葛高飛，沈旭松，陳諾，王琴，許陽

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

我國的茶葉生產(chǎn)歷史悠久，消費者眾多，茶產(chǎn)業(yè)為我國創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益，在國民經(jīng)濟和國際貿(mào)易中一直占有重要地位。土壤是茶樹生長的基礎(chǔ)，顯著影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，優(yōu)質(zhì)安全的茶葉離不開健康的土壤環(huán)境和合理的人為管理。近幾年，我國茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展迅速且平穩(wěn)，但茶葉的安全質(zhì)量問題仍是制約其發(fā)展的瓶頸之一，其中茶葉和茶園土壤的重金屬污染現(xiàn)象一直存在且廣受關(guān)注。茶葉是我國的大宗農(nóng)產(chǎn)品之一，由于工業(yè)廢棄物排放及化肥農(nóng)藥使用的不當(dāng)，茶葉中的重金屬污染日趨加重，嚴重影響了茶樹生長及茶葉品質(zhì)。目前我國尚未對茶園土壤中重金屬的種類和含量做過系統(tǒng)調(diào)查，但區(qū)域性的調(diào)查研究結(jié)果表明，重金屬鉛在茶葉中的超標(biāo)率較為普遍，目前茶葉中鉛的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 mg·kg（GB 2762—2017）。

茶多酚在茶葉中的含量很高（18%～36%），且大部分溶于水，是茶園土壤多酚的主要來源。茶多酚可通過絡(luò)合作用與無機鹽類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，降低無機元素的生物有效性。大量研究表明，茶多酚對生物的重金屬脅迫效應(yīng)具有緩解作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，Pb可以與茶多酚產(chǎn)生大量絡(luò)合物，從而降低鉛的生物有效性，緩解茶樹植株的鉛毒害癥狀。也有研究發(fā)現(xiàn)，添加外源鈣對處于逆境脅迫下的植物有重要緩解作用，通過鈣信使系統(tǒng)可提高植物對重金屬、干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等逆境的抵抗能力。鈣離子可以增加細胞壁的穩(wěn)定性，降低細胞膜透性，從而降低重金屬對植物的毒害作用。雖然茶多酚與多數(shù)金屬離子均可產(chǎn)生沉淀狀態(tài)的絡(luò)合物，但其與Ca只有在pH 8.5 以上時才會產(chǎn)生大量絡(luò)合物。因此，茶園土壤中的鈣不會與茶多酚形成絡(luò)合物而降低其生物有效性。

為比較添加茶多酚與鈣對茶樹葉片鉛毒害的緩解效果，本研究通過水培試驗，以舒茶早茶苗為材料，研究鉛脅迫下添加茶多酚和鈣對茶樹葉片鉛吸收和亞細胞分布的影響，研究結(jié)果可為茶多酚功能的合理利用提供理論基礎(chǔ)，同時也為茶樹鉛污染的診斷與防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

供試茶樹品種為舒茶早，采自安徽省黃山市苗木基地，為兩年生扦插苗。先將茶樹苗根系上的土壤用自來水沖洗干凈，再用超純水清洗3 次。將茶樹苗栽植于塑料盆缽（高30 cm、內(nèi)徑25 cm）中，用1/2 霍格蘭營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)1 周，再轉(zhuǎn)移至完全營養(yǎng)液中，培養(yǎng)期間通氧泵連續(xù)通氣，每5 d 更換一次營養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH 值至6.0，培養(yǎng)約兩個月，茶樹苗根部長出部分白色吸收根后進行試驗處理。

選擇長勢良好且生長一致的茶樹植株，設(shè)置4 個處理，即對照（CK）、鉛處理（Pb，0.5 mmol·L鉛）、鉛+茶多酚處理（Pb+TP，0.5 mmol·L鉛+0.5 mmol·L茶多酚）和 鉛+鈣離子處理（Pb+Ca，0.5 mmol·L鉛+0.5 mmol·L鈣離子），鉛以硝酸鉛的形式加入，鈣源為分析純氯化鈣，每個試驗處理3個盆缽，每個盆缽定植4株茶樹苗。培養(yǎng)處理30 d，期間用通氣泵連續(xù)通氣，每5 d更換一次營養(yǎng)液，用0.1 mol·LHCl或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至6.0。茶樹苗收獲后，先用自來水沖洗整株茶苗，然后用超純水清洗干凈，吸水紙吸干表面水分，分別稱取質(zhì)量。取成熟葉（第4片真葉）鮮葉用于掃描和透射電鏡觀察，剩余成熟葉（第4～6片真葉）于-20 ℃下保存用于元素含量及亞細胞分布分析。

