買迪努爾·阿不來孜，陳末，楊再磊，3，愚廣靈，胡洋，賈宏濤，3*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，烏魯木齊 830052；3.新疆土壤與植物生態(tài)過程重點實驗室，烏魯木齊 830052）

濕地被定義為陸地生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡區(qū)域，同時具有生產(chǎn)和生態(tài)功能，在維持水平衡、碳封存和保護生物多樣性方面發(fā)揮著重要作用。近年來全球氣候變化和人為干擾使?jié)竦厣鷳B(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性受到了威脅，全球已有超過一半的濕地消失，這已成為全球性熱點問題。盡管人們認識到了濕地的重要性，但由于土地開墾和過度放牧等人為因素的干擾，濕地的退化形勢日益嚴峻。

在濕地退化過程中，植被類型和數(shù)量會發(fā)生變化，土壤趨于干旱化、貧瘠化，導(dǎo)致濕地土壤有機質(zhì)逐漸減少、養(yǎng)分含量下降。濕地退化影響植物和土壤，進而對土壤微生物群落的多樣性及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接或潛在的影響。微生物是土壤中最活躍的組分，積極參與植物凋落物等有機物質(zhì)的分解、養(yǎng)分礦化、團聚體形成等過程，在碳、氮生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的變化能夠反映微生物對生境變化的適應(yīng)機制。土壤pH通過影響土壤基質(zhì)的化學性質(zhì)和利用效率來干擾土壤真菌群落的多樣性，且真菌群落結(jié)構(gòu)會受到土壤含水量和養(yǎng)分的顯著影響。張雪等對艾比湖濕地的研究表明土壤真菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)在不同退化區(qū)間有顯著差異；林春英等發(fā)現(xiàn)黃河源濕地的退化會降低細菌、真菌群落的多樣性；YANG等的研究表明若爾蓋濕地退化可直接改變細菌群落和古細菌群落的組成。然而，當前對于對全球變化極敏感的高寒濕地的退化機制研究較為匱乏，仍缺乏大量數(shù)據(jù)資料，其中真菌群落結(jié)構(gòu)（尤其是在低分類水平）對高寒濕地退化的響應(yīng)機制研究亟待加強。

巴音布魯克高寒濕地是中亞干旱區(qū)典型的“空中濕島”，在維持新疆南疆地區(qū)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)及陸地生態(tài)系統(tǒng)功能方面發(fā)揮著重要作用。近幾十年來，巴音布魯克高寒濕地受氣候變暖和人為干擾等因素綜合影響而出現(xiàn)的不同程度的退化，對高寒濕地土壤養(yǎng)分循環(huán)及微生物群落產(chǎn)生了深刻影響。因此，研究土壤真菌群落對高寒濕地退化的響應(yīng)機制，揭示微生物群落與生境共變化的耦合關(guān)系，可為高寒濕地生態(tài)功能過程研究提供科學數(shù)據(jù)參考，對闡明高寒濕地退化機制具有重要意義。為此，本研究借助高通量測序技術(shù)分析巴音布魯克不同程度退化高寒濕地土壤真菌群落特征的差異，旨在明確高寒濕地不同程度退化區(qū)域土壤理化性質(zhì)的差異；鑒別不同程度退化濕地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，并初步探究可作為高寒濕地退化的潛在生物標志物；闡明高寒濕地土壤真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)對退化區(qū)域土壤理化性質(zhì)變化的響應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究于2019 年8 月在新疆巴音郭楞蒙古自治州巴音布魯克國家級自然保護區(qū)（83°40′～84°40′E，42°35′～43°00′N）內(nèi)進行。保護區(qū)面積約為770 km，海拔2 300～3 042 m；夏短冬長，年平均氣溫約-4.6 ℃；年平均降水量和蒸發(fā)量分別為273 mm和1 250 mm。

1.2 試驗設(shè)計和樣品采集

在保護區(qū)選取地勢相對平緩，且坡向、海拔等自然因素相對一致的地段，以劉育紅等和馬維偉等對高寒地區(qū)退化的劃分為依據(jù)（主要依據(jù)濕地植物特征，包括地上植物種類、蓋度、高度和生物量等），將研究區(qū)劃分為3 個不同程度的退化區(qū)域，即未退化區(qū)（沼澤土壤，ND 區(qū)）、輕度退化區(qū)（沼澤化草甸土壤，SD 區(qū)）和重度退化區(qū)（沙質(zhì)土壤，HD 區(qū)）。各退化區(qū)基本信息見表1。

