張 晉 ，周 燦，王青瑤，吳俊敏，申旭東，傅松哲，劉 鷹

(1 大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023;2 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023;3 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院營口增殖實(shí)驗(yàn)站，遼寧 營口 115004)

凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)已成為全世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的對蝦種類[1]。目前中國是世界上主要的凡納濱對蝦養(yǎng)殖大國[2]。2019年，全國凡納濱對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量為181.56萬t，比上年增長3.14%[3]。隨著對蝦集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致養(yǎng)殖水環(huán)境持續(xù)惡化、傳染性疾病大規(guī)模爆發(fā)，嚴(yán)重制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[4-5]。相關(guān)研究表明，養(yǎng)殖環(huán)境的細(xì)菌群落組成是影響海洋生物疾病暴發(fā)的重要因素[6-7]，弧菌則是水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性流行病的主要因素[8-10]。因此在養(yǎng)殖過程中檢測弧菌、水質(zhì)變化起著至關(guān)重要的作用。

多數(shù)養(yǎng)殖企業(yè)通過大量換水更新養(yǎng)殖水質(zhì)，從而解決水質(zhì)惡化問題，這種模式也稱為流水式養(yǎng)殖(flow-through system,FTS)。但在養(yǎng)殖過程中換水可能會(huì)引入外來病原，使得對蝦獲得疾病，同時(shí)大量換水會(huì)造成嚴(yán)重水資源浪費(fèi)并且污染周圍養(yǎng)殖水域[11-12]。

近年來，相關(guān)研究表明對蝦循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(re-circulating aquaculture system,RAS)在養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有較強(qiáng)的可行性[13]。目前，對蝦循環(huán)水養(yǎng)殖在水資源消耗、對蝦疾病管控等方面具有優(yōu)勢，受到對蝦養(yǎng)殖業(yè)廣泛關(guān)注[14-16]，對養(yǎng)殖水體水質(zhì)具有良好調(diào)節(jié)效果，方便實(shí)施[17-19]。此外，生物濾池作為對蝦循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖廢水凈化處理的核心，具有較好的生物處理效果和較高的硝化效率，為養(yǎng)殖水體水質(zhì)中的營養(yǎng)物轉(zhuǎn)化提供了有效保證[20]。但這兩種系統(tǒng)長期運(yùn)行的穩(wěn)定性和細(xì)菌群落演替規(guī)律異同的報(bào)道較少，這些差異是如何影響對蝦養(yǎng)殖也是未知的。

本研究對相同養(yǎng)殖容量、相同溫度范圍和相同水源運(yùn)行的兩種養(yǎng)殖模式進(jìn)行了比較研究，分別在養(yǎng)殖前期、中期和后期對兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)中水樣進(jìn)行采集，通過分析兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水質(zhì)、弧菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)變化、水體中細(xì)菌群落變化、可培養(yǎng)菌株情況等數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性地比較流水式和循環(huán)水兩種對蝦養(yǎng)殖模式的系統(tǒng)穩(wěn)定性及其對細(xì)菌種群演替的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)與樣品采集

本試驗(yàn)于2020年5月—2020年10月對營口某養(yǎng)殖場中流水式和循環(huán)水對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水樣進(jìn)行采集，養(yǎng)殖周期均為100 d。每套系統(tǒng)由規(guī)格相同的養(yǎng)殖池組成，養(yǎng)殖池規(guī)格均為1.5 m×1.5 m×1.5 m，水深1.0 m，水體2.25 m3。采用氣泵曝氣充氧。其中循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)還配備了生物濾器(0.45 m×0.3 m×0.7 m)用于水質(zhì)處理。生物濾器內(nèi)填充生物填料，生物濾器內(nèi)生物膜處于成熟狀態(tài)。循環(huán)水養(yǎng)殖池采用2 000 L/h循環(huán)泵，24 h運(yùn)行。

