李興國(guó)，律澤*，張馳，王剛

（1.沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110168；2.遼寧省易派環(huán)保職業(yè)培訓(xùn)學(xué)校，沈陽(yáng) 110033）

吐納麝香（AHTN）因其氣香濃郁且持久，作為定香調(diào)香的香料，廣泛應(yīng)用于高檔香水、化妝品和洗衣液等日用化工品中。化妝品工廠和居民日常洗滌廢水排放至城市污水處理廠處理后，通過(guò)污水灌溉和污泥返田，進(jìn)入土壤環(huán)境并不斷累積，使其在土壤中的含量越來(lái)越高。目前發(fā)現(xiàn)污水處理廠所排放的污泥中AHTN 最大含量為169.284 mg·kg；AHTN 在廣東省污水處理廠干質(zhì)量污泥中含量為4 498 μg·kg，BESTER檢測(cè)德國(guó)一家污水處理廠的進(jìn)水和污泥中AHTN 濃度發(fā)現(xiàn)，進(jìn)水濃度約為580 ng·L，污泥中含量為1 500 ng·L，REINER 等檢測(cè)美國(guó)兩家污水處理廠進(jìn)水和污泥中AHTN 濃度，發(fā)現(xiàn)其在廢水中的最大濃度高達(dá)2 590 ng·L，在污泥中其最大含量為16.8 mg·kg。由于AHTN在環(huán)境中難以被快速降解，含量日益升高，且AHTN 具有易生物富集特性，持續(xù)暴露于土壤環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境的威脅越來(lái)越大。AHTN 不僅能加快人體乳腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散，并且具有雌激素作用。此外，AHTN 導(dǎo)致人血清白蛋白功能受損，二者之間相互作用可能影響蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和活性。蚯蚓在一定濃度的AHTN 環(huán)境中生存，會(huì)促進(jìn)其體內(nèi)金屬硫蛋白和谷胱甘肽的合成，表明AHTN 會(huì)對(duì)土壤環(huán)境造成潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。水體中的AHTN 濃度會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致斑馬貽貝的氧化和遺傳損傷，并且在暴露于高濃度AHTN 時(shí)會(huì)導(dǎo)致原發(fā)性遺傳損傷。

土壤重金屬污染毒性強(qiáng)、分布廣、治理難，具有生物累積性。當(dāng)其進(jìn)入到土壤環(huán)境中，土壤微生物難以將其快速降解，在土壤中蓄積造成污染，改變土壤條件，使土壤肥力下降，土壤生態(tài)環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞。且因其強(qiáng)生物富集特性，對(duì)農(nóng)作物造成影響，經(jīng)食物鏈危害人體健康。2020 年我國(guó)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)土壤污染狀況詳查顯示，重金屬污染是導(dǎo)致農(nóng)田土地質(zhì)量下降的主要原因，其中Cd 排在首位。重金屬均具有較強(qiáng)的生物毒性，Cd 更是世界公認(rèn)的毒性最強(qiáng)的重金屬之一。最近的調(diào)查顯示，我國(guó)城市污泥中重金屬Cd 的最大含量為10.5 mg·kg，且在華北平原污灌區(qū)13 m 深的土壤中檢測(cè)到Cd 的含量高達(dá)3.8 mg·kg。

