先露露，董智，李紅麗，竇曉慧，劉超，劉冰倩，賈豐源

（山東農(nóng)業(yè)大學林學院/泰山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，山東 泰安 271018）

據(jù)2014 年生態(tài)環(huán)境部發(fā)表的土壤污染狀況調(diào)查公報，全國土壤環(huán)境狀況不容樂觀，耕地、林地、草地和未利用土地土壤點位超標率分別達到19.4%、10.0%、10.4%和11.4%，其中無機污染物中鎘（Cd）超標率最高，達到7.0%。重金屬Cd 具有隱蔽性強、生物毒性高、毒性持久、不可逆活性強等特點。Cd 不僅會對植物造成毒害作用，且極易通過食物鏈和富集作用進入人體，危害人體健康。

相關研究表明，低濃度Cd 對植物的生長有一定的促進作用，但高濃度Cd 會對植物產(chǎn)生毒害，使得植物表現(xiàn)出生長緩慢、植株矮小、葉片發(fā)黃卷曲、植物根系生長受阻等現(xiàn)象，且在生理方面表現(xiàn)出光合作用受阻、抗氧化系統(tǒng)被破壞、保護酶活性受抑制等危害。印度梨形孢（）是于印度西北部塔爾沙漠中發(fā)現(xiàn)的一種植物根系內(nèi)生真菌，具有促進植物地上部和根系的生長、增強養(yǎng)分吸收、提高宿主抗病性、增強植物對生物和非生物脅迫的抗性和耐受性等優(yōu)點。印度梨形孢在形態(tài)與功能上均與傳統(tǒng)的叢枝菌根真菌極為相似，不同之處在于，印度梨形孢可以在人工培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，而叢枝菌根真菌只能寄生于活體植物的根部。目前已有大量研究表明印度梨形孢通過強化植物對重金屬的轉運、富集及根系穩(wěn)定化過程來降低土壤重金屬污染程度，并通過促進營養(yǎng)物質的吸收利用、提高植物體內(nèi)的抗氧化水平、調(diào)控抗逆性相關基因的表達、根系排泄調(diào)控和改善根系微生物生態(tài)環(huán)境等方式提升寄主植物對重金屬的抗逆性。

高丹草（）具有生長速度快、根系發(fā)達、地上生物量大的特點，高丹草不僅具有耐貧瘠、耐鹽堿等優(yōu)良抗性，還被用于Cd污染土壤的修復研究，是在環(huán)境修復和資源開發(fā)利用方面具有廣闊應用前景的生態(tài)修復植物。但對高丹草和菌根共生效應的研究還較少，印度梨形孢對高丹草的作用機制尚不可知。

基于此，本研究擬通過水培實驗，探究印度梨形孢在不同Cd濃度（0、5、10、30、50、100 mg·L）下對高丹草幼苗生長和吸收積累重金屬的影響，分析印度梨形孢對重金屬Cd脅迫下高丹草生長和生理特性以及重金屬Cd在高丹草植物體內(nèi)轉運、富集和分布特征的影響，以期為印度梨形孢廣泛應用于植物抗逆性的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試草種高丹草為高粱與蘇丹草雜交的一年生草本植物。供試菌種印度梨形孢（，簡稱P）由山東省林業(yè)科學研究院提供，后于山東農(nóng)業(yè)大學林學院實驗室進一步培育使用。

1.2 試驗設計

試驗在山東農(nóng)業(yè)大學林學實驗站的溫室大棚內(nèi)進行。挑選顆粒飽滿的高丹草種子，用3%的次氯酸鈉浸泡20 min 后，用去離子水沖洗3 遍，再用70%乙醇消毒20 min，去離子水沖洗3 遍之后均勻播種到鋪滿蛭石的種植槽內(nèi)，待種子萌發(fā)生長一個月后進行移苗，挑選生長健壯和長勢一致的幼苗放入水中，緩慢沖洗掉蛭石，用定植棉固定移栽到含有1/2 霍格蘭營養(yǎng)液的水中，以5 株幼苗為一個樣，重復3 個樣，設置兩組處理，每組設置6 個Cd 濃度。水培生長一周后，待植株完全適應了水培環(huán)境，在接菌處理組（記作P+）的水培基質中加入印度梨形孢懸浮液，每升水含3 g印度梨形孢菌絲，對照組（記作P-）不做處理，2～3 d更換一次水和補加菌液。待印度梨形孢在植株體內(nèi)定殖25 d后，將根部有印度梨形孢定殖與未定殖的植株苗轉移到清水中，以營養(yǎng)液補充營養(yǎng)。而后加入重金屬標樣，使兩組培養(yǎng)液中Cd 濃度分別為0、5、10、30、50、100 mg·L，以未加重金屬的植株作為空白對照。

