宋昕宇，羅錦堂，郭若楠，李 新

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院/天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

在生命過程中起著至關重要作用的生物大分子及其結構、功能和組成，一直以來都是科學家們熱忱探索的課題。生命的基本過程就是從DNA 轉錄成RNA，再翻譯成蛋白質，從而發(fā)揮生物學功能的過程，其中RNA 的編碼尤為重要?？茖W家們把RNA 分成編碼RNA 和非編碼RNA(Non-coding RNA)，其中長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)占將近98%。近十年來，隨著對lncRNA 研究的深入，越來越多的研究成果證明了lncRNA 不是基因組上的“ 噪音”，其在諸多生命活動進程和新陳代謝過程中具有極其重要的作用。

作為一個已有大量研究的lncRNA，MEG3(Maternally Expressed Gene 3)，又 稱GTL2 (gene trap locus 2)基因，于2000 年首次被Miyoshi 等人報道，是一個lncRNA，并且是一個母系印記基因。MEG3一般位于染色體末端Dlk1-Dio3 印跡區(qū)內，人的14q32 染色體上。在小鼠上位于12 號染色體，在綿羊上位于18 號染色體，在牛上位于21 號染色體，并且小鼠MEG3 基因與人類具有同源性。

在人類醫(yī)學方面，己有研究表明lncRNA MEG3在2 型糖尿病患者胰島中表達異常。同時，MEG3是第一個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制功能的lncRNA，它在人類的正常組織中廣泛表達。MEG3 還可以通過多種途徑抑制細胞增殖，是一個重要的腫瘤抑制因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)病機制有關。

在維持動物有機體骨骼肌發(fā)育發(fā)面，MEG3 同樣扮演著重要的調控角色，它可以顯著促進衛(wèi)星細胞的分化，調控骨骼肌的發(fā)育過程。MEG3 在小鼠骨骼肌發(fā)育過程中呈現(xiàn)顯著變化，它對C2C12 細胞的分化具有促進作用，而過表達MEG3 對C2C12 細胞的增殖具有抑制作用。MEG3 可以促進小鼠、豬、牛、羊等動物肌肉細胞的分化，抑制細胞增殖，調節(jié)肌肉分化抑制因子。因此，MEG3 可作為畜牧業(yè)生產應用的分子標記。

有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在氧化應激反應中起到一定的作用，然而，關于lncRNA 在氧化損傷小鼠肌肉中表達情況尚不清楚。羅海靜等挑選了5 種與氧化應激有關的LncRNA，試驗結果發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 在氧化損傷小鼠肌肉中的表達最高，這一研究充分證明了lncRNA MEG3 對損傷肌肉的修復起著很大作用。楊睿分別構建了2 種MEG3 的體外表達載體pcDNA3.1-MEG3-TTCC和pcDNA3.1-MEG3-CCCA，并將這2 種體外表達載體瞬時轉染至豬骨骼肌衛(wèi)星細胞中，再對lncRNA MEG3 的相對表達量進行檢測，結果顯示這2 種體外表達載體均能在體外進行表達，且pcDNA3.1-MEG3-TTCC 組的表達量顯著高于pcDNA3.1-MEG3-CCCA 組。該研究說明，這2 種MEG3 的體外表達載體都能在骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化過程中起著重要的調控作用。這一試驗為lncRNA MEG3 對豬骨骼肌生長發(fā)育的調控作用的研究提供了充足的理論依據。

因此，無論是在癌癥或腫瘤等疾病方面，還是在骨骼肌的分化和發(fā)育方面，lncRNA MEG3 都扮演著重要的角色。在前期的研究中，筆者對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞進行了轉錄組學、翻譯組學及微肽組學3 個組學的測序分析，經過多組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)MEG3 具有小的開放閱讀框（sORF）結構，并在微肽組學中發(fā)現(xiàn)與之預測氨基酸序列對應的微肽產物，因此，初步判斷MEG3 可能具有編碼能力，可以編碼產生功能性微肽。鑒于此，我們設計擴增了牛MEG3 基因ORF 區(qū)的編碼序列，構建了融合蛋白載體pcDNA3.1-HisB-MEG3，把重組質粒轉染至293T 細胞，檢測其外源表達情況，為后續(xù)開展更深入的MEG3 功能探究提供材料和夯實基礎，同時也為深入篩選驗證具有編碼產物的lncRNA 提供技術支持和佐證材料。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

293T 細胞、牛骨骼肌衛(wèi)星細胞(BSMSCs)均為天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室凍存。