污水灌溉和污泥回用是AHTN 和Cd 進(jìn)入到土壤環(huán)境的共同途徑，長(zhǎng)時(shí)間累積會(huì)造成土壤污染，因此土壤中二者復(fù)合污染較為普遍。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)AHTN 與Cd 復(fù)合污染的研究主要集中在陸生生物，對(duì)于二者復(fù)合污染對(duì)土壤微生物的影響研究較少。AHTN 與Cd 通過(guò)在小麥片葉和根系中產(chǎn)生活性氧脅迫，對(duì)小麥造成氧化性損傷。WANG 等研究了AHTN 與Cd 聯(lián)合暴露對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的影響。土壤酶和土壤微生物影響植物生長(zhǎng)所需養(yǎng)分的吸收，能夠敏感地反映土壤環(huán)境變化，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用。為探究AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤微生物生態(tài)毒理作用機(jī)理，本研究采用平板菌落計(jì)數(shù)和熒光定量qPCR，測(cè)定AHTN 與Cd 單一及復(fù)合污染下土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量變化及土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性變化，并研究了復(fù)合污染對(duì)微生物數(shù)量和酶活性的聯(lián)合毒性效應(yīng)，為評(píng)價(jià)AHTN 的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集于遼寧省沈陽(yáng)市石佛寺灌渠渠首（42°8.611′N，123°20.705′E），取農(nóng)用地上層（0～20 cm）的新鮮土壤，現(xiàn)場(chǎng)處理后帶回實(shí)驗(yàn)室。具體土壤理化性質(zhì)如下：土壤類型為棕壤，pH 為5.92，含水量為15.32%，有機(jī)質(zhì)含量2.48%，速效氮含量38 mg·kg，速效鉀含量158 mg·kg，有效磷含量17.5 mg·kg，AHTN含量16.45 μg·kg，Cd含量0.68 mg·kg。

1.2 供試藥品

吐納麝香（AHTN）購(gòu)自上海源葉生物科技公司，純度為95%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤染毒試驗(yàn)

稱取1.18 kg 過(guò)2 mm 篩土壤（相當(dāng)于1 kg 干土）于塑料花盆中，定期澆水，保持土壤水分，使用透氣膜將其密封，防止發(fā)生蒸騰作用而減少水分，也防止細(xì)菌等雜質(zhì)進(jìn)入。土壤在恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）預(yù)培養(yǎng)7 d。試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)AHTN 含量，分別為0、100、500 mg·kg和1 000 mg·kg，2 個(gè)Cd 含量，分別為0、10 mg·kg，共8 個(gè)處理組。每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)平行試驗(yàn)，共24個(gè)樣本。采用土壤暴露法進(jìn)行染毒。

1.3.2 盆栽試驗(yàn)

將染毒土樣充分?jǐn)嚢杌旌?，待丙酮完全揮發(fā)后，將穩(wěn)定后的土壤均勻置入花盆內(nèi)，將龍葵種子播種其中，共種植24盆。當(dāng)龍葵高度約2 cm時(shí)定苗，最終每盆保留6 株生長(zhǎng)趨勢(shì)相同的幼苗?；ㄅ柙谑彝怆S機(jī)放置80 d，挪動(dòng)花盆位置使其發(fā)生不規(guī)則變化。不定期澆水，土壤水分恒定保持為田間持水量的60%。

1.3.3 樣品采集與處理

每隔20 d（1、20、40、60 d和80 d）進(jìn)行一次土壤樣品采樣，共采樣5次，樣品采自表層土壤下深度約為3 cm處根周土壤，并測(cè)定其微生物數(shù)量以及土壤酶活性。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 土壤微生物測(cè)定方法

（1）微生物測(cè)定

采用固體平板稀釋涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，細(xì)菌、真菌和放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）微生物總數(shù)測(cè)定

微生物總數(shù)的測(cè)定采用熒光qPCR 法。DNA 提?。菏褂肍ast DNA-SPIN KitForSoil 試劑盒，從0.5 g土壤中提取基因組DNA，并將其溶于50 μL 水中，保存溫度為-20 ℃。測(cè)定基因的拷貝數(shù)：采用熒光定量qPCR 測(cè)定細(xì)菌16S rRNA、真菌18S rRNA 和放線菌特異基因的拷貝數(shù)（以單位質(zhì)量干土計(jì)）。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中的基因拷貝數(shù)根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算后，換算成每克干土的基因拷貝數(shù)。

1.4.2 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性分別采用苯酚鈉法、3，5-二硝基水楊酸法和對(duì)硝基酚比色法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

菌種/酶活性抑制率計(jì)算公式：

抑制率=（對(duì)照-處理）/對(duì)照×100%

AHTN和Cd復(fù)合污染作用模式方程：

式中：（）為理論預(yù)測(cè)抑制率，%；為AHTN 引起的抑制率，%；為Cd 引起的抑制率，%。（）為實(shí)際檢測(cè)的抑制率（%），對(duì)（）和（）進(jìn)行差異顯著性分析，若檢測(cè)值（）大于預(yù)測(cè)值（），則二者聯(lián)合作用模式顯著的為協(xié)同作用，反之，顯著的為拮抗作用。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS 7.5 進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，利用Turkey多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。顯著性水平和極顯著水平分別為＜0.05 和＜0.01。采用Origin 8.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中微生物數(shù)量的影響