1.3 指標測定

待印度梨形孢在高丹草體內(nèi)定殖25 d后，使用臺盼藍染色法觀察印度梨形孢在高丹草體內(nèi)的定殖情況。Cd 脅迫7 d 后，用直尺測量株高，記錄葉片數(shù)和黃葉數(shù)，采集新鮮葉片測定生理指標。生理指標的測定均以鮮質量計，可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定；可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量采用蒽酮法測定；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定；過氧化物酶（Peroxidase，POD）含量采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶（Catalase，CAT）含量采用分光光度計法測定；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）含量采用NBT 光還原法測定。同步采集根莖葉樣本在105 ℃殺青，75 ℃烘干后記錄生物量，最后將各組織樣品粉碎過篩后用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）測定植物不同部位Cd含量，ICP分析條件參數(shù)設置為分譜線波長214.3 nm、射頻功率1 150 W、霧化器流速1.00 L·min、輔助器流速1.50 L·min、等離子體流速15.0 L·min。分別計算轉移系數(shù)和富集系數(shù)，計算公式如下：

轉移系數(shù)（transport factor，TF）=地上部Cd 含量/根部Cd含量

富集系數(shù)（biological concentration factor，BCF）=植物Cd含量/營養(yǎng)液Cd含量

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 個重復的平均值±標準差，采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 印度梨形孢在高丹草根系的定殖

印度梨形孢與高丹草共培養(yǎng)25 d后，印度梨形孢與高丹草成功定殖，且印度梨形孢的厚垣孢子主要集中在高丹草側根兩側和主根根端部分，通過圖1 可以看出，印度梨形孢在高丹草根部大量定殖，數(shù)量多且分布密集，二者成功建立共生關系。

圖1 高丹草根系侵染狀況（100×）Figure 1 Root infection status of S.Hybrid Sudangrass（100×）

2.2 印度梨形孢對高丹草生長的影響

不同Cd濃度下高丹草的生長狀況存在差異，低濃度（5 mg·L）處理下與CK 相一致，100 mg·L濃度下生長最差（圖2），而在同一Cd濃度處理下，接種印度梨形孢的高丹草生長狀況優(yōu)于不接種處理的（圖3）。

圖2 不同Cd濃度下高丹草的生長狀況Figure 2 The growth of S.Hybrid Sudangrass under different Cd concentrations

圖3 同一Cd濃度下高丹草不同處理的生長狀況Figure 3 Growth conditions of S.Hybrid Sudangrass under different treatments at the same Cd concentration

由表1 可知，隨著Cd 濃度的增加，高丹草不接菌組與接菌組葉片數(shù)和生物量無顯著差異（＞0.05），但整體生物量接菌組高于不接菌組，0、5、10、30、50、100 mg·L的Cd 濃度處理分別比對照組高17.85%、19.51%、0%、29.7%、10.61%、9.65%。隨著Cd 濃度的增加，高丹草接菌與不接菌組株高、葉片數(shù)、干質量降低，黃葉數(shù)增加。在0～30 mg·LCd 濃度下，兩組黃葉數(shù)差異不明顯（＞0.05），在高濃度50 mg·L和100 mg·L下，接菌組分別比對照組分別降低49.8%和42.2%，接菌顯著降低了高丹草的黃葉數(shù)。

表1 Cd脅迫與印度梨形孢接種對高丹草生長的影響Table 1 Effects of Cd stress and Piriformospora indica on the growth of S.Hybrid Sudangrass