1.2 測定方法

1.2.1 茶樹葉片鉛和鈣含量的測定

稱取0.200 0 g 茶樹成熟葉片烘干樣，用HNO-HClO（4∶1）消解，先在90 ℃左右預(yù)煮1 h，然后在160 ℃下消煮至澄清，180 ℃趕酸至盡干（呈濕潤狀態(tài)，無明顯液體殘留），用1%的稀HNO定容至25 mL容量瓶，溶液搖勻后過0.22 μm 的水系濾膜后待測。鉛和鈣的含量利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Thermo iCAP7400 DUO）測定，再計算得到茶樹葉片中鉛和鈣的含量。

1.2.2 茶樹葉片亞細胞組分分離及鉛的測定

茶樹葉片亞細胞各組分分離采用差速離心法。準(zhǔn)確稱取成熟葉鮮樣0.500 0 g，加入20 mL細胞組分提取液[0.25 mol·L蔗糖+50 mmol·LTris-HCl緩沖液（pH 7.5）+1 mmol·L二硫赤蘚糖醇]，研磨茶樹葉片并勻漿，冷凍離心機600 r·min下運行5 min，沉淀為茶樹葉片細胞壁組分（F1）；上清液于2 000 r·min下運行15 min，沉淀為茶樹葉片的細胞核和葉綠體組分（F2）；上清液于10 000 r·min下運行20 min，沉淀為茶樹葉片線粒體組分（F3）；剩余上清液為茶樹葉片的細胞膜、細胞質(zhì)和液泡等可溶性組分（F4）。勻漿和提取操作在冰盒內(nèi)進行。茶葉葉片樣品及其各亞細胞組分采用HNO-HClO混合消化，鉛含量直接用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Thermo X SERIES 2）測定。

1.2.3 掃描電鏡分析

取鉛脅迫30 d 的茶樹苗，用自來水和超純水將茶樹植株沖洗干凈，切取完整的成熟葉片（第4 片真葉）中部（避開葉脈）4 mm×4 mm，用磷酸緩沖液（0.1 mol·L）清洗干凈后，快速置于盛有5%戊二醛固定液的離心管中固定12 h，并用真空泵抽氣使茶樹葉片下沉到離心管底部（以保證葉片組織完全沒入戊二醛固定液中），期間加入1%的NaS溶液，使茶樹葉片組織中的鉛元素凝結(jié)。用磷酸緩沖液沖洗3 次，再分別使用50%、70%、80%、90%、95%和100%的酒精溶液逐級脫水，每次15 min。再經(jīng)100%丙酮置換2 次，每次15 min。二氧化碳臨界點干燥后鍍金，用Hitachi S4800型掃描電鏡在1.0 kV的加速電壓下觀察、拍照。

1.2.4 透射電鏡分析

取清洗干凈的茶樹苗，切取完整的成熟葉片（第4 片真葉）中部（避開葉脈）2～3 cm，快速將茶樹葉片組織投入5%的戊二醛固定液（0.1 mol·L的磷酸緩沖溶液配制，pH 6.8）中，在4 ℃黑暗條件下固定18 h。固定后的葉片在0.1 mol·L磷酸緩沖溶液（pH 6.8）中清洗3 次，每次15 min。轉(zhuǎn)移茶樹葉片組織至1%的鋨酸（0.1 mol·L磷酸緩沖溶液配制，pH 6.8）中1.5 h，分別使用30%、50%、70%、80%、90%和95%的酒精溶液逐級脫水，每次15 min，再用100%的酒精脫水2次，每次10 min。經(jīng)100%的丙酮置換2 次，每次15 min。丙酮與包埋劑1∶1 比例滲透處理1 h，1∶3 比例滲透處理3 h，純包埋劑過夜，然后純包埋劑制作膠囊。膠囊置于70 ℃烘箱處理24 h，然后用超薄切片機切片（厚度100 nm），分別用醋酸雙氧鈾染色20 min、檸檬酸鉛染色15 min。茶樹葉片組織結(jié)構(gòu)的改變及鉛的分布特征觀察采用透射電鏡（Hitachi HT7700），在80 kV的加速電壓條件下完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)值均為3 次重復(fù)的平均值，使用Excel 2017 制圖。應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（Oneway ANOVA），采用LSD 法進行多重比較，＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對茶樹葉片鉛和鈣吸收的影響