分別以時(shí)間T（1、20、40、60 d 和80 d）、污染物Cd濃度（0、10 mg·kg）和污染物AHTN 濃度（0、100、500 mg·kg和1 000 mg·kg）為研究因子，通過(guò)土壤細(xì)菌、真菌和放線菌活性抑制率的三因素方差分析，分析各個(gè)因子的主效應(yīng)，研究一階交互效應(yīng)和二階交互效應(yīng)對(duì)土壤微生物的影響。不同濃度的AHTN 與Cd 單一、復(fù)合污染處理對(duì)土壤細(xì)菌、真菌和放線菌活性抑制率的影響均達(dá)到極顯著水平，土壤微生物抑制率隨處理時(shí)間的變化也極顯著（＜0.01）。

2.1.1 對(duì)土壤中細(xì)菌的影響

如圖1 所示，AHTN 單一污染顯著抑制土壤中的細(xì)菌數(shù)量，抑制率隨AHTN 濃度的增加而增加。100 mg·kgAHTN 對(duì)細(xì)菌抑制率變化范圍為24.14%～52.04%；500 mg·kgAHTN 對(duì)土壤細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)量抑制率變化范圍為43.66%～69.07%；1 000 mg·kgAHTN對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量抑制率變化范圍為58.50%～88.69%。

圖1 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中細(xì)菌數(shù)量抑制率影響Figure 1 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of bacteria in soil

AHTN 與Cd 復(fù)合污染與AHTN 單一污染對(duì)細(xì)菌的影響一致，均表現(xiàn)顯著抑制作用，即隨著AHTN 濃度增加，其對(duì)細(xì)菌抑制率也增加。100 mg·kgAHTN與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌抑制率為48.56%～73.76%；500 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌抑制率為22.69%～76.55%；1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌抑制率為61.30%～89.20%。Cd 單一污染顯著抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，其抑制率為24.05%～48.43%。AHTN與Cd 單一、復(fù)合污染對(duì)土壤中細(xì)菌均表現(xiàn)為顯著抑制作用。

在第40天時(shí)，100、500、1 000 mg·kgAHTN 單一污染對(duì)細(xì)菌抑制率分別為41.59%、65.67%、88.69%，與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌抑制率分別為73.76%、76.55%、89.20%；在第80 天時(shí)，100、500、1 000 mg·kgAHTN單一污染對(duì)細(xì)菌的抑制率分別為24.14%、56.80%、85.57%，與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌的抑制率分別為52.72%、65.96%、86.48%，AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)細(xì)菌的抑制率大于其對(duì)應(yīng)濃度AHTN單一污染。

2.1.2 對(duì)土壤中真菌的影響

如圖2 所示，AHTN 單一污染下，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN 在前60 d 對(duì)土壤中的真菌產(chǎn)生促進(jìn)作用，其抑制率分別為-12.75%～-35.32%和-6.51%～-64.36%，1 000 mg·kgAHTN對(duì)真菌表現(xiàn)出抑制作用，其抑制率為12.75%～72.05%。

如圖2 所示，100 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染促進(jìn)土壤中的真菌生長(zhǎng)，其抑制率在-6.38%～-71.33%，500 mg·kg和1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤中的真菌產(chǎn)生抑制作用，其抑制率為6.38%～51.39%和28.27%～68.58%。Cd 單一污染對(duì)真菌表現(xiàn)為抑制作用，其抑制率為17.82%～47.82%。

圖2 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中真菌數(shù)量抑制率影響Figure 2 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of fungi in soil

對(duì)于土壤真菌，100、500 mg·kgAHTN 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)其生長(zhǎng)由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制，而1 000 mg·kgAHTN 與Cd 單一、復(fù)合污染顯著抑制其生長(zhǎng)。隨著AHTN濃度增加，AHTN單一及與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤真菌生長(zhǎng)逐漸從促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种啤?/p>