2.3 印度梨形孢對Cd 脅迫下高丹草地上部抗性生理指標的影響

2.3.1 印度梨形孢對Cd 脅迫下高丹草滲透調(diào)劑物質的影響

由圖4 可知，隨著Cd 濃度的增加，高丹草接菌組與對照組可溶性蛋白含量先增加后降低，且在不同Cd濃度下，接菌組與對照組可溶性蛋白含量存在極顯著差異（＜0.01）。接菌提高了高丹草可溶性蛋白含量，在0、5、10 mg·L下，含量 分別 提高 了22.74%、57.59%、5.37%，在中高濃度30、50、100 mg·L下提高顯著，分別增加了110%、52%、351%，說明在高濃度下印度梨形孢通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質來改善細胞膜受損的效果顯著。

圖4 Cd脅迫和接種印度梨形孢對可溶性蛋白含量的影響Figure 4 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on soluble protein content

接菌組和未接菌組可溶性糖含量隨著Cd濃度的增加呈波動上升趨勢（圖5），且兩組可溶性糖含量存在顯著差異（100 mg·L除外）。在0、5、10、30、50 mg·L的Cd 濃度下，接菌組比對照組分別提高了33%、14.7%、6.9%、15.7%、29.2%，但在100 mg·LCd濃度下無顯著差異（＞0.05）。

圖5 Cd脅迫和接種印度梨形孢對可溶性糖含量的影響Figure 5 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on soluble sugar content

隨著Cd 濃度的增加，高丹草葉片丙二醛含量呈上升趨勢（圖6），在0、5、10、30、50 mg·LCd濃度下含量增加不顯著（＞0.05），在100 mg·LCd 脅迫下，丙二醛含量明顯上升，且接菌組植株含量低于未接菌組，在0、5、10、30 mg·L接菌組比未接菌組分別減少19.2%、15.8%、14%、21.7%。在50 mg·L接菌組比未接菌組增加14.2%，在100 mg·L又減少49.4%。說明高丹草在高濃度Cd 脅迫下，植株細胞膜透性受到嚴重傷害，接種印度梨形孢后緩解了Cd 對植物的傷害，增強了細胞膜透性。

圖6 Cd脅迫和接種印度梨形孢對丙二醛含量的影響Figure 6 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on malondialdehyde content

2.3.2 印度梨形孢對Cd脅迫下高丹草酶活性的影響

隨著Cd濃度的增加，兩組處理過氧化物酶活性呈遞減趨勢（圖7）。在無Cd脅迫處理（0 mg·L）下，接菌與不接菌組過氧化物酶活性無顯著差異（＞0.05），隨著Cd 濃度的增加，兩組之間存在極顯著差異（＜0.01），在5、10、30、50、100 mg·L濃度下，接菌后高丹草葉片過氧化物酶活性分別提高了1.51、0.24、1.21、0.42、1.6倍。

圖7 Cd脅迫和接種印度梨形孢對過氧化物酶活性的影響Figure 7 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on peroxidase activity

不同Cd 濃度處理下，高丹草接菌組與不接菌組超氧化物歧化酶活性呈先增加后降低趨勢（圖8）。在不接菌處理下，5、10、30、50、100 mg·LCd 脅迫下高丹草超氧化物歧化酶活性比不加Cd 處理（0 mg·L）分別增加了13.5%、37.8%、44.6%、22.3%、1.09%。接菌提高了高丹草葉片超氧化物歧化酶活性，在0、5、10 mg·LCd 濃度下增加不顯著（＞0.05），在30、50、100 mg·LCd 濃度下增加顯著（＜0.05），分別提高了12.1%、27.7%、10.94%。

圖8 Cd脅迫和接種印度梨形孢對超氧化物歧化酶活性的影響Figure 8 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on superoxide dismutase activity

隨著Cd濃度的增加，高丹草葉片過氧化氫酶活性先增加后降低（圖9）。在不同Cd濃度下，接菌組與不接菌組含量差異顯著（10、30 mg·L除外）。0、5、10、30、50、100 mg·LCd處理接菌組比不接菌組分別增加52.17%、30.3%、1.38%、17.7%、21.2%、47.05%。在Cd濃度為30 mg·L時含量達到最高，之后隨著濃度的增加過氧化氫酶活性降低，在100 mg·L時達到最低值。

圖9 Cd脅迫和接種印度梨形孢對過氧化氫酶活性的影響Figure 9 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on catalase activity