如圖1 所示，鉛脅迫顯著增加了茶樹葉片對鉛元素的吸收。茶多酚添加后，茶樹葉片對鉛的吸收量顯著降低，Pb+TP 處理的鉛含量降為Pb處理的69.11%；添加鈣離子后，茶樹葉片對鉛的吸收無顯著變化。Pb處理顯著降低了茶樹葉片對鈣元素的吸收（圖2），與CK 相比，鈣含量降低了27.97%；添加茶多酚后茶樹葉片鈣含量較Pb 處理增加了11.10%，但仍顯著低于CK；鉛脅迫下加入鈣離子，顯著增加了茶樹葉片對鈣元素的吸收，Pb+Ca處理的鈣含量是Pb處理的1.35倍，鈣含量增加了34.57%；Pb+Ca處理與CK處理的茶樹葉片鈣含量無顯著差異。

圖1 不同處理的茶樹葉片鉛含量Figure 1 Lead content of different treatments in tea leaves

圖2 不同處理的茶樹葉片鈣含量Figure 2 Calcium content of different treatments in tea leaves

2.2 添加劑對茶樹葉片細胞形態(tài)的影響

利用掃描電鏡觀察茶樹葉片表面形態(tài)，結(jié)果如圖3 所示。與CK 相比，Pb 處理條件下的茶樹葉片表面和氣孔周邊有較多褶皺。Pb+TP 處理的葉片表面褶皺較Pb 處理少，氣孔周邊的褶皺較淺。Pb+Ca 處理的葉片表面光滑，氣孔周邊褶皺較淺，與CK處理的葉片表面形態(tài)較為相似。

圖3 茶樹葉片的掃描電鏡圖（×300倍）Figure 3 Scanning electron microscopy（SEM）of tea leaves（×300 times）

利用透射電鏡觀察茶樹葉片內(nèi)部細胞形態(tài)，具體如圖4 和圖5。CK 處理的茶樹葉片細胞內(nèi)部形態(tài)健康正常；Pb 處理的茶樹葉片細胞的液泡內(nèi)存在較多黑色物質(zhì)沉積，細胞器較小，部分細胞器消失；Pb+TP 處理的茶樹葉片細胞液泡內(nèi)也有物質(zhì)沉積，且細胞器呈萎縮狀態(tài)，但程度輕于Pb 處理；Pb+Ca 處理的茶樹葉片細胞內(nèi)的細胞器無明顯萎縮現(xiàn)象，液泡內(nèi)有少量的黑色物質(zhì)沉積，細胞壁較其他3 個處理更厚，細胞壁和細胞器邊緣有少量黑色物質(zhì)沉積，細胞質(zhì)和細胞核顏色較深，細胞內(nèi)部整體形態(tài)與CK 處理較為相似。Pb 和Pb+TP 處理的細胞，因液泡內(nèi)黑色物質(zhì)沉積顯著，細胞器、細胞質(zhì)和細胞壁的顏色相對較淺，觀察不到明顯的黑色物質(zhì)沉積。

圖4 茶樹葉片的單細胞透射電鏡圖（×1 000倍）Figure 4 Transmission electron microscope（TEM）of single cell in tea leaves（×1 000 times）

圖5 茶樹葉片的多細胞透射電鏡圖（×500倍）Figure 5 Transmission electron microscope（TEM）of multiple cells in tea leaves（×500 times）