2.1.3 對(duì)土壤中放線菌的影響

如圖3 所示，AHTN 單一污染下，3 種濃度AHTN均顯著抑制土壤中放線菌生長(zhǎng)，100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制程度分別為9.98%～24.50%、15.04%～47.28%、29.49%～56.24%，表明AHTN 濃度越高，抑制程度越嚴(yán)重。

圖3 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中放線菌數(shù)量抑制率影響Figure 3 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of actinomyces in soil

AHTN 與Cd 復(fù)合污染顯著抑制了土壤放線菌的生長(zhǎng)，100、500、1 000 mg·kgAHTN與Cd復(fù)合污染對(duì)其抑制率分別為12.29%～52.74%、23.53%～65.05%、37.82%～70.14%，抑制效果隨著AHTN 濃度的增加而增強(qiáng)。Cd 單一污染對(duì)其抑制率為8.19%～63.19%，顯著抑制其生長(zhǎng)。AHTN 與Cd 單一、復(fù)合污染均顯著抑制土壤中放線菌生長(zhǎng)。

不同濃度AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌的抑制率大于其對(duì)應(yīng)濃度AHTN單一污染（第1天除外）。

2.1.4 對(duì)微生物基因拷貝數(shù)的影響

（1）細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)

方差分析結(jié)果表明，與CK 相比，1 000 mg·kgAHTN 單 一 處 理 及100、500、1 000 mg·kg的AHTN 與Cd 復(fù)合污染的細(xì)菌基因拷貝數(shù)表現(xiàn)出顯著差異（＜0.05），對(duì)細(xì)菌均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，分別高于CK組65.75%、51.26%、64.14%、82.76%（圖4），表明細(xì)菌拷貝數(shù)隨著AHTN濃度的升高而增加。

（2）真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)

方差分析結(jié)果表明，與CK 相比，除500 mg·kgAHTN單一、1 000 mg·kgAHTN單一及與Cd復(fù)合污染外，真菌基因拷貝數(shù)顯著升高（＜0.05），表現(xiàn)為促進(jìn)作用（圖4）。真菌基因拷貝數(shù)隨著AHTN濃度升高而增加。

（3）放線菌基因拷貝數(shù)

方差分析結(jié)果表明，與CK 相比，AHTN 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌基因拷貝數(shù)表現(xiàn)出顯著差異（＜0.05），對(duì)放線菌表現(xiàn)為抑制作用。100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制率分別為38.46%、50.01%、54.81%，Cd 單一污染抑制率為26.92%，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染抑制率分別為60.38%、75.19%、77.12%（圖4），放線菌基因拷貝數(shù)隨著AHTN濃度升高而減少。

圖4 AHTN與Cd污染對(duì)土壤微生物基因拷貝數(shù)的影響Figure 4 The influence of AHTN and Cd contamination on the copy number of soil microorganisms gene

2.2 AHTN與Cd污染對(duì)土壤酶活性的影響

分別以時(shí)間T（1、20、40、60、80 d）、污染物Cd 濃度（0、10 mg·kg）和污染物AHTN 濃度（0、100、500、1 000 mg·kg）為研究因子，進(jìn)行土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性抑制率的三因素方差分析，分析各個(gè)因子的主效應(yīng)，研究一、二階交互效應(yīng)對(duì)土壤酶活性的影響。不同濃度的AHTN 與Cd 單一、復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性抑制率的影響均達(dá)到極顯著水平，土壤微生物抑制率隨處理時(shí)間的變化也極顯著（＜0.01）。

2.2.1 對(duì)土壤中脲酶活性的影響

如圖5 所示，AHTN 單一污染對(duì)土壤脲酶表現(xiàn)為抑制作用，100 mg·kgAHTN 在處理周期（1、20、40、60、80 d）內(nèi)的抑制率分別為5.36%、25.10%、43.81%、21.58%、11.71%；500 mg·kgAHTN 的抑制率分別為15.55%、27.86%、50.69%、33.88%、38.07%；1 000 mg·kgAHTN 的抑制率分別為26.46%、33.03%、61.34%、62.52%、73.31%。

圖5 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中脲酶活性抑制率的影響Figure 5 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of urease activities in soil