2.4 印度梨形孢對高丹草體內(nèi)Cd 的轉運、富集和分布特征的影響

由表2 可知，高丹草各組織對Cd 的積累和分配存在顯著差異（＜0.05）。高丹草體內(nèi)Cd 含量總體呈現(xiàn)出根＞葉＞莖的分布。在不接菌情況下，高丹草根、莖、葉中Cd 含量隨著濃度增加而增加，5、10、30、50、100 mg·L處理下高丹草根部Cd 含量比不加Cd分別增加15.25、54.5、105、328.25、560 倍。接菌后高丹草根部Cd 含量增加，在5 mg·L和30 mg·L濃度下，接菌組與不接菌組根部Cd 積累量差異明顯（＜0.05），接菌后分別增加了66.1%和75.11%，高Cd濃度（50、100 mg·L）下二者無明顯差異（＞0.05）。在5 mg·L和30 mg·LCd 濃度下接菌組和不接菌組莖部Cd 含量差異不顯著，在10、50、100 mg·LCd 濃度下，接菌組莖部Cd含量顯著低于不接菌組，分別減少了35.7%、42.2%、15.8%。在5、10、30、100 mg·LCd 濃度下，接菌顯著減少了葉片Cd 的積累，和不接菌相比，分別減少了16.7%、61.9%、42.1%、40.6%，在50 mg·LCd 時增加7.9%，可能是誤差引起。不同濃度和不同處理下高丹草富集系數(shù)呈波動變化，在5 mg·LCd 濃度下，接菌組比不接菌增加了33.6%，10 mg·LCd 濃度下降低10%，30 mg·LCd 濃度下增加50%，50～100 mg·LCd 濃度下降低1%～4%。不同處理和不同Cd 濃度下高丹草的轉移系數(shù)存在差異，且在不同Cd 濃度下，接菌組轉移系數(shù)顯著（＜0.05）低于對照組（50 mg·LCd 除外），0、5、10、30、50、100 mg·L處理下分別降低了81.5%、61.2%、39.5%、63%、22.2%、27.3%，說明隨著Cd 濃度的增加，高丹草由根部向地上部轉移Cd 的能力減弱，接菌后印度梨形孢將大部分Cd 聚集到植物根部，限制其向地上部轉移，從而減少Cd 在地上部的積累，減輕重金屬Cd對植物地上部的毒害。

表2 Cd脅迫和接種印度梨形孢對高丹草體內(nèi)Cd的轉運、富集和分布特征的影響Table 2 Effects of Cd stress and Piriformospora indica inoculation on the transport，enrichment and distribution characteristics of Cd in S.Hybrid Sudangrass

3 討論

Cd 影響植物的生長發(fā)育，對植物的生長表現(xiàn)出低促高抑的效果，不同物種和品種表現(xiàn)出不同的效果。當Cd 濃度超出植物所能承受的最大范圍時，植物則表現(xiàn)出植株矮小、生長緩慢、生物量下降甚至死亡。本研究結果表明，在低Cd 濃度下，高丹草能夠正常生長，葉片數(shù)和株高均有一定程度的增加，這與前人的研究結果相似。隨著Cd濃度的增加，高丹草的生長狀況變差，葉片發(fā)黃，積累的生物量減少，說明高濃度Cd 脅迫對高丹草產(chǎn)生明顯的毒害作用，這與前人的研究結果一致。接菌后高丹草黃葉數(shù)減少，生物量提高，葉片數(shù)增加，說明接種印度梨形孢后其生長狀況得到明顯改善，接菌緩解了Cd 對高丹草生長的抑制作用。