表1 研究區(qū)基本信息Table 1 General information of study area

于2019 年8 月在ND 區(qū)、SD 區(qū)和HD 區(qū)分別設(shè)置3 個樣方（50 m×50 m，間距＞100 m），每個樣方內(nèi)再隨機設(shè)置3 個小樣方（1 m×1 m，樣方間距＞10 m）。調(diào)查并記錄各樣方內(nèi)植物的物種、蓋度、高度、密度和生物量。去除地上植物，用滅菌后的土鉆在樣方內(nèi)采用五點法（在樣方對角線上選擇4 個與中心樣點距離相等的點，樣點間距＞0.5 m）采集表層土壤（0～10 cm）樣品，去除土壤樣品中可見的根系和植物殘體，使用四分法均分土壤樣品，其中3 份用于土壤理化性質(zhì)的測定，1份用于高通量測序分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤總有機碳（Total organic carbon，TOC）采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法測定；土壤全氮（Total nitrogen，TN）使用元素分析儀（Vario El III，Elementar，Germany）測定；土壤全磷（Total phosphorus，TP）采用鉬銻抗比色法測定；土壤全鉀（Total potassium，TK）使用火焰光度計（M420，Sherwood，British）測定；土壤含水量（Soil moisture，SM）和容重（Bulk density，BD）采用環(huán)刀法測定；土壤pH 采用pH 計（FE28-Standard，Switzerland）測定。

1.4 DNA提取及測序

使用Power Soil DNA Isolation Kit 強力DNA 提取試劑盒（PowerMag?Soil DNA isolation Kit，MO BIO）進行微生物總DNA 的提取。使用基因引物對ITS1（5′-CTGTCATTAGGGAGAGAGA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGA-3′）結(jié)合適配器序列和條形碼序列進行擴增。樣品在北京百邁克公司Illumina HiSeq 2500平臺完成測序。

1.5 生信分析

使用FLASH 1.2.11軟件對原始數(shù)據(jù)進行拼接，使用Trimmomatic 0.33 軟件進行過濾，得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)；使用UCHIME 8.1軟件，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用Unite 8.0分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋；使用RDP 分類器2.2 對分類群進行分類，最小置信度為80%。借助Mothur 1.30 分析微生物群落多樣性。通過LEfSe 方法獲得潛在的生物標志種，lg LDA 閾值為4.0。

1.6 統(tǒng)計分析

用R 4.0.2 對數(shù)據(jù)進行分析及制圖，用agricolae 1.3.3 ANOVA 檢驗差異顯著性；用ggalluvial軟件包繪制真菌群落豐度圖。用vegan 2.5.6進行RDA分析；用蒙特卡羅置換檢驗分析土壤理化性質(zhì)的顯著性（permu=999）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同程度退化濕地土壤理化性質(zhì)的變化特征

由表2 可見，土壤pH 和BD 在ND 區(qū)和SD 區(qū)中的含量無顯著差異（＞0.05），且均顯著低于HD 區(qū)（＜0.05）。SM 和TOC 隨退化加劇表現(xiàn)為顯著降低趨勢（＜0.05），其最大值均出現(xiàn)在ND 區(qū)（SM：124.19%，TOC：90.58 g·kg）。TN 含量在ND 區(qū)（8.74 g·kg）和SD區(qū)（10.22 g·kg）中無顯著差異（＞0.05），但顯著高于HD 區(qū)（2.25 g·kg）（＜0.05）?？傮w上，土壤TP 和TK 含量隨退化程度增加呈降低趨勢。ND 和SD 區(qū)土壤TP含量無顯著差異（＞0.05），但顯著高于HD區(qū)（0.05）。ND 區(qū)土壤TK 含量顯著高于SD 和HD 區(qū)（0.05）。

表2 濕地土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of wetland soil

2.2 退化對濕地土壤真菌群落多樣性的影響

如表3所示，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在3個退化區(qū)中表現(xiàn)為隨退化程度加劇而降低的趨勢。ACE指數(shù)在ND和SD區(qū)間無顯著差異（＞0.05），但均顯著高于HD區(qū)（＜0.05）。Chao1指數(shù)在不同程度退化區(qū)之間無顯著差異（＞0.05）。SD 區(qū)的Simpson 指數(shù)顯著高于ND區(qū)和HD 區(qū)（＜0.05）。Shannon 指數(shù)在ND 區(qū)和HD 區(qū)之間無顯著差異（＞0.05），但均顯著高于SD 區(qū)（＜0.05）。