100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染在第1天促進(jìn)土壤脲酶活性，其抑制率分別為-162.02%、-165.07%和-36.49%，而在其余時(shí)間均表現(xiàn)為抑制作用，100 mg·kgAHTN與Cd復(fù)合污染在其余時(shí)間（20、40、60、80 d）的 抑 制 率 分 別 為2.10%、50.43%、50.58%、15.18%；500 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染的抑制率分別為33.96%、71.21%、55.86%、22.09%；1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染的抑制率分別為46.16%、73.53%、57.82%、27.56%。可以看出，在第40天時(shí)，復(fù)合污染抑制率達(dá)到最大值，這表明復(fù)合污染此時(shí)毒性達(dá)到最大。Cd 單一污染對(duì)土壤脲酶活性作用為先抑制后促進(jìn)，1、20、40、60、80 d 抑制率分別為9.05%、-19.36%、-30.54%、-44.03%、-48.83%。

在第40天時(shí)，100、500、1 000 mg·kgAHTN單一污染對(duì)土壤脲酶的抑制率分別為43.81%、50.69%、61.34%，與Cd 復(fù)合污染的抑制率分別為50.43%、71.72%、73.53%，抑制作用隨AHTN 濃度升高而增強(qiáng)，且二者復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶的抑制率大于其對(duì)應(yīng)濃度AHTN單一污染的。

AHTN 單一及與Cd 復(fù)合污染均顯著抑制土壤脲酶活性（第1天除外）。

2.2.2 對(duì)土壤中酸性磷酸酶活性的影響

如圖6 所示，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN單一污染對(duì)土壤酸性磷酸酶表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其在1、20、40、60、80 d 抑制率分別為-69.99%、-5.24%、-90.85%、-21.05%、-15.79% 和-22.69%、-23.87%、-47.60%、-29.22%、-1.31%，1 000 mg·kgAHTN 單一污染對(duì)土壤酸性磷酸酶在第1 天和第20 天時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其抑制率為-2.93%和-23.00%，40、60、80 d 時(shí)轉(zhuǎn)為抑制作用，抑制率分別為12.35%、44.21%和60.36%。

如圖6 所示，對(duì)于土壤酸性磷酸酶，100 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染顯著促進(jìn)其活性，在1、20、40、60、80 d抑制率分別為-29.20%、-25.63%、-9.80%、-4.68%、-5.23%，500 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染在1、20、40 d 促進(jìn)其活性，其抑制率分別為-38.32%、-3.11%、-18.20%，第60 天和第80 天轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?，抑制率分別為41.64%和11.44%；土壤酸性磷酸酶活性在1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染下受到顯著抑制，在1、20、40、60、80 d 抑制率分別為5.21%、7.42%、12.35%、43.93%、43.05%。Cd 單一污染僅在80 d表現(xiàn)為抑制作用，其余時(shí)間為促進(jìn)作用。

圖6 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中酸性磷酸酶活性抑制率的影響Figure 6 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of acid phosphatase in soil

100、500 mg·kgAHTN 單一污染和100 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染能夠促進(jìn)土壤酸性磷酸酶活性，500 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染與1 000 mg·kgAHTN 單一污染表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染始終表現(xiàn)為抑制作用。隨著AHTN濃度增加，AHTN單一及與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤酸性磷酸酶活性均為先促進(jìn)后抑制。

2.2.3 對(duì)土壤中蔗糖酶活性的影響

如圖7 所示，與對(duì)照組CK 相比，AHTN 單一污染在第1 天對(duì)蔗糖酶表現(xiàn)為促進(jìn)作用，100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制率分別為-201.72%、-72.31%、-56.78%；在其他時(shí)間表現(xiàn)為抑制土壤蔗糖酶活性，20、40、60 d 和80 d，100 mg·kgAHTN 對(duì)其抑制率分別為39.09%、10.60%、34.99%和36.63%，500 mg·kgAHTN 對(duì)其抑制率分別為34.66%、21.19%、51.35%和53.10%，1 000 mg·kgAHTN 對(duì)其 抑制率 分別 為27.85%、40.22%、64.31%和63.03%。