1.2 質粒

質粒載體為帶有His 表達標簽的pcDNA3.1-HisB（圖1），購自武漢淼靈生物科技有限公司。

圖1 空載質粒pcDN3.1-HisB 基本結構圖

1.3 試劑與耗材

試驗用主要試劑和耗材見表1。

表1 試驗所需主要試劑和耗材

1.4 儀器設備

CO培養(yǎng)箱（Thermo-scientific）；Light Cycle 96熒光定量PCR 儀（Roche）；超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）；制冰機（SANYO）；電泳儀（Bio-Rad）；恒溫循環(huán)水浴鍋（德國勞達貿易有限公司）；高壓滅菌鍋（TOMY）；渦旋振蕩器（德國艾卡公司）；電子天平（美國奧豪斯公司）；超純水制造系統(tǒng)（優(yōu)普）；恒溫搖床（IKA）。

1.5 核苷酸序列

依據轉錄組學、翻譯組學及微肽組學多組學分析結果獲得MEG3 的ORF 核酸序列信息，體外合成末端帶有XhoI 和XbaI 酶切位點的目標片段序列。目的片段由金開瑞生物科技有限公司合成。

1.6 MEG3 外源表達載體構建

將MEG3 ORF 區(qū)的體外合成片段與pcDNA3.1-HisB 空載質粒分別用限制性核酸內切酶XhoI 和XbaI 進行雙酶切處理（酶切體系見表2），37 ℃水浴20 min。酶切產物利用DNA 產物純化試劑盒進行純化回收。調整純化后的目的片段與空載質粒pcDNA3.1-HisB 的比例為質?！媚康钠?1∶3，利用T4 連接酶進行連接，反應條件為22 ℃2 h，4 ℃過夜。隨后將連接產物按照1∶10 的比例加入預先解凍的感受態(tài)細胞中進行轉化。將轉化后的細菌在37 ℃搖床中復活1 h。隨后鋪30 uL 于Amp 平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10～12 h。挑取單克隆菌落接種于5 mL含有氨芐青霉素（1∶1 000）的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，篩選陽性轉化子，將驗證正確的陽性轉化子送至上海生工生物工程有限公司測序，測序引物為F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；R：TAGAAGGCAC AGTCGAGG。利用DNA MAN 軟件進行序列比對分析，測序結果正確的菌液進行質粒抽提，獲得pcDNA3.1-HisB-MEG3 的體外表達載體。

表2 DNA/pcDNA3.1-HisB 酶切體系

1.7 目標微肽體外表達

1.7.1 細胞培養(yǎng) 本研究使用293T 細胞系進行MEG3 的體外表達，使用BSMSCs 進行RNA 水平的定量檢測。

細胞復蘇：取出實驗室凍存的細胞，37 ℃水浴1～2 min 迅速解凍復蘇，加入1 mL 完全培養(yǎng)基（20%FBS+DMEM），離心后棄上清，加入3 mL 完全培養(yǎng)基重懸細胞，轉入60 mm 培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞數量及生長情況。

細胞傳代：當細胞生長至匯合率達到80%～90%時對細胞進行傳代。棄培養(yǎng)基，加入1 mL 胰酶，37 ℃靜置消化2 min，加入1 mL 完全培養(yǎng)基中和胰酶，輕吹重懸細胞，吸取細胞懸液離心，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞,按照適當比例接種于細胞培養(yǎng)板中。持續(xù)觀察細胞狀態(tài)。

1.7.2 細胞轉染 待293T 細胞融合度達到80%，依據Lipofectamine 3000 轉染試劑的說明書要求轉染pcDNA3.1-HisB-MEG3 質粒和對照組pcDNA3.1-HisB 空質粒（NC）。每組試劑設3 個生物學重復。

使用opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋lipofectamine 3000、P3000 和載體質粒。293T 細胞由無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。12 孔板1 孔配置方法A：62.5 μL opti-MEM+3.75 μL lip 3000；B：62.5 μL opti-MEM +2.5 μL P3000+cDNA3.1-HisB-MEG3/pcDNA3.1-HisB 空質粒（NC），加入1 250 ng 質粒。將上述試劑室溫孵育5 min，隨后A、B 兩管中試劑混合均勻再次孵育10 min。加入到293T 細胞培養(yǎng)皿中輕晃搖勻。轉染6 h 后更換為有抗培養(yǎng)基，轉染后24 h 分別收集細胞mRNA 和蛋白樣品，進行后續(xù)分析。

1.8 目標微肽驗證與鑒定

1.8.1 細胞總RNA 提取及外源微肽mRNA 表達鑒定 采用RNA 快速提取試劑盒分別抽提上述轉染了pcDNA3.1-HisB-MEG3 質粒和對照組pcDNA3.1-HisB 空質粒的293T 細胞（24 孔板中培養(yǎng)）的總RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit 說明書進行cDNA 的合成，反轉錄體系見表3。反應程序為：42 ℃15 min，85 ℃5 min。