表3 高寒濕地不同退化區(qū)土壤真菌群落多樣性Table 3 Diversity of soil fungi community in different degraded areas of alpine wetland

2.3 不同程度退化濕地土壤真菌群落分布特征

2.3.1 真菌群落在門分類水平上的組成

在門分類水平上共得到12 個真菌類群（圖1a）。不同程度退化濕地土壤均以子囊菌門（Ascomycota）為主導(dǎo)菌門，其平均豐度分別為ND 區(qū)24.99%、SD 區(qū)39.18%、HD 區(qū)62.99%。此外，擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、隱真菌門（Rozellomycota）的相對豐度均＞1.00%。隨著濕地退化加劇，子囊菌門和被孢霉門的相對豐度呈逐漸增加的趨勢，擔子菌門、隱真菌門、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）的相對豐度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

2.3.2 真菌類群在綱、目、屬分類水平上的組成

綱水平上，糞殼菌綱（Sordariomycetes）和擔子菌綱（Agaricomycetes）為主導(dǎo)菌綱（圖1b）。目水平上，肉座菌目（Hypocreales）、Pleosporales 菌目、被孢霉目（Mortierellales）、碳角菌目（Xylariales）、屎殼菌目（Sordariales）的相對豐度隨退化加劇而增加（圖1c）。屬水平上（圖1d），的相對豐度隨濕地退化加劇呈降低趨勢，在不同退化區(qū)土壤中為ND 區(qū)11.32%、SD 區(qū)0.01%、HD 區(qū)0.03%。此外，、、等7種菌屬在ND和SD區(qū)中的平均相對豐度均不足0.50%，且低于HD區(qū)。

圖1 不同程度退化高寒濕地土壤真菌群落相對豐度Figure 1 Relative abundance of soil fungal communities under different degradation degrees on alpine wetland

2.3.3 不同程度退化高寒濕地土壤真菌群落間的LEfSe分析

LEfSe分析可鑒別出不同程度退化高寒濕地真菌群落中差異顯著的物種。圖2 顯示，在lg LDA=4.0時，11 個真菌的相對豐度存在顯著差異。其中，ND區(qū)中沒有出現(xiàn)顯著差異的物種。SD 區(qū)僅存在一種生物標志物，為傘菌綱（Agaricomycetes），屬于擔子菌門。HD區(qū)中煤炱目（Capnodiales）、叢赤殼科（）等10 類真菌的豐度顯著高于ND 區(qū)和SD 區(qū)（＜0.05）。

圖2 巴音布魯克不同程度退化高寒濕地土壤真菌群落間的LEfSe分析Figure 2 The LEfSe analysis of fungal communities at different degradation degrees in Bayinbuluk alpine wetland

2.4 退化高寒濕地真菌群落多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

對不同程度退化濕地環(huán)境因子和多樣性指數(shù)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子對真菌Simpson、Shannon 多樣性指數(shù)無顯著影響（表4）。ACE 指數(shù)與TP無顯著相關(guān)性（＞0.05），但與TK 呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與pH、BD 均呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），與SM、TOC 和TN 均呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。Chao1 指數(shù)與TOC、TN呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。

表4 環(huán)境因子對土壤真菌群落多樣性的影響Table 4 Effects of environmental factors on soil fungal communities diversity

2.5 退化高寒濕地真菌群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子間的相關(guān)性分析

為揭示土壤理化因子對真菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響，在門分類水平上對土壤理化因子和4 個優(yōu)勢真菌門進行冗余分析（圖3a）和蒙特卡羅檢驗（表5）。結(jié)果顯示，土壤pH 和BD 與被孢霉門呈正相關(guān)。土壤TN、TOC、SM、TP 和TK 與隱真菌門的相對豐度變化呈正相關(guān)，但影響不顯著（＞0.05）。

表5 門分類水平上真菌群落變化與土壤環(huán)境因子的蒙特卡羅檢驗Table 5 Monte Carlo test of fungal communities at phylum level and soil environmental factors

在屬分類水平上，對環(huán)境因子和相對豐度前10的真菌屬進行了RDA 分析（圖3b）和蒙特卡羅檢驗（表6）。結(jié)果顯示，菌屬與TP、TN、TOC 和SM 呈正相關(guān)，菌屬與TP、TN、TOC、SM 和TK 呈正相關(guān)。而BD 和pH 均與其他8 種真菌屬呈正相關(guān)。蒙特卡羅檢驗結(jié)果表明，TOC是影響真菌群落屬分類水平結(jié)構(gòu)變化的主要驅(qū)動因子。

