型號(hào)為HF Safe 760S)，購(gòu)自Heal Force公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)為DHG-9070A)，購(gòu)自上海精宏設(shè)備有限公司。

基因克隆。依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的長(zhǎng)牡蠣基因組(登錄號(hào)：CGI_10009560)中查詢(xún)獲得其CTL基因序列，利用在線(xiàn)生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)近江牡蠣CTL基因RT-PCR引物(表1)。Trizol提取近江牡蠣組織樣本中總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA質(zhì)量和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性；TIAN Script RT cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表達(dá)譜分析。運(yùn)用Trizol法分別提取近江牡蠣成貝肝胰腺、外套膜、血細(xì)胞、鰓、肌肉柱、卵巢和唇瓣組織樣品總RNA，分別取1.0 μg總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，各組織樣品設(shè)置6個(gè)平行樣品。根據(jù)筆者克隆所得近江牡蠣CTL的CDS區(qū)序列(登錄號(hào)：MZ411536)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已登錄β-actin(登錄號(hào)：AF026063)序列，設(shè)計(jì)Q-PCR引物(表1)，采用7500 FAST熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Bio systems)進(jìn)行分析，2法計(jì)算近江牡蠣CTL mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果。

體外重組CTL的CRD結(jié)構(gòu)域蛋白。將CTL/pMD19-T和pET30a載體用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，將近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域目的片段與pET30a載體連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21中，重組質(zhì)粒鑒定陽(yáng)性表達(dá)克隆子(CTL/pET30a)；鑒定完畢將質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21中，分時(shí)間段IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間；在最佳誘導(dǎo)時(shí)間大量誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體，過(guò)鎳柱，尿素透析蛋白復(fù)性；BSA標(biāo)準(zhǔn)品加入考馬斯亮藍(lán)染色液，測(cè)定不同濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品的595 nm的光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；測(cè)定CTL的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白在595 nm的光吸收值，依據(jù)所建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度。

表1 近江牡蠣CTL引物Table 1 Primers for CTL in C.rivularis

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs結(jié)合譜。CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識(shí)別譜檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[11]的方法：將PGN、LPS和glucan溶解于pH 9.8 NaCO中，酶標(biāo)儀每孔含10 μg溶質(zhì)，4 ℃包被過(guò)夜，PBST洗板3次；酶標(biāo)儀每孔加入3% BSA 100 μL，37 ℃封閉30 min，PBST洗板1次；酶標(biāo)儀每孔加入不同稀釋濃度的CRD重組蛋白，18 ℃孵育3 h，PBST洗板1次；酶標(biāo)儀每孔加入Anti-6x His tag antibody一抗(稀釋比例1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗板1次；酶標(biāo)儀每孔加入Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗(稀釋比例1∶2 000)，37 ℃孵育1 h；酶標(biāo)儀每孔加入100 μL HRP底物TMB溶液，避光37 ℃反應(yīng)10 min，加入2 mol/L硫酸50 μL終止反應(yīng)；讀取酶標(biāo)儀OD值。依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定：樣品OD吸光度值/陰性對(duì)照OD吸光度值≥2.1判定為陽(yáng)性，該試驗(yàn)中陰性對(duì)照OD吸光度值平均為0.04，則0.04×2.1=0.084，該值即為陰性和陽(yáng)性分界點(diǎn)值，樣品值≥0.084，即判為陽(yáng)性。

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合活性。CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合活性檢測(cè)方法參照Lee等的方法：革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌，革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌，畢赤酵母和耶羅維亞酵母，分別挑菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，畢赤酵母和耶羅維亞酵母28 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌、鰻弧菌和大腸桿菌37 ℃ 200 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)；離心收集菌體，PBS緩沖液調(diào)整濃度為1×10CFU/mL；吸取1 mL各菌液懸濁液分別與100 μg CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白混合，室溫旋轉(zhuǎn)孵育；離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌菌體，無(wú)菌水重懸；各菌體加入蛋白電泳緩沖液，95 ℃水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳后凝膠轉(zhuǎn)NC膜，PBST緩沖液漂洗1次；NC膜5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST漂洗1次；NC膜Anti-6x His tag antibody一抗(稀釋比例1∶1 000)室溫孵育1 h，PBST漂洗1次；NC膜Goat Anti-Rabbit lgG(HRP)二抗(稀釋比例1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗1次；ECL顯影，拍照記錄結(jié)果。

CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性。CRD重組蛋白抑菌活性檢測(cè)方法參照Z(yǔ)hou等的方法：10 mmol/L磷酸鈉緩沖液稀釋革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌、畢赤酵母和耶羅維亞酵母，使得光密度達(dá)0.001 8。按照1∶1比例將細(xì)菌稀釋液與CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白混合在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后，以無(wú)菌超純水代替CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白作為空白對(duì)照，與等量培養(yǎng)液混合培養(yǎng)基設(shè)為陰性對(duì)照，測(cè)試最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