2.3 添加劑對茶樹葉片亞細胞組分中鉛分布的影響

圖6 和圖7 是鉛在茶樹葉片亞細胞中的分布情況，從圖中可以看出，鉛在茶樹葉片亞細胞的分布情況與透射電鏡觀察的黑色物質(zhì)沉積規(guī)律一致，因此透射電鏡觀察到的黑色物質(zhì)即為鉛在茶樹葉片細胞內(nèi)的沉積。Pb 處理的鉛元素在茶樹葉片細胞壁中含量最高，其次是在細胞質(zhì)和液泡內(nèi)的可溶性部分中，細胞器中含量相對較低；F1 和F4 組分占總量的72.98%。添加茶多酚后，鉛元素在茶樹葉片細胞壁中的含量升高，但與Pb處理相比差異不顯著，鉛元素在細胞器中的含量顯著減少，在細胞質(zhì)和液泡中的可溶性鉛含量也顯著減少；F1 和F4 組分占總量的78.90%。鉛脅迫下添加鈣離子，鉛元素在茶樹葉片細胞壁中的含量顯著高于Pb 和Pb+TP 處理；鉛元素在線粒體中的含量有所增加，顯著高于Pb+TP 處理，與Pb 處理差異不顯著；鉛元素在細胞質(zhì)和液泡中的含量顯著低于Pb處理，但顯著高于Pb+TP處理；F1和F4組分占總量的74.43%。

圖6 不同處理的茶樹葉片鉛亞細胞分布Figure 6 The subcellular distribution of lead in tea leaves under lead stress

圖7 茶樹葉片鉛的亞細胞分布Figure 7 The subcellular distribution of lead in tea leaves

3 討論

鉛脅迫下，茶樹葉片對鉛的吸收顯著增加，對鈣的吸收顯著降低，說明鉛脅迫對茶樹葉片吸收鈣具有一定的抑制作用，這與陳國梁等的研究結(jié)果一致。茶多酚加入后，茶樹葉片對鉛的吸收顯著降低，對鈣的吸收顯著增加。DUAN 等研究發(fā)現(xiàn)，土壤中添加茶多酚后，其與土壤中的鉛離子結(jié)合，使生物有效鉛轉(zhuǎn)化為有機鉛。周琪等的細胞實驗結(jié)果也表明，茶多酚可通過絡(luò)合作用來降低重金屬離子的生物毒性，提高細胞的生存率。茶多酚的加入使一部分鉛被絡(luò)合而鈍化，茶樹葉片吸收的鉛量顯著降低（圖1），鉛脅迫對鈣吸收的抑制作用減小，因此茶樹葉片吸收的鈣量相對增加。氯化鈣加入后，茶樹對鉛的吸收無顯著變化，但顯著增加了鈣的吸收。說明鈣離子的加入并不能抑制茶樹對鉛的吸收，只是增加了茶樹葉片對鈣離子的吸收利用。這可能是因為剛開始進行Pb+Ca 處理時茶樹葉片對鉛和鈣元素的吸收存在競爭機制，隨著培養(yǎng)時間的延長，植物細胞中鈣含量增加，植物細胞對鉛的抗性增加，細胞壁對鉛的容納能力增加，因此鉛的吸收總量會緩慢增加，最終Pb+Ca處理的茶樹葉片鉛含量與Pb 處理差異不顯著。薛艷等的研究發(fā)現(xiàn)鈣離子通道抑制劑顯著抑制了蘆蒿根部對鎘的吸收，但對鉛的吸收無顯著的抑制作用，可能是因為蘆蒿對鎘的吸收通過鈣離子通道進行，對鉛的吸收則不通過鈣離子通道進行。這與本研究的結(jié)果一致，說明茶樹葉片對鉛的吸收可能不是通過鈣離子通道進行。