圖7 AHTN與Cd污染對(duì)土壤中蔗糖酶活性抑制率的影響Figure 7 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of invertase in soil

如圖7 所示，在第1 天，AHTN 與Cd 復(fù)合污染促進(jìn)土壤蔗糖酶活性，之后均顯著抑制，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染在第1 天的抑制率分別為-87.98%、-89.80%、-38.43%；在20、40、60、80 d，100 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)其抑制率分別為65.41%、23.36%、44.06%、42.81%，500 mg·kgAHTN對(duì)其抑制率分別為71.83%、30.82%、51.51%、53.35%，1 000 mg·kgAHTN 對(duì)其抑制率分別為77.13%、40.58%、65.40%、66.84%。Cd單一污染顯著抑制了其活性（第1 天除外）。3 種濃度AHTN 與Cd 復(fù)合污染均在20 d 時(shí)達(dá)到抑制率的最大值，表明復(fù)合污染在20 d時(shí)對(duì)蔗糖酶毒性最大。

對(duì)于土壤蔗糖酶，AHTN 與Cd 復(fù)合污染與AHTN單一污染作用效果相似，即在第1 天促進(jìn)蔗糖酶活性，在其他時(shí)間抑制蔗糖酶活性。AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶抑制率大于AHTN 單一污染（第1天除外）。

2.3 AHTN與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤微生物的聯(lián)合效應(yīng)

如表1所示，AHTN 與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤中細(xì)菌抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），說(shuō)明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤細(xì)菌聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用。

表1 不同時(shí)間下AHTN與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤微生物數(shù)量抑制率預(yù)測(cè)值和檢測(cè)值的比較Table 1 Comparison of predicted and detected values of inhibition rate of soil microbial population by AHTN and Cd combined pollution under different time

100 mg·kg和1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤中真菌抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），說(shuō)明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤真菌聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用。500 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤中真菌抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著高于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），說(shuō)明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤真菌聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同作用。AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤中放線菌抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），說(shuō)明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤放線菌聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用（40 d時(shí)500 mg·kg除外）。

2.4 AHTN與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤酶活性的聯(lián)合效應(yīng)

如表2 所示，AHTN 與Cd 復(fù)合污染在第1 天時(shí)對(duì)土壤脲酶活性抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），20 d以后土壤脲酶活性抑制率的實(shí)測(cè)值（）均顯著高于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05）。通過(guò)比較預(yù)測(cè)值（）與實(shí)測(cè)值（），表明AHTN 與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)在第1 天表現(xiàn)為拮抗作用，20 d以后均為協(xié)同作用。

表2 不同時(shí)間下AHTN與Cd復(fù)合污染對(duì)土壤酶活性抑制率預(yù)測(cè)值和檢測(cè)值的比較Table 2 Comparison of predicted and detected values of soil enzyme activity inhibition rate by AHTN and Cd combined pollution under different time

對(duì)土壤酸性磷酸酶，在前60 d，AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)其抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著高于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05）（第1 天除外）；80 d 時(shí)，實(shí)測(cè)值（）均顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05）。根據(jù)預(yù)測(cè)值（）與實(shí)測(cè)值（）比較，可知AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤酸性磷酸酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)60 d 前表現(xiàn)為協(xié)同作用（第1天除外），在80 d表現(xiàn)為拮抗作用。

在1 d 時(shí)，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶活性抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著高于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），表明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同作用，在40、60 d 和80 d 時(shí)，對(duì)土壤蔗糖酶活性抑制率的實(shí)測(cè)值（）顯著低于預(yù)測(cè)值（）（＜0.05），表明AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用。比較預(yù)測(cè)值（）與實(shí)測(cè)值（），可知AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)在第1 天表現(xiàn)為協(xié)同作用，40 d 后轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓棺饔谩?/p>