流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)(FTS)和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)每日換水率分別為20%和0.5%，養(yǎng)殖水體水溫(T)24～27 ℃，溶氧7～8 mg/L，pH 7.8～8.5。對蝦養(yǎng)殖前平均體長77 ±7.37 mm，平均體質(zhì)量2.8 ±0.91 g。每個(gè)養(yǎng)殖池放蝦苗100尾，放養(yǎng)密度為0.124 kg/m3。養(yǎng)殖期間，每天投喂3次，投喂時(shí)間分別為7∶00、12∶00、19∶00。投喂飼料選自唐山禾豐科技有限公司，日投喂量為蝦體生物量的5%，通過觀察養(yǎng)殖桶內(nèi)殘余飼料及糞便量多少，適當(dāng)調(diào)節(jié)飼料投喂量。

試驗(yàn)分為2組，一組為高鹽度組(A組)，使用海水和自來水配制，鹽度為8。另一組為低鹽度組(B組)，直接使用地下井水作為水源，鹽度為4。每組包含4個(gè)養(yǎng)殖池，流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)各使用2個(gè)養(yǎng)殖池(圖1)。

圖1 流水式養(yǎng)殖模式(FTS)和循環(huán)水養(yǎng)殖模式(RAS)養(yǎng)殖池示意圖

在養(yǎng)殖第1天，第50天，第100天(分別對應(yīng)養(yǎng)殖前期，中期和后期)對養(yǎng)殖系統(tǒng)水樣進(jìn)行采集測序，每14 d采集一次水樣，檢測弧菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)，同時(shí)每25 d采集一次水樣，檢測水質(zhì)參數(shù)。

1.2 水質(zhì)測定方法

分別從同一養(yǎng)殖系統(tǒng)2個(gè)養(yǎng)殖池內(nèi)水深0.75 m處取0.5 L水樣混勻，檢測水質(zhì)氨氮、亞硝酸鹽氮和COD指標(biāo)，測定方法參照海洋監(jiān)測規(guī)范GB17378.7—2007[21]。其中，采用次溴酸鹽氧化法測定氨氮數(shù)值，采用萘乙二胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮，采用堿性高錳酸鉀法測定COD數(shù)值[21]。

1.3 養(yǎng)殖水體弧菌和細(xì)菌計(jì)數(shù)

取養(yǎng)殖水體25 mL加入225 mL生理鹽水中混勻，隨后采用10倍系列梯度稀釋液分別涂布于TCBS瓊脂培養(yǎng)基和2216E瓊脂培養(yǎng)基平板內(nèi)，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)計(jì)數(shù)[22]。

1.4 DNA提取和高通量測序

使用直徑為47 mm，孔徑0.22 μm的濾膜對水體進(jìn)行過濾。用剪刀將整張過濾膜盡量剪碎，置于2 mL離心管中。

采用Water DNA Isolation Kit試劑盒(FOREGEN)提取的養(yǎng)殖水體總基因組DNA，委托諾禾致源有限公司進(jìn)行16S rDNA V4區(qū)高通量測序。基于 Illumina HiSeq 測序平臺(tái)，以雙末端測序(Paired-End)進(jìn)行小片段文庫的構(gòu)建，構(gòu)建后對文庫進(jìn)行測序，每個(gè)樣品重復(fù)兩次。在對原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接后得到優(yōu)化序列。利用軟件QIIME(version 1.8.0)[23]中的UCLUST將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，進(jìn)而進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)的劃分，并根據(jù)OTU的序列組成獲得養(yǎng)殖水體樣本中細(xì)菌的物種分類。在OTU結(jié)果的基礎(chǔ)上對樣品進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得養(yǎng)殖水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)圖。Alpha多樣性分析研究97%以上相似度水平下的Ace、Chao1及Shannon指數(shù)，對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行分析。同時(shí)運(yùn)用主坐標(biāo)分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的差異性進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均利用Excel 2010和SPSS19軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)菌分離與鑒定

采用2216E 海水培養(yǎng)基分別對循環(huán)水和流水式養(yǎng)殖池水體進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，在養(yǎng)殖第14、28、42、56、70、84、100天進(jìn)行取樣分離。隨后利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Qiagen)提取基因組DNA。采用16S rRNA 引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24]。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2.5 μL；上下游引物F/R各0.5 μL；2×Taq PCR Super Mix12.5 μL；ddH2O 9 μL。PCR產(chǎn)物送至北京華大基因科技有限公司，完成測序。