克隆獲得1種CTL基因(圖1)，測(cè)序分析顯示：CTL基因CDS區(qū)共1 350 bp(包括終止密碼)，編碼449個(gè)氨基酸。Signa IP軟件預(yù)測(cè)其多肽鏈N-端含有1段24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；SMART網(wǎng)站預(yù)測(cè)其多肽鏈包含1個(gè)胞外段110個(gè)氨基酸CRD結(jié)構(gòu)域；CRD結(jié)構(gòu)域含Ca結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸基序QPS/WHD及3個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖2)。

注：泳道1.DNA Mark；泳道2～6.目標(biāo)DNA Note：Lane 1.DNA Mark；Lane 2-6.Target DNA圖1 近江牡蠣CTL基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of CTL in C.rivularis

注：信號(hào)肽由斜體標(biāo)識(shí)；CRD結(jié)構(gòu)域用下滑線(xiàn)標(biāo)識(shí)；Ca2+結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸基序用矩形框標(biāo)識(shí)；CRD結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守Cys用斜體紅色字母“C”標(biāo)識(shí) Note：The signal peptide was identified by italics；CRD domain was identified by slide lines；amino acid sequences of Ca2+ binding site 2 were identified by rectangular box；conservative Cys of CRD domain was identified by italic red letter “C”圖2 近江牡蠣CTL基因部分序列Fig.2 Partial sequences of CTL in C.rivularis

熒光定量PCR檢測(cè)，2法計(jì)算近江牡蠣CTL mRNA相對(duì)表達(dá)譜，結(jié)果顯示：CTL mRNA在肝胰腺、外套膜、鰓、唇瓣、血細(xì)胞、卵巢、肌肉柱組織中均有表達(dá)，并呈組織差異分布。肝胰腺、外套膜和血細(xì)胞中表達(dá)量多，其次為鰓、肌肉柱和卵巢，唇瓣表達(dá)量最少(圖3)。

注：不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significant difference between groups(P<0.05)圖3 近江牡蠣CTL基因組織表達(dá)譜Fig.3 CTL relative mRNA levels in tissue of Crassostrea rivularis

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)，分子量約為27.45 kD，利用Ni-NTA對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果表明：蛋白純度較高，尿素濃度梯度對(duì)變性蛋白進(jìn)行復(fù)性(圖4、5)，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識(shí)別譜結(jié)果如圖6所示。當(dāng)CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白濃度為55 μg/mL時(shí)，具有LPS、PGN和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性，其中對(duì)LPS的結(jié)合能力最強(qiáng)，差異顯著(<0.05)。

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白能夠結(jié)合2種真菌：畢赤酵母(圖7泳道2)和耶羅維亞酵母(圖7泳道3)；1種革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌(圖7泳道4)；2種革蘭氏陰性菌：鰻弧菌(圖7泳道5)和大腸桿菌(圖7泳道6)。

近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性結(jié)果見(jiàn)表2。分析表2可知，C型凝集素CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白能抑制和殺死革蘭氏陽(yáng)性菌中的金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌和鰻弧菌；能抑制但不能殺死畢赤酵母和耶羅維亞酵母。

3 討論

筆者在無(wú)脊椎貝類(lèi)近江牡蠣中克隆獲得一種CTL分子，

圖4 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白氨基酸序列 Fig.4 Amino acid sequences of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

注：A.SDS-PAGE；B.Western blot；M1.蛋白Marker(Cat.No.M00516)；M2.蛋白Marker(Cat.No.M00521)；泳道1.BSA(2 μg)；泳道2、3.目標(biāo)蛋白 Note：A.SDS-PAGE；B.Western blot；M1.Protein Marker(Cat.No.M00516)；M2.Protein Marker(Cat.No.M00521)；Lane 1.BSA(2μg)；Lane 2，3.Target protein圖5 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白Fig.5 CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

注：*表示組間差異顯著(P<0.05) Note：* indicates significant difference between groups(P<0.05)圖6 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白PAMPs識(shí)別譜 Fig.6 PAMPs binding spectrum of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

其CRD結(jié)構(gòu)域Ca結(jié)合位點(diǎn)2第一氨基酸基序?yàn)镼PS，這有別于脊椎動(dòng)物，但在其他貝類(lèi)中出現(xiàn)過(guò)類(lèi)似現(xiàn)象。如脊椎動(dòng)物第一氨基酸基序EPN的第三位氨基酸天冬酰胺被天冬氨酸所取代時(shí)，則成為EPD基序，這在櫛孔扇貝()和熱帶蛤()中研究發(fā)現(xiàn)；脊椎動(dòng)物另一個(gè)第一氨基酸基序QPD的第三位氨基酸天冬氨酸被絲氨酸所取代時(shí)，則成為QPS基序，這在紫貽貝()中發(fā)現(xiàn)過(guò)。上述氨基酸的直接取代將導(dǎo)致Ca結(jié)合位點(diǎn)2質(zhì)子供體和質(zhì)子受體之間發(fā)生變化，可能會(huì)影響糖結(jié)合活性和抑菌特異性。近江牡蠣CRD結(jié)構(gòu)域Ca結(jié)合位點(diǎn)2第二氨基酸基序是WHD，同樣有別于脊椎動(dòng)物保守的WND，這一變化同樣在其他貝類(lèi)中有過(guò)報(bào)道。對(duì)于脊椎動(dòng)物第二氨基酸基序WND的研究已證實(shí)其作用是當(dāng)CRD與配體結(jié)合時(shí)起輔助作用，對(duì)于無(wú)脊椎貝類(lèi)中多種多樣的第二氨基酸基序更多人則認(rèn)為其可能參與決定糖結(jié)合活性和特異性。