鉛在茶樹葉片中的亞細胞分布情況與透射電鏡觀察的茶樹葉片細胞內(nèi)黑色沉積的部位較為一致，表明鉛脅迫下鉛元素主要分布在細胞壁和以液泡為主的細胞液中，這一結(jié)果與已有報道一致。細胞壁是外界物質(zhì)進入細胞的初始屏障，細胞壁中的負電荷基團與帶正電荷的重金屬離子絡(luò)合形成沉淀，減少了重金屬的運移。此外，細胞壁中的大分子物質(zhì)（果膠、纖維素和木質(zhì)素等）也對重金屬離子具有較強的絡(luò)合作用，可減少重金屬離子的跨膜運輸，降低細胞內(nèi)部重金屬離子的含量和濃度，保證了植物細胞能夠進行正常的生理代謝。鉛離子的半徑較大，配位能力較弱，不易透過細胞壁和質(zhì)膜進入細胞液，茶樹葉片細胞對鉛的吸收主要是通過細胞壁吸附和非共質(zhì)體沉積等方式，當(dāng)細胞壁的結(jié)合量達到飽和后鉛元素才開始透過細胞壁和質(zhì)膜進入細胞內(nèi)部，并與細胞液中的有機酸絡(luò)合，以減輕重金屬鉛對植物葉片細胞的毒害，因此鉛脅迫下液泡內(nèi)有大量鉛沉積。趙騰飛等研究發(fā)現(xiàn)鉛脅迫使小麥幼苗細胞的膜透性顯著增加，外源鈣使細胞的膜透性相對降低，使鉛對小麥幼苗細胞的毒害作用有所緩解。肖細元等通過研究砷脅迫下蜈蚣草對鈣的吸收指出，鈣在細胞中的含量增多并主要分布在細胞壁中，其增加了細胞壁的穩(wěn)定性，維持了細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，提高了蜈蚣草對砷脅迫的耐受力。茶樹葉片細胞壁中鉛的含量表現(xiàn)為Pb+Ca處理＞Pb+TP處理＞Pb處理，而鉛在細胞質(zhì)和液泡中的含量表現(xiàn)為Pb 處理＞Pb+Ca 處理＞Pb+TP 處理。在鉛脅迫下，茶樹葉片細胞壁對鉛的吸納值飽和后，因膜透性增加，鉛進入液泡中與有機酸絡(luò)合，以減輕鉛對細胞的毒害作用。茶多酚加入后，葉片中鈣含量顯著增加，細胞壁可以吸納較多的鉛元素，細胞膜透性相對降低，因而茶樹葉片細胞的液泡中鉛沉積減少。周琪等的研究也表明，抗氧化劑EGCG（茶多酚的主要成分）可以明顯緩解8種重金屬混合污染物對水生生物細胞的毒害作用。王萌等的研究表明，鈣肥能顯著提高毛桃果實內(nèi)的鈣含量，并增加果實細胞壁的強度。鉛脅迫下加入鈣離子，茶樹葉片鈣含量顯著高于Pb 和Pb+TP 處理，因為鈣離子使細胞壁強度增加，更多的鉛元素被固定在細胞壁中，細胞膜透性更低，鉛進入細胞液的量減少，液泡內(nèi)的鉛沉積顯著減少。蔣藝等研究發(fā)現(xiàn)，添加外源鈣后，旱柳根和葉各亞細胞組分中的鎘含量均顯著降低，且細胞液中鎘的比例有所增加，而細胞壁和細胞器組分中鎘的比例有所下降。這與本研究的結(jié)果不一致，可能是因為植株對鎘的吸收通過鈣離子通道進行，對鉛的吸收則不通過鈣離子通道進行，也可能歸因于植物品種、栽培環(huán)境及鈣水平的差異。

4 結(jié)論

（1）鉛脅迫顯著增加了茶樹葉片中鉛元素的含量，顯著降低了鈣元素的含量。鉛與茶多酚處理的茶樹葉片鉛元素含量顯著降低，鈣元素含量顯著增加；鉛與鈣離子處理對茶樹葉片鉛元素含量無顯著影響，但顯著增加了鈣元素的含量。

（2）鉛脅迫下，茶樹葉片表面和氣孔周圍褶皺增加，細胞內(nèi)部（主要在液泡中）鉛沉積顯著；茶多酚和鈣離子添加后茶樹葉片表面和氣孔周圍的褶皺程度減輕，鉛在細胞壁中的累積增加，在細胞質(zhì)和液泡內(nèi)的沉積減少。

（3）茶多酚主要通過鈍化鉛離子來減少鉛的吸收，降低鉛對茶樹葉片的毒害作用；鈣離子通過增加葉片對鈣的吸收，增強葉片細胞的強度和抗性，增加細胞壁對鉛的截留，減少鉛進入細胞內(nèi)部，降低鉛對茶樹葉片細胞的毒害作用。