2 結(jié)果

2.1 對蝦養(yǎng)殖期間生長情況

養(yǎng)殖后期，F(xiàn)TS中高鹽組和低鹽組的對蝦平均體質(zhì)量從2.8 ±0.91 g分別增加至10.9 ±4.08 g和8.6 ±3.22 g，平均體長從77.6 ±7.37 mm增加至117.4 ±13.99 mm和106.9 ±14.11 mm。

RAS中高鹽組和低鹽組的對蝦平均體質(zhì)量從2.8 ±0.91 g分別增加至10.5 ±1.73 g和11.1±4.67 g，平均體長從77.6 ±7.37 mm分別增加至116.8 ±4.78 mm和119.3 ±15.35 mm。結(jié)果顯示，F(xiàn)TS和RAS中的對蝦體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 對蝦養(yǎng)殖期間平均體質(zhì)量(A)和平均體長(B)變化

2.2 養(yǎng)殖水體中水質(zhì)參數(shù)變化

2.2.1 養(yǎng)殖水體中COD質(zhì)量濃度變化

RAS和FTS養(yǎng)殖池水體中COD質(zhì)量濃度變化如圖3A所示，高鹽組和低鹽組中FTS水體中COD質(zhì)量濃度均高于RAS水體。高鹽組RAS水體中COD質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖第25天時(shí)略顯升高，但后期COD質(zhì)量濃度變化基本趨于穩(wěn)定，變化范圍為2.32～4.00 mg/L。高鹽度FTS水體中COD質(zhì)量濃度變化范圍為2.56～8.98 mg/L，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS水體中COD質(zhì)量濃度逐漸增加，且均高于RAS水體質(zhì)量濃度，養(yǎng)殖后期質(zhì)量濃度差異顯著。

同樣低鹽組RAS水體中COD質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖前期小幅度增加，養(yǎng)殖中后期COD質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，變化范圍為2.59～4.50 mg/L。低鹽組FTS水體中的COD質(zhì)量濃度變化與高鹽組變化趨勢基本相同，呈大幅度增加趨勢，且明顯高于RAS水體中COD質(zhì)量濃度，變化范圍為2.86～9.62 mg/L，同樣養(yǎng)殖后期濃度差異顯著。

2.2.2 養(yǎng)殖水體中氨氮質(zhì)量濃度變化

RAS和FTS養(yǎng)殖池水體中氨氮質(zhì)量濃度變化如圖3B所示，高鹽組和低鹽組中FTS水體中氨氮質(zhì)量濃度均高于RAS水體。高鹽組RAS水體的氨氮質(zhì)量濃度變化范圍為0.020～0.093 mg/L，其氨氮質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖前期略顯升高，但在養(yǎng)殖中后期氨氮質(zhì)量濃度基本趨于穩(wěn)定。FTS水體的氨氮質(zhì)量濃度變化范圍為0.020～0.268 mg/L，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS水體中氨氮質(zhì)量濃度顯著增加，且均高于RAS水體中氨氮質(zhì)量濃度，養(yǎng)殖后期質(zhì)量濃度差異顯著。

低鹽組RAS水體中氨氮質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖前期小幅度增加，養(yǎng)殖中后期氨氮質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定，變化范圍為0.003～0.102 mg/L。低鹽組FTS水體中氨氮質(zhì)量濃度呈大幅度增加趨勢，且明顯高于RAS水體中氨氮質(zhì)量濃度，變化范圍為0.025～0.305 mg/L，同樣養(yǎng)殖后期質(zhì)量濃度差異顯著。

2.2.3 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化

RAS和FTS養(yǎng)殖池水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化如圖3C所示，高鹽組和低鹽組中FTS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度均高于RAS水體。高鹽組RAS水體的亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化范圍為0.001 2～0.012 5 mg/L，其亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖前期略顯升高，但在養(yǎng)殖第25天后亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度基本趨于穩(wěn)定。FTS水體的亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度變化范圍為0.001 6～0.053 6 mg/L，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度顯著增加，且均高于RAS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度，養(yǎng)殖后期質(zhì)量濃度差異較大。

圖3 循環(huán)水和流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖水體中COD(A)、氨氮(B)和亞硝酸鹽氮(C)變化