3 討論

本研究中，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN 單一污染及其與Cd復(fù)合污染促進(jìn)土壤中的細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)。其原因是微生物在AHTN 與Cd 暴露下，逐漸適應(yīng)了外來(lái)污染物，在此條件下，微生物具有降解有機(jī)物的能力，通過(guò)與氧結(jié)合一系列催化反應(yīng)，形成環(huán)氧化合物，再水解轉(zhuǎn)化為微生物自身個(gè)體生長(zhǎng)所需的碳源和能量。在此“刺激”后，酶活性增加，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)發(fā)育。當(dāng)環(huán)境中AHTN 濃度過(guò)高時(shí)，即使微生物能夠通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)和抵抗AHTN 的脅迫，但其各方面生長(zhǎng)代謝過(guò)程均受到影響，生理生命活動(dòng)受到抑制，導(dǎo)致其數(shù)量下降。本研究中AHTN 單一及其與Cd 復(fù)合污染顯著抑制了土壤放線菌生長(zhǎng)，與佳樂(lè)麝香和Cd單一、復(fù)合處理對(duì)土壤放線菌作用一致，AHTN 與佳樂(lè)麝香結(jié)構(gòu)相似，其存在可能降低放線菌體內(nèi)某種轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，使有害物質(zhì)貯存在放線菌體內(nèi)，抑制放線菌生長(zhǎng)。

沈國(guó)清等研究發(fā)現(xiàn)，菲和Cd 復(fù)合污染抑制了蔗糖酶的活性，閆雷等研究發(fā)現(xiàn)土霉素與Cd 復(fù)合污染也抑制了蔗糖酶活性，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本研究中，AHTN 單一及與Cd復(fù)合污染在第1天均促進(jìn)了土壤蔗糖酶活性，長(zhǎng)期暴露后抑制了其活性。Cd 能刺激土壤蔗糖酶，加速底物的配位結(jié)合，進(jìn)而加快了酶催化反應(yīng)，促進(jìn)蔗糖酶活性，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，Cd可能占據(jù)酶分子活性中心或結(jié)合酶分子的活性部位，導(dǎo)致酶活性降低。此外AHTN 是一種典型疏水有機(jī)物，與多環(huán)芳烴具有一定的相似性，能夠以被動(dòng)擴(kuò)散的方式通過(guò)植物細(xì)胞膜，且有助于重金屬Cd 進(jìn)入細(xì)胞，提高了Cd的生物有效性。此外，蔗糖酶能提高易溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在土壤中的含量，AHTN 因其疏水性導(dǎo)致溶解較少，土壤對(duì)AHTN 的吸附固定增加，蔗糖酶活性受到抑制。律澤研究發(fā)現(xiàn)佳樂(lè)麝香與Cd復(fù)合污染在前2 周促進(jìn)土壤脲酶活性，之后轉(zhuǎn)為顯著抑制作用，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本研究中AHTN 單一及與Cd 復(fù)合污染顯著抑制土壤脲酶活性。劉慧君等研究發(fā)現(xiàn)酰胺類除草劑使脲酶活性部位構(gòu)象發(fā)生變化，二者發(fā)生結(jié)合作用，形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，抑制了脲酶的活性，AHTN 與脲酶分子之間可能也存在此種作用機(jī)制。WANG 等研究了丁草胺與鎘復(fù)合污染對(duì)土壤磷酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)兩種污染物對(duì)土壤酸性磷酸酶的活性影響取決于土壤中兩種污染物濃度配比，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，不同濃度的AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤酸性磷酸酶表現(xiàn)出不同的作用，100、500 mg·kgAHTN 單一污染和100 mg·kgAHTN 與Cd 復(fù)合污染促進(jìn)土壤酸性磷酸酶活性，500 mg·kgAHTN與Cd 復(fù)合污染與1 000 mg·kgAHTN 單一污染對(duì)其活性由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制，1 000 mg·kgAHTN與Cd復(fù)合污染抑制其酶活性。該結(jié)果符合周啟星等提出的復(fù)合污染作用機(jī)理與污染物的種類及濃度組合、污染物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、污染時(shí)間以及生物種類等多種因素直接相關(guān)的理論。

AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶聯(lián)合毒性效應(yīng)結(jié)果不一致的原因可能是受試生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在差異，對(duì)各類化合物的敏感性不同，脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶分別對(duì)土壤中氮、有機(jī)磷、有機(jī)質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化敏感，應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期暴露的污染物所產(chǎn)生的生理活動(dòng)也不同，且耐受性存在差別，因此復(fù)合污染后對(duì)其聯(lián)合毒性作用也不盡相同。本研究中，AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶活性聯(lián)合毒性效應(yīng)在第1 天表現(xiàn)為拮抗作用，20 d 以后均為協(xié)同作用，該結(jié)果與陳芳等的研究結(jié)果一致，其原因可能是在暴露初期，有機(jī)物和重金屬相結(jié)合，降低了重金屬在環(huán)境中毒性，表現(xiàn)為拮抗作用，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，二者復(fù)合污染破壞了生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，AHTN 與佳樂(lè)麝香具有相似結(jié)構(gòu)，均為脂溶性化合物，能擾亂細(xì)胞膜功能，使其逐漸喪失抵御外來(lái)物質(zhì)的能力，使污染物更容易進(jìn)入微生物細(xì)胞，抑制微生物的生長(zhǎng)，并且AHTN 還會(huì)擾亂生物體的防御系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)重金屬鎘的毒性。此外，AHTN 能夠抑制外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，降低細(xì)胞對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)的抵御能力，繼而加劇外源物質(zhì)的毒性，使聯(lián)合毒性效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同作用。胡著邦等對(duì)Cd 與芐嘧磺隆復(fù)合污染的研究結(jié)果表明，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物生物量氮先上升后下降，聯(lián)合效應(yīng)由協(xié)同作用轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓棺饔茫琈OREAU 等認(rèn)為，菲對(duì)Zn 的拮抗作用可能是因?yàn)榉聘淖兞巳苊阁w膜的穩(wěn)定性及功能，從而影響了溶酶體解除Zn毒害的作用。本研究酸性磷酸酶和蔗糖酶聯(lián)合毒性也由協(xié)同作用轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓棺饔?，可能是AHTN 也產(chǎn)生了相似作用，激活某種物質(zhì)影響了Cd的毒害作用。因此對(duì)于本研究中AHTN和Cd復(fù)合污染聯(lián)合毒性效應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

（1）平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表明，AHTN 與Cd 單一、復(fù)合污染對(duì)土壤中細(xì)菌表現(xiàn)為顯著抑制作用；隨著AHTN 濃度增加，對(duì)真菌由促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變抑制作用；對(duì)土壤中放線菌均表現(xiàn)為顯著抑制作用。AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)放線菌的抑制率大于其對(duì)應(yīng)濃度AHTN 單一污染（第1天除外）。熒光qPCR 法結(jié)果表明，細(xì)菌和真菌拷貝數(shù)隨AHTN 濃度升高而增加，放線菌拷貝數(shù)隨AHTN 濃度升高而減少，對(duì)放線菌表現(xiàn)出顯著抑制作用。放線菌的平板菌落計(jì)數(shù)與熒光qPCR 法得出的結(jié)論一致，即放線菌對(duì)AHTN 敏感，AHTN 對(duì)放線菌具有毒害作用，可將放線菌作為AHTN污染的早期預(yù)警指標(biāo)。

（2）AHTN 單一及與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤脲酶活性均表現(xiàn)為顯著抑制作用（第1 天除外）；隨著AHTN濃度增加，對(duì)酸性磷酸酶活性從促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?；在? 天對(duì)蔗糖酶表現(xiàn)為促進(jìn)作用，之后均轉(zhuǎn)為抑制作用。AHTN 與Cd 復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶抑制率大于AHTN單一污染（第1天除外）。

（3）通過(guò)比較預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值，發(fā)現(xiàn)AHTN 與Cd復(fù)合污染聯(lián)合毒性效應(yīng)對(duì)土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量表現(xiàn)為拮抗作用，對(duì)真菌數(shù)量隨著AHTN濃度升高表現(xiàn)為拮抗-協(xié)同-拮抗現(xiàn)象，對(duì)土壤脲酶活性在第1天時(shí)表現(xiàn)為拮抗作用，20 d以后均為協(xié)同作用；對(duì)土壤酸性磷酸酶活性在60 d前表現(xiàn)為協(xié)同作用（第1天除外），在終點(diǎn)80 d表現(xiàn)為拮抗作用；對(duì)土壤蔗糖酶活性第1天表現(xiàn)為協(xié)同作用，40 d之后均為拮抗作用。