表6 屬分類水平上真菌群落變化與土壤環(huán)境因子的蒙特卡羅檢驗Table 6 Monte Carlo test of fungal communities at genus level and soil environmental factors

圖3 土壤真菌群落在門和屬水平上與環(huán)境因子的RDA分析Figure 3 RDA analysis of soil fungal communities with environmental factors at phylum and genus levels

3 討論

3.1 退化對高寒濕地土壤理化性質(zhì)的影響

濕地對氣候和人類活動響應(yīng)極敏感，其土壤理化性質(zhì)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因素。氣候變化和人為干擾導(dǎo)致高寒濕地退化，直接表現(xiàn)為土壤水分減少。此外，不合理的土地利用會使表層土壤受到影響，從而加大地表裸露面積，增強地表蒸騰作用，降低SM，最終加劇土壤侵蝕。相關(guān)研究表明，濕地的退化會影響土壤理化性質(zhì)。本研究中，土壤pH、BD 會隨退化加劇逐漸升高，而土壤SM、TOC、TN 等理化指標表現(xiàn)出降低的趨勢，這與林春英等對黃河源區(qū)高寒沼澤濕地土壤的研究結(jié)果基本一致。土壤TK 在輕度和重度退化區(qū)中無顯著差異（＞0.05），與ZHOU 等在青藏高原高寒草地的研究結(jié)果一致。GU 等在若爾蓋濕地的研究中發(fā)現(xiàn)，pH和土壤TK隨退化程度加劇表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，而本研究表現(xiàn)為pH 升高、TK 含量降低的趨勢。這些差異可能由當?shù)貧夂颉⒎拍翉姸纫约巴寥辣旧項l件的不同所導(dǎo)致。隨著濕地退化加劇，土壤SM 和pH發(fā)生顯著變化（表2），進而顯著影響了土壤真菌群落多樣性（表3）。

3.2 退化對高寒濕地土壤真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響

真菌是濕地土壤環(huán)境的重要組成部分之一，其多樣性和群落結(jié)構(gòu)受到土地管理措施和養(yǎng)分狀況的影響。在本研究中，真菌群落豐富度指數(shù)隨退化程度加劇呈逐漸降低的趨勢，而Shannon 多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢（表3），這可能是由于濕地受到退化影響后導(dǎo)致植被覆蓋度降低，枯落物輸入量減少，地表的光輻射增強，使溫度升高，土壤表層含水量減少，進而影響真菌群落的存活，使真菌群落的豐富度降低。未退化區(qū)土壤真菌群落的多樣性和豐富度指數(shù)均較高，其原因可能是苔草等植物的根系發(fā)達、莖粗且結(jié)實，能夠通過充分吸收水分和養(yǎng)分適應(yīng)濕地環(huán)境，有利于維持真菌群落的穩(wěn)定。重度退化區(qū)真菌群落Shannon 指數(shù)最高，這是因為沙土間隙大、通氣性好，為真菌群落創(chuàng)造了良好的微環(huán)境，故具有較高的多樣性。

不同程度退化高寒濕地優(yōu)勢真菌類群為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）。有研究表明，子囊菌門和擔子菌門是不同退化程度高寒濕地、南泥灣濕地、鄱陽湖典型濕地、古大湖濕地等其他類型濕地土壤中的優(yōu)勢菌群。這說明真菌類群在濕地環(huán)境中的分布具有一定的相似性。本研究中，子囊菌門隨著濕地退化加劇呈逐漸增加趨勢，擔子菌門則呈降低趨勢，這與子囊菌門降解復(fù)雜有機質(zhì)功能和擔子菌門可以限制木質(zhì)素分解的功能有關(guān)。土壤TOC 也隨退化的加劇呈降低趨勢（表2），這是因為過度放牧降低了植被生物量，植物凋落物歸還量減少，減少了向土壤輸入的有機碳含量，進一步影響了子囊菌門和擔子菌門的相對豐度。同時，在本研究中隨退化程度加劇土壤含水量顯著降低，通氣性有所改善，給子囊菌門的快速繁殖創(chuàng)造了有利條件，其中的Leotiomycetes 綱在長期干旱引起的低水分土壤中的相對豐度高于含水量高的未退化和輕度退化土壤（圖1），在干旱條件中成為競爭的優(yōu)勢者。此外，子囊菌門可以利用氮素快速生長繁殖，因此可在氮含量較高的環(huán)境中累積。但本研究中發(fā)現(xiàn)子囊菌門在氮含量最低的重度退化區(qū)中的相對豐度最高，這可能是因為水分的影響遠大于氮含量的影響。