低鹽組RAS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度在養(yǎng)殖前期小幅度增加，養(yǎng)殖中后期亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度略微升高，變化范圍為0.000 1～0.015 0 mg/L。低鹽組FTS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度呈大幅度增加趨勢，且明顯高于RAS水體中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度，變化范圍為0.000 7～0.078 0 mg/L，同樣養(yǎng)殖后期質(zhì)量濃度差異較大。

2.3 養(yǎng)殖水體中弧菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)變化

圖4A顯示，隨著時(shí)間增加，兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中弧菌總數(shù)在初始時(shí)明顯較低，隨后持續(xù)增加。FTS和RAS水體中弧菌總數(shù)變化差異顯著(P<0.05)。FTS水體中弧菌總數(shù)明顯高于RAS，同時(shí)FTS水體中弧菌增長速率高于RAS。

RAS內(nèi)弧菌總數(shù)在0～28 d內(nèi)保持平穩(wěn)，28 d后呈增長趨勢，變化范圍為1.13×102～1.01×103CFU/mL；FTS內(nèi)弧菌總數(shù)隨時(shí)間增加在0～70 d呈明顯上升趨勢，弧菌總數(shù)最高達(dá)到4.73×103CFU/mL，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS內(nèi)弧菌總數(shù)增長速率高于RAS，且弧菌總數(shù)明顯高于RAS，在養(yǎng)殖中后期差異明顯，在養(yǎng)殖第70天，兩種養(yǎng)殖模式弧菌總數(shù)最大相差4.08×103CFU/mL。

圖4B顯示，隨著時(shí)間增加，兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)下細(xì)菌總數(shù)在初始時(shí)明顯較低，隨后持續(xù)增加。FTA和RAS水體中細(xì)菌總數(shù)變化差異顯著(P<0.05)。FTS水體中細(xì)菌總數(shù)明顯高于RAS，同時(shí)FTS水體中細(xì)菌增長速率RAS。

圖4 高鹽組(A)和低鹽組(B)養(yǎng)殖水體中弧菌總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)變化

RAS在0～28 d細(xì)菌總數(shù)變化趨于平穩(wěn)，28d以后細(xì)菌總數(shù)明顯增加，最高達(dá)到3.04×104CFU/mL。RAS水體中內(nèi)細(xì)菌總數(shù)變化較小，范圍在4.34×102～3.82×103CFU/mL之間。隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS水體中細(xì)菌總數(shù)增長速率高于RAS，且細(xì)菌總數(shù)明顯高于RAS系統(tǒng)，在養(yǎng)殖第70天，細(xì)菌總數(shù)最大相差2.92×104CFU/mL。

2.4 高鹽組流水式和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌群落組成分析

對養(yǎng)殖水體各采樣點(diǎn)提取的水體DNA，選擇16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增子測序，高鹽度和低鹽度2套流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)分別標(biāo)記為FTS-A和FTS-B，3個(gè)采樣時(shí)間對應(yīng)的水體分別標(biāo)記為FTSA1、FTSA50和FTSA100；高鹽度和低鹽度2套循環(huán)水養(yǎng)殖池分別標(biāo)記為RAS-A和RAS-B，3個(gè)采樣時(shí)間的水體分別標(biāo)記為RASA1、RASA50和RASA100。樣品的覆蓋率(Good’s coverage)指數(shù)均超過99.9%(表1)，說明本試驗(yàn)測序深度足夠大，足以覆蓋樣品的大多數(shù)微生物，測序的數(shù)據(jù)量合理[25]。

表1 樣品的細(xì)菌群落多樣性

圖5A結(jié)果顯示，高鹽組流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)(FTSA)水體中主要分布變形菌綱(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Campilobacteroa。FTSA水體中變形菌綱所占比例隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加不斷升高，水體中Campilobacteroa所占比例隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移逐漸減少；高鹽組循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RASA)水體中變形菌綱所占比例在第50天時(shí)略有減少，但在第100天時(shí)顯著增加。兩池相比較而言，養(yǎng)殖池FTSA水體中變形菌綱所占總細(xì)菌量的比例高于池RASA，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的變形菌綱(Proteobacteria)種群演替速度慢于流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)。