表3 反轉錄體系

以GAPDH 為內參，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測MEG3 融合蛋白的mRNA 表達情況。引物序列F：ATGTTTTTCCCAAACAGGTTGGTC；R：TTATTGGAGCTCGGAGACGG。每組試驗設置3個生物學重復。

1.8.2 細胞總蛋白提取及Western blot 分析 利用RIPA 蛋白裂解液裂解并收集分別轉染pcDNA3.1-HisB-MEG3 質粒及pcDNA3.1-HisB 空質粒（NC）的293T 細胞的總蛋白樣品。將含有外源表達蛋白的細胞總蛋白通過12%SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離，隨后300 mA 轉膜2 h。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉PVDF 膜2 h，根據目標蛋白分子量大小剪取PVDF 膜，并用適當一抗（anti-His 抗體/DAPDH抗體）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后用熒光標記二抗（Secondary Antibodies-Goat Anti-Rabbit Mouse IgGHRP）室溫孵育1 h。按照1∶1 的比例配置ECL 超敏發(fā)光液，并在超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照保存。分析目的蛋白表達情況。

1.9 統(tǒng)計分析

對qRT-PCR 結果進行t 檢驗分析，按2Ct 計算，GAPDH 基因作為內參對檢測的目的基因進行歸一化處理?！?*”表示差異顯著（P＜0.05），“ **”表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達載體構建及鑒定結果

在前期研究中，筆者團隊發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3 可能具有編碼潛能，能編碼產生微肽，為驗證這一結果，筆者利用前期的微肽組學結果和生物信息學手段，分析獲得了lncRNA MEG3 可能的ORF 區(qū)，該ORF 區(qū)長度為555 bp，可能編碼產生長度為185 aa的微肽（圖2）。因此，筆者人工合成了末端帶有XhoI、XbaI 酶切位點的lncRNA MEG3 的ORF 區(qū)序列（圖3），為了方便后續(xù)試驗，筆者在起始密碼子后同時添加了6×His 以及3×Flag 小分子標簽，再將其連入帶有His 蛋白表達標簽的pcDNA3.1-HisB 質粒中，以增加檢測的敏感性。由圖4 可知，本研究選擇pcDNA3.1-HisB 空載質粒作為載體，經過XhoI、XbaI 雙酶切，可將目的片段連接在空載質粒pcDNA3.1-HisB 上，從而在細胞中表達MEG3 蛋白。質粒中含有T7 啟動子，可大量轉錄表達目標蛋白，6×His 標簽位于目的基因MEG3 的上游，經過PCR擴增獲得了全長6 167 bp 的pcDNA3.1-HisB-MEG3融合載體。

圖2 目的片段核苷酸序列

圖3 MEG3 的ORF 區(qū)序列

圖4 pcDNA3.1-HisB-MEG3 重組質粒圖譜

為驗證pcDNA3.1-HisB-MEG3 融合載體序列的正確性，利用XhoI、XbaI 限制性內切酶進行質粒雙酶切，對酶切產物及重組質粒進行凝膠電泳，如圖5 所示，泳道1 是經過雙酶切的重組質粒，在該泳道中形成一個長度為644 bp 的帶有目的片段的條帶以及一個長度為5 523 bp 的不含目的基因的條帶，2 個條帶的長度均符合要求。由此可以初步判斷，pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達載體構建成功。同時，設計lncRNA MEG3 ORF 區(qū)序列的特異性引物，對pcDNA3.1-HisB-MEG3 的融合載體進行PCR 擴增及測序分析，測序結果如圖6 所示，序列完全匹配，說明pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達載體構建成功。

圖5 pcDNA3.1-HisB-MEG 重組質粒雙酶切結果

圖6 pcDNA3.1-HisB-MEG3 測序結果

2.2 細胞中pcDNA3.1-HisB-MEG3 mRNA 的表達檢測

為了進一步驗證pcDNA3.1-HisB-MEG3 在BSMSCs 中的過表達情況，于BSMSCs 細胞分別轉染pcDNA3.1-HisB 空載體（NC）和pcDNA3.1-HisBMEG3 表達載體24 h 后，提 取BSMSCs 增殖期總RNA，檢測與對照組相比pcDNA3.1-HisB-MEG3 表達水平的變化。如圖7 所示，外源轉入的pcDNA3.1-HisB-MEG3 在BSMSCs 細胞中其mRNA 表達量比NC 對照組高約23 倍，差異極顯著。因此，可以初步判斷在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中 pcDNA3.1-HisB-MEG3 重組載體mRNA 可以正常表達。