注：1.陽(yáng)性對(duì)照；2.畢赤酵母；3.耶羅維亞酵母；4.金黃色葡萄球菌；5.鰻弧菌；6.大腸桿菌 Note：1.Positive control；2.Pichia pastoris；3.Yarrowia lipolytica；4.Staphylococcus aureus；5.Vibrio anguillarum；6.Bacillus coli圖7 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白菌結(jié)合譜Fig.7 Bacterial binding spectrum of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis

表2 近江牡蠣CTL胞外段的CRD結(jié)構(gòu)域重組蛋白抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of CRD domain recombinant protein of CTL in C.rivularis μmol/L

利用近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白檢測(cè)其PAMPs結(jié)合譜，結(jié)果顯示：其體外重組蛋白濃度為55 μg/mL時(shí)，具有LPS、PGN和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性。脊椎動(dòng)物大鼠()的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，第一氨基酸基序?yàn)镋PN或QPD時(shí)，均表現(xiàn)為D-mannose和D-galactose結(jié)合活性。而在無(wú)脊椎貝類(lèi)中，不同的氨基酸基序組合可表現(xiàn)出多種多樣的糖結(jié)合活性。如長(zhǎng)牡蠣()QPS/WHD氨基酸基序組合時(shí)，表現(xiàn)出了LPS、PGN、mannan和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性，這與筆者所得結(jié)果相近；在櫛孔扇貝的研究中發(fā)現(xiàn)EPN/LND和EPN/YND 2類(lèi)Ca結(jié)合位點(diǎn)2氨基酸基序組合時(shí)，則同時(shí)表現(xiàn)出了LPS、mannan、PGN和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性；而當(dāng)?shù)谝话被峄蚓鶠镋PN，第二氨基酸基序分別為FAD和LND時(shí)，則一個(gè)表現(xiàn)為L(zhǎng)PS和mannan 2種PAMPs結(jié)合活性，另一個(gè)表現(xiàn)為L(zhǎng)PS、mannan、PGN和glucan 4種PAMPs結(jié)合活性。若按照脊椎動(dòng)物中已證實(shí)的第一氨基酸基序決定糖結(jié)合活性和特異性，而第二氨基酸基序?yàn)檩o助作用的原理定義無(wú)脊椎貝類(lèi)顯然是不合適的，推測(cè)無(wú)脊椎貝類(lèi)決定糖結(jié)合活性和特異性不僅取決于第一氨基酸基序，還取決于第二氨基酸基序。

筆者利用近江牡蠣CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白檢測(cè)菌結(jié)合譜及抑菌活性，結(jié)果顯示，其能結(jié)合、抑制和殺死革蘭氏陽(yáng)性菌中的金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌和鰻弧菌，能結(jié)合、抑制但不能殺死畢赤酵母和耶羅維亞酵母。這與前人在海灣扇貝中所得結(jié)果較一致，當(dāng)CTL的CRD結(jié)構(gòu)域體外重組蛋白表現(xiàn)出PGN、LPS和glucan 3種PAMPs結(jié)合活性時(shí)，其可結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和酵母，具有多種抑菌和殺菌活性。

筆者利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)近江牡蠣CTL mRNA相對(duì)表達(dá)譜，結(jié)果顯示，其在肝胰腺、外套膜和血細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織中的表達(dá)量(<0.05)。在無(wú)脊椎貝類(lèi)中，肝胰腺是合成固有免疫相關(guān)蛋白的重要器官，血細(xì)胞是機(jī)體清除入侵病原微生物的直接參與者，而外套膜和鰓是外界環(huán)境直接接觸最多的器官，這些器官較多分布免疫相關(guān)基因CTL，可幫助機(jī)體快速識(shí)別、結(jié)合和清除入侵外源微生物，符合貝類(lèi)的生理和生活環(huán)境特點(diǎn)。

綜上，該研究證實(shí)CTL在無(wú)脊椎貝類(lèi)近江牡蠣固有免疫防御機(jī)制中可發(fā)揮識(shí)別、結(jié)合、抑制和殺死多種有害菌的重要作用。