圖5B屬水平結(jié)果顯示，在高鹽組養(yǎng)殖池FTSA養(yǎng)殖水體中，弧菌屬(Vibrio)為主要優(yōu)勢菌。RASA養(yǎng)殖水體中黃桿菌屬(Flavobacterium)和紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)為優(yōu)勢菌。養(yǎng)殖池FTSA和養(yǎng)殖池RASA養(yǎng)殖水體中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)存在一定差異，在所采集的養(yǎng)殖水體中，養(yǎng)殖池FTSA水體中弧菌屬所占細(xì)菌總數(shù)比例隨時(shí)間的推移迅速升高，早期所占細(xì)菌總比例3.3%，養(yǎng)殖后期所占比例高達(dá)85.3%。池RASA養(yǎng)殖水體中弧菌屬比例較少。兩池相比較而言，養(yǎng)殖池FTSA水體中弧菌屬所占細(xì)菌總量比例均顯著高于養(yǎng)殖池RASA。

注：高鹽組流水式和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)門(Phylum)水平(圖A)和屬水平(圖B)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

2.5 低鹽組流水式和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌群落組成分析

圖6A結(jié)果顯示低鹽組流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)(FTSB)水體中主要分布著變形菌綱(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)兩大類細(xì)菌。養(yǎng)殖池FTSB養(yǎng)殖水體中變形菌綱所占比例隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加不斷減少，水體中Epsilobacteraeota所占比例隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移逐漸增加；而低鹽組循環(huán)水養(yǎng)殖池(RASB)水體中變形菌綱所占比例在第50天時(shí)升高，在第100天時(shí)有所降低，但高于第1天所占比例，同樣養(yǎng)殖水體中Epsilobacteraeota在第100天時(shí)顯著增加。經(jīng)兩組養(yǎng)殖系統(tǒng)結(jié)果分析，兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖水體中變形菌綱(Proteobacteria)為水體優(yōu)勢細(xì)菌。

圖6B同樣可以看出，在屬水平，低鹽組養(yǎng)殖池FTSB養(yǎng)殖水體中弧菌屬(Vibrio)為優(yōu)勢菌，而循環(huán)水養(yǎng)殖池RASB水體優(yōu)勢菌為紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)、交替單胞菌屬(Alteromonas)和弧菌屬。

注：低鹽組流水式和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)門(Phylum)水平(圖A)和屬水平(圖B)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

兩池養(yǎng)殖水體細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)差異與組一基本相同，養(yǎng)殖池FTSB養(yǎng)殖水體中弧菌屬所占細(xì)菌總數(shù)比例隨時(shí)間的推移迅速升高。養(yǎng)殖池RASB養(yǎng)殖水體中弧菌屬所占比例在試驗(yàn)第1天和第50天時(shí)均比較小，在第100天時(shí)迅速升高。兩池相比較而言，養(yǎng)殖池FTSB水體中弧菌屬所占細(xì)菌總量比例均顯著高于養(yǎng)殖池RASB。兩組試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果基本相同，兩池養(yǎng)殖水體中弧菌占細(xì)菌總數(shù)量的比例均隨養(yǎng)殖時(shí)間的增加而升高，但養(yǎng)殖池FTSB水體中弧菌數(shù)量和增長速度均高于養(yǎng)殖池RASB。

2.6 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落多樣性分析

對養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的Alpha多樣性(Alpha diversity)進(jìn)行分析，反映養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落物種豐度及多樣性。

結(jié)果顯示：試驗(yàn)第1天，RAS與FTS水體中細(xì)菌種群Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均基本相同，表明試驗(yàn)起始養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落豐富及多樣性基本相同。試驗(yàn)第50天，高鹽組與低鹽組FTS水體細(xì)菌種群Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于對應(yīng)的RAS，表明在養(yǎng)殖中期，F(xiàn)TS水體中細(xì)菌群落豐富度與多樣性高于RAS。高鹽組在養(yǎng)殖第100天時(shí)，RAS水體中ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均有所升高，低鹽組則少量降低；FTS水體中ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)與第1天數(shù)值基本無顯著變化；RAS水體中細(xì)菌群落的多樣性高于FTS，其中對于RAS,Chao1指數(shù)的均值是1 136.189 3，而對于FTS是1 050.823 9。