印度梨形孢提高了Cd脅迫下高丹草的抗性生理指標。植物在遭受Cd 脅迫時，積累的Cd 離子在植物體內(nèi)活動，導致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，破壞了體內(nèi)活性氧平衡，導致細胞氧化受損，從而抑制植物的生長，植物體內(nèi)的保護酶（過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等）通過改變自身活性來清除多余的活性氧，從而維護植株正常生長。NANDA 等對銅脅迫下決明子的研究表明，印度梨形孢通過增強超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的酶活性顯著改善了抗氧化防御系統(tǒng)。此外，除了增強保護參數(shù)外，它還降低了過氧化氫含量、脂質過氧化和DNA 損傷等破壞性參數(shù)。本研究結果表明，隨著Cd濃度增加，高丹草體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性先增加后降低，而過氧化物酶活性隨著Cd 濃度的增加而降低，說明高丹草主要通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性來抵抗Cd脅迫的傷害，在高濃度下，高丹草體內(nèi)的抗氧化酶的調(diào)節(jié)能力降低導致酶活性降低。接菌后過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性均有所提高，說明接種印度梨形孢能夠通過提高抗氧化酶活性來抵御不良環(huán)境。丙二醛、可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化能反映植物在逆境環(huán)境下生物膜的受損程度，丙二醛含量越高說明生物膜受損越嚴重。在本研究中，高丹草丙二醛和可溶性糖含量隨著Cd 濃度的增加而增加，可溶性蛋白先增加后降低，接菌降低了高丹草葉片中丙二醛含量，提高了可溶性糖和可溶性蛋白含量，說明隨著Cd濃度的上升，植物生物膜受損嚴重，接菌通過降低丙二醛含量，提高滲透調(diào)節(jié)物質來減輕Cd 對植物生物膜的損傷，這與前人有關印度梨形孢接種和Cd脅迫下植物生理響應的研究結果一致。

YAGHOUBIAN 等研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢在0～100 mg·L的Cd溶液中具有較高的去除效率，且濃度的增加會抑制印度梨形孢對Cd的積累。印度梨形孢細胞壁能夠吸附重金屬，通過將重金屬固定在植物根系的表皮層和皮層，降低了對根系皮層細胞的損害，減少了重金屬進入中柱細胞，從而減少了植物通過維管束將重金屬向地上部的運輸。SALEH 等對向日葵的研究表明，在Cd 脅迫下接種印度梨形孢通過向根部積累更多的Cd以減少重金屬向植物地上部的移動。也有對決明子的研究表明，印度梨形孢通過抑制銅從根部向地上部轉移，減輕了銅對決明子的毒害作用。本研究中，Cd 在高丹草不同部位的積累呈根＞葉＞莖的分布，在不同Cd 濃度下，高丹草接種印度梨形孢后和未接菌相比地下部Cd 含量增加，地上部Cd含量降低，轉移系數(shù)也降低，這說明印度梨形孢通過將大部分Cd 離子固定在植物的根部，從而減少了向高丹草地上部的轉移，減輕了Cd對高丹草的毒害，提高了高丹草的耐性。

綜上，在Cd 脅迫下添加印度梨形孢菌劑通過促進高丹草根系對Cd 的吸收和累積，抑制重金屬Cd 向地上部的轉移，減輕膜過氧化損傷，調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質和提高抗氧化酶活性來減輕Cd對高丹草生長的抑制作用和毒性損傷。印度梨形孢具有環(huán)保、高效且容易在體外繁殖等優(yōu)點，具有巨大的應用前景。在重金屬污染地區(qū)的生態(tài)恢復中可考慮采用印度梨形孢和植物共生的互作體系，但生長條件與環(huán)境因子均會對印度梨形孢與植物互作產(chǎn)生影響。印度梨形孢與宿主植物的互作機制，印度梨形孢提高宿主植物抗逆性相關基因的表達，以及高質量菌劑和生物菌肥的生產(chǎn)等均有待進一步的研究。

4 結論

（1）低濃度（5 mg·L）Cd 對高丹草的生長具有促進作用。隨著濃度的增加，高丹草株高、葉片數(shù)減小，生物量降低，黃葉數(shù)增加，生長受到抑制，接種印度梨形孢后能夠促進高丹草生物量的積累，緩解葉片發(fā)黃現(xiàn)象，改善生長狀況。

（2）接種印度梨形孢提高了Cd 脅迫下高丹草的抗性生理指標。隨著Cd 濃度的增加，高丹草未接菌組的可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性總體上逐漸升高，過氧化物酶活性逐漸降低。接種印度梨形孢提高了可溶性蛋白、可溶性糖含量以及酶活性，降低了丙二醛含量。印度梨形孢通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質和提高抗氧化酶活性來抵御Cd脅迫對高丹草的傷害。

（3）不同Cd 濃度條件下，高丹草體內(nèi)Cd 含量分布呈根＞葉＞莖，且含量隨著Cd濃度增加而增加，接種印度梨形孢后高丹草地下部Cd 含量增加，地上部Cd含量降低，接種印度梨形孢減少了Cd 從地下部向地上部的轉移，減輕了Cd對高丹草地上部的毒害。