不同程度退化區(qū)域土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的相似性，可通過LEfSe 分析篩選不同程度退化區(qū)域的潛在生物標志物。在重度退化區(qū)中，煤炱目（Capnodiales）相對豐度迅速增加（圖1c），說明該真菌目在退化濕地中能較好地生存。輕度退化區(qū)僅存在傘菌綱（Agaricomycetes）一種潛在標志物，屬于擔子菌門（圖2）。一般認為，干擾較小的穩(wěn)定群落有利于一些競爭力較高的物種繁殖，從而使少數(shù)物種主宰群落。真菌群落的結(jié)構(gòu)在不同程度退化濕地土壤中具有顯著差異，這表明真菌群落對濕地退化具有較高的敏感性。

3.3 環(huán)境因子對濕地土壤真菌群落的影響

不同程度退化濕地土壤真菌多樣性及其豐富度的差異可能是由植物和土壤性質(zhì)的間接影響導(dǎo)致的。本研究中，相關(guān)性分析結(jié)果表明，真菌群落Shannon 和Simpson 多樣性指數(shù)與土壤因子變化無顯著相關(guān)性，而Chao1和ACE 豐富度指數(shù)與土壤因子的變化顯著相關(guān)。這說明，高寒濕地退化導(dǎo)致的養(yǎng)分變化更多地影響土壤真菌群落的豐富度，尤其是稀有類群，而對物種均勻度的影響較小。這一結(jié)果與WU等對三江平原不同類型退化濕地的研究結(jié)果不完全一致，即真菌群落Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)與環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性，這可能與濕地退化的主要驅(qū)動因子有關(guān)。

土壤理化性質(zhì)是微生物群落的重要驅(qū)動因素。通過對真菌群落（門分類水平）與環(huán)境因子進行RDA分析，發(fā)現(xiàn)第一軸和第二軸的解釋量分別為61.91%、33.56%。不同程度退化濕地土壤樣品在第一、第二軸上分布散亂，說明真菌群落在不同程度退化濕地土壤間具有一定的差異。在屬水平上，第一和第二軸總解釋量為79.58%。除和外，其他真菌屬均與TP、TN、TOC 呈負相關(guān)。已有研究表明，土壤物理和化學性質(zhì)是微生物群落結(jié)構(gòu)的重要驅(qū)動因素。土壤微生物群落多樣性主要受pH、SM、BD、TN、TOC 等理化因子的影響。高寒濕地重度退化后BD 顯著增大（表2），從而通過影響土壤孔隙度直接影響土壤微生物的生存；而pH 可以通過影響碳和氮元素的利用率來改變土壤環(huán)境，進而影響微生物群落的結(jié)構(gòu)。本文中子囊菌門和被孢霉門（Mortierellomycota）分別與pH 和BD 呈正相關(guān)，說明這些真菌有較強的適應(yīng)性，能在養(yǎng)分含量較低的堿性土壤中生存，子囊菌門豐度隨退化程度加劇而增加也驗證了這一點（圖1a）。然而隱真菌門（Rozellomycota）相對豐度的變化與大部分土壤養(yǎng)分相關(guān)指標（TOC、SM、TP、TN、TK）呈正相關(guān)，說明此類真菌對外界環(huán)境的適應(yīng)性較差，適合在養(yǎng)分充足的環(huán)境中生存。土壤真菌群落與理化性質(zhì)間的聯(lián)系與其自身的生境偏好性密切相關(guān)。本研究對高寒濕地在退化過程中真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進行了相關(guān)研究，今后還需進一步從“植物-土壤-微生物”的角度解析真菌群落對退化的響應(yīng)機制。

4 結(jié)論

（1）高寒濕地退化顯著改變了土壤理化性質(zhì)，進而推動真菌群落多樣性及其結(jié)構(gòu)的變化。

（2）高寒濕地退化區(qū)優(yōu)勢菌為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），并存在潛在生物標志物，可作為濕地退化的指示物種。

（3）土壤總有機碳是影響高寒濕地退化土壤真菌群落的最重要驅(qū)動因子。土壤真菌群落與環(huán)境因子之間的協(xié)同關(guān)系需要持續(xù)關(guān)注。

感謝巴音布魯克草原監(jiān)測站仁欽老師，新疆農(nóng)業(yè)大學高文偉教授，同門王旭陽、叢孟菲、申志博、胡云鵬、唐濤、苗旭晨等在采樣和實驗方面的幫助與支持！