2.7 養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落差異性分析

隨后，為了進(jìn)一步解析兩種養(yǎng)殖模式水體細(xì)菌群落的差異性，對循環(huán)水養(yǎng)殖池和流水式養(yǎng)殖池養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的測序結(jié)果進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA,Principal Co-ordinates Analysis)。

圖7A中PC1和PC2解釋了高鹽組養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落 54.47%和 23.92%的信息，兩主成分之和為78.39%，可以較好地代表樣品中的細(xì)菌群落信息。分析結(jié)果顯示：養(yǎng)殖期間3次采樣FTS與RAS距離均較遠(yuǎn)，即表明FTS和RAS水體的細(xì)菌群落組成均存在較大差異。

圖7B中PC1和PC2解釋了低鹽組養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落 66.03%和 26.45%的信息，兩主成分之和大于90%，也較好地代表樣品中的細(xì)菌群落信息。分析結(jié)果顯示：在試驗(yàn)第1天與試驗(yàn)第50天，兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)距離較近，但在試驗(yàn)第100天時(shí)兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)距離較遠(yuǎn)，表明在養(yǎng)殖前期兩種養(yǎng)殖水體的物種組成結(jié)構(gòu)越相似，細(xì)菌群落組成差異較小，但隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落組成產(chǎn)生較大差異。

圖7 高鹽組(圖A)和低鹽組(圖B)養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析(PCoA)

綜上結(jié)果表明：隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，F(xiàn)TS與RAS內(nèi)的細(xì)菌群落差異逐漸產(chǎn)生明顯較大差異，細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)逐漸不同。

2.8 養(yǎng)殖水體可培養(yǎng)菌株分析

對高鹽組和低鹽組FTS養(yǎng)殖水體中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，共分離59株菌株，由圖8A可知可培養(yǎng)細(xì)菌中弧菌(Vibrio)所占比例達(dá)到61%，為可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢類群，芽孢桿菌(Bacillus)所占比例為12%，其次為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、發(fā)光細(xì)菌(Photobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Enterobacter)、希瓦菌屬(Shewanella)，所占比例分別為7%、5%、3%、3%和3%。

對高鹽組和低鹽組RAS養(yǎng)殖水體中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，共分離出34株菌株，由圖8B可知可培養(yǎng)細(xì)菌中腸桿菌(Enterobacter)所占比為18%，氣單胞菌(Aeromonas)、Klebsiella、弧菌(Vibrio)、海洋桿菌(Marinobacterium)所占比例均為9%。兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)中共培養(yǎng)可培養(yǎng)菌株93株，其中弧菌屬(Vibrio)為主要可培養(yǎng)菌株，所占比例為所有可培養(yǎng)菌株的41.9%，其次為腸桿菌(Enterobacter)和芽孢桿菌(Bacillus)，占比均為8.6%。

圖8 流水式養(yǎng)殖水體(圖A)和循環(huán)水養(yǎng)殖水體(圖B)可培養(yǎng)細(xì)菌餅狀圖

3 討論

3.1 兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)參數(shù)及弧菌、細(xì)菌總數(shù)比較

本研究通過對循環(huán)水對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)和流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)全過程中水質(zhì)、弧菌總數(shù)和微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。對蝦生長情況方面，F(xiàn)TS和RAS中的對蝦體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)，這與張龍等[13]結(jié)果一致。水質(zhì)方面，初始時(shí)FTS和RAS水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和COD質(zhì)量濃度較低，隨著養(yǎng)殖時(shí)間增加，三者質(zhì)量濃度逐漸升高，養(yǎng)殖后期FTS水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和COD質(zhì)量濃度明顯高于RAS，與索建杰等[1]、RAT等[26]結(jié)果一致?；【倲?shù)和細(xì)菌總數(shù)方面，兩種養(yǎng)殖模式下弧菌總數(shù)和細(xì)菌在初始時(shí)明顯較低，隨后弧菌和細(xì)菌總數(shù)持續(xù)增加。FTS下水體中弧菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)明顯高于RAS，同時(shí)FTS水體中弧菌和細(xì)菌總數(shù)增長速率高于RAS。