圖7 MEG3 mRNA 表達檢測結果

2.3 考馬斯亮藍定性檢測蛋白的表達情況

本研究驗證了pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T細胞中的mRNA 表達水平后，利用考馬斯亮藍染色對pcDNA3.1-HisB-MEG3 編碼的微肽在蛋白水平的表達進行了初步檢測。前期預測出MEG3 ORF 序列編碼一個185 aa 的微肽，將其連入pcDNA3.1-HisB 載體后其編碼的微肽-His 標簽融合蛋白的大小約為17 kDa。考染結果如圖8 所示，帶有目的基因MEG3 的重組質粒轉染293T 細胞后，在25～35 kDa 處（圖中方框處）具有明顯的蛋白條帶，而NC組無明顯條帶，這說明pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T 細胞中表達了融合蛋白產物，證明其能在蛋白水平進行表達。

圖8 293T 細胞中考馬斯亮藍染色定性檢測MEG3 的蛋白表達水平

2.4 Western blot 試驗結果

為進一步驗證MEG3 微肽融合蛋白的外源表達，利用His 標簽蛋白的特異性His 抗體進行了Western blotting 分析。結果如圖9 所示，His 抗體孵育后，在pcDNA3.1-HisB-MEG3 轉染組檢測到明顯的特異性條帶，而NC 對照組沒有檢測到條帶，說明本研究構建的pcDNA3.1-HisB-MEG3 在293T 細胞中融合蛋白成功表達。

圖9 293T 細胞中Western blot 檢測MEG3 的蛋白表達水平變化

3 結論與討論

IncRNA 是一類轉錄本長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，是轉錄組的主要組成部分，它正在成為調控發(fā)育進程中的核心參與者。同時，生物體基因組可以轉錄產生數目巨大、形式各異和功能不同的lncRNA 分子。已有研究結果表明，轉錄lncRNA分子的基因來源于生物體基因組上的許多區(qū)域，并且多數lncRNA 分子序列上都含有小的、未被注釋過的開放閱讀框序列。越來越多的研究表明這些缺少蛋白編碼潛能的lncRNA 分子可以翻譯成為多肽分子并參與相關的生命活動。

胡艷妹等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 在胰島β 細胞高表達，具有組織特異性。干擾MEG3 后，小鼠葡萄糖耐受能力受損，血清胰島素水平降低，胰島素合成能力下降。初步證實，MEG3 可以通過參與胰島素的合成和分泌來維持成年小鼠胰島功能，進一步豐富和完善了胰島發(fā)育和功能維持的基因調控網絡。程寧等研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 可促進白細胞介素1β 誘導的大鼠椎間盤髓核細胞增殖并抑制細胞凋亡，揭示了MEG3 對大鼠椎間盤髓核細胞增殖及凋亡的分子機制起著決定性作用，進一步奠定了MEG3 的研究基礎。

在骨分化和形成方面，有研究表明，MEG3 的表達上調能抑制骨的自噬，從而抑制成骨分化和骨形成代謝。同時，還有不少研究表明，在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中l(wèi)ncRNA MEG3 能夠促進牛原代骨骼肌衛(wèi)星細胞分化。在對動物生長發(fā)育性狀的研究方面，通過剖析4 個綿羊品種的MEG3 基因的不同基因型和單倍型對生長發(fā)育的影響表明，MEG3 基因的不同基因型和單倍型在灘羊的體高、體長和胸圍性狀上存在顯著差異，說明MEG3 對于綿羊生長發(fā)育性狀有影響。

除了在動物上的研究和試驗，在人類醫(yī)學以及各種疾病的研究中，大量研究結果表明，MEG3 在預測宮頸癌患者腫瘤大小和淋巴結轉移方面具有足夠的敏感性和特異性，MEG3 在調節(jié)細胞增殖和凋亡基礎上與宮頸癌的進展有關。因此，MEG3 可能是宮頸癌的一個潛在診斷工具和預后標志物。同時，MEG3 甲基化不僅是宮頸癌的危險因素，也是HR-HPV 感染和淋巴結轉移的危險因素。更多研究表明，MEG3 在多種癌癥中丟失，包括膠質瘤、腦膜瘤、胃癌和膀胱癌。因此，無論是在農業(yè)科學還是人類科學方面，MEG3 都有著巨大的研究價值。

為了后續(xù)在lncRNA 中針對MEG3 基因展開相關研究，本試驗成功構建MEG3 的融合蛋白載體pcDNA3.1-HisB-MEG3，并能夠在外源的293T 細胞中正常表達，為判斷MEG3 對腫瘤和癌癥及其他疾病中潛在作用的研究夯實理論基礎，同時也說明lncRNA MEG3 在骨骼肌的生長發(fā)育中起著重要作用，有利于揭示部分非編碼RNA 也具有編碼潛能這一重要論題。