3.2 兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌群落組成比較

門水平分析顯示變形菌綱(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為水體優(yōu)勢細(xì)菌。屬水平主要為弧菌屬(Vibrio)、紅細(xì)菌科(Rhodobacteraceae)、交替單胞菌屬(Alteromonas)等。最后本研究對兩種系統(tǒng)的可培養(yǎng)菌株進(jìn)行了比較，在兩種養(yǎng)殖系統(tǒng)中得到可培養(yǎng)菌株93株，其中FTS水體中弧菌屬(Vibrio)為主要可培養(yǎng)菌株，所占比例為61%。而循環(huán)水系統(tǒng)腸桿菌(Enterobacter)所占比例為18%，為主要可培養(yǎng)菌株，通過可培養(yǎng)菌株可以看出FTS養(yǎng)殖水體中提高致病性的弧菌明顯高于RAS，從而降低系統(tǒng)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在FST和RAS兩種對蝦養(yǎng)殖模式中，在水體細(xì)菌群落種群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)優(yōu)于流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)。

Heyse等[27]初步研究了不同操作對凡納濱對蝦幼蝦階段微生物種群結(jié)構(gòu)的影響。通過對干飼料、輪蟲、藻類加入水體前后及換水前后微生物種群動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行18 d監(jiān)測，結(jié)果顯示藻類和輪蟲為系統(tǒng)提供了新的細(xì)菌種群，其中有很大一部分有潛在病原菌，對病害發(fā)展進(jìn)程影響最大，而水體交換前后，微生物種群動(dòng)態(tài)變化并不顯著，并被認(rèn)為不是引入病害的主要原因[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飼料等條件一致的情況下，F(xiàn)TS中的細(xì)菌群落穩(wěn)定性相比RAS較差，說明換水會(huì)對養(yǎng)殖系統(tǒng)水體細(xì)菌群落穩(wěn)定性造成一定的影響，這與Heyse等[27]結(jié)果不同，可能是本試驗(yàn)與其相比進(jìn)行了100 d的長期觀測，增加養(yǎng)殖周期從而觀察出對試驗(yàn)的影響。

本結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的微生物種群比流水式養(yǎng)殖下的微生物種群更穩(wěn)定，這與Vadstein等[28]提出的假設(shè)一致。最近的一項(xiàng)研究通過變性梯度凝膠電泳(PCR/DGGE)分析了16S rDNA基因序列，以比較一個(gè)流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)和一個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖水體和大西洋鱈魚幼蟲的細(xì)菌群落組成[29]?；贐ray-Curtis相似性的排序表明，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)樣本之間沒有明顯的分離；然而，在流水式養(yǎng)殖樣品中微生物群落組成發(fā)現(xiàn)了明顯的分離。此外，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的Bray-Curtis相似性為75%，而流水式養(yǎng)殖中為20%～25%，這表明循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落更加穩(wěn)定。所有這些觀察結(jié)果都支持關(guān)于穩(wěn)定水質(zhì)參數(shù)將對微生物群落演替特征產(chǎn)生重要影響的微生物管理假說。

此外，本研究通過擴(kuò)增子測序還發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)換水養(yǎng)殖模式相比，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)在一個(gè)對蝦養(yǎng)殖周期內(nèi)對弧菌的控制效果更好。這與之前的研究相符。例如楊勝遠(yuǎn)等[30]采用TCBS瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)法對凡納濱對蝦循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中弧菌的消長進(jìn)行了監(jiān)測。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)換水養(yǎng)殖模式相比，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)對非O1群霍亂弧菌,溶藻弧菌和普通變形桿菌控制效果更好。在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)弧菌和普通變形桿菌的數(shù)量均低于對蝦發(fā)病的閾值(104CFU/mL)[30-31]。這也很好地說明了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中可以更好地減少病害的發(fā)生，以提高養(yǎng)殖效率及產(chǎn)量。

4 結(jié)論

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中水質(zhì)參數(shù)在運(yùn)行過程中更加穩(wěn)定，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)較流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)相比能夠更好地維持水體中的細(xì)菌群落，突出了循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)在維持細(xì)菌群落穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢，表明其可以通過提供良好的養(yǎng)殖環(huán)境，從而減少對蝦病害的發(fā)生，提高養(yǎng)殖效率及產(chǎn)量。

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