程云飛， 王路路， 李 赟， 朱葆華， 潘克厚

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003)

鹽度是影響微藻生長的重要因素之一[1]。在海洋環(huán)境中，特別在河口和海岸地區(qū)，鹽度波動很大，這對浮游藻類的代謝反應和分布模式影響極顯著，這也是影響河口和沿海濕地多數(shù)硅藻分布的重要因素[2-4]。Pseudo-nitzschiaaustralis和Ditylumbrightwellii的細胞密度和生長速率的增加與鹽度的增加直接相關(guān)[5-6]，而Thalassiosirapseudonana和Cyclotellameneghiniana的最大生長速率均在較低鹽度條件下出現(xiàn)，從最適鹽度向最適鹽度的兩端生長速率持續(xù)下降[7]。不僅如此，鹽度還顯著影響微藻的形態(tài)，如T.weissflogii[8]、C.meneghinia-na[7]和T.pseudonana[9]的細胞體積隨鹽度增大而減小，Actinocyclusnormanii[10]細胞體積則隨鹽度增大而增大。多數(shù)微藻的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物含量受鹽度水平的影響，調(diào)控鹽度是生產(chǎn)具有高附加值產(chǎn)物的有效手段[11-12]，如低鹽度時T.weissflogii和Chaetoceroscf.wighamii的多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量較高[13-14]；C.vulgaris和A.obliquus增加鹽度(氯化鈉)后不僅提高了脂肪酸含量，也改變了脂肪酸組成[15]，鹽度(氯化鈉)對Naviculasp.的脂質(zhì)和脂肪酸組成也產(chǎn)生了影響，隨著鹽度增加其脂質(zhì)含量增加，但鹽度超過一定值后其脂質(zhì)含量逐漸下降[16]。在大規(guī)模微藻培養(yǎng)過程中，由于持續(xù)地蒸發(fā)及頻繁地添加營養(yǎng)鹽，培養(yǎng)液的鹽度普遍出現(xiàn)增高趨勢，有必要廣泛分析鹽度增加對微藻的形態(tài)特征、生長以及生化組分的影響。

隱秘小環(huán)藻(Cyclotellacryptica)是隸屬于圓篩藻科小環(huán)藻屬的單細胞硅藻，細胞呈圓柱狀，鹽度適應性強，生長快速，富含巖藻黃素[17]和不飽和脂酸，其藻殼具有顯著的止血能力[18]，是開發(fā)新型止血劑的理想材料，其開發(fā)前景廣闊。我們在實驗室條件下研究了不同鹽度條件對隱秘小環(huán)藻生長狀況的影響，發(fā)現(xiàn)不同鹽度下細胞沉降能力有明顯差別，為探究引起差別的原因，本文研究不同鹽度對隱秘小環(huán)藻細胞大小以及硅藻殼特性的影響。本研究可為隱秘小環(huán)藻藻種的培養(yǎng)以及綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 隱秘小環(huán)藻培養(yǎng)及鹽度梯度設(shè)置

隱秘小環(huán)藻來自中國海洋大學應用微藻生物學實驗室藻種庫，f/2培養(yǎng)液用水為青島沿海區(qū)域海水，pH為8.0±0.3，鹽度為30，用0.45 μm混合纖維素酯膜過濾，高溫滅菌(20 min,121 ℃)后加入f/2培養(yǎng)基母液[19]，按照1 000∶1的比例進行混合。藻種培養(yǎng)溫度為20 ℃，光照強度為25 μmol·m-2·s-1，光暗周期為L∶D=12 h∶12 h。

結(jié)合預實驗結(jié)果，調(diào)整海水、淡水(RO)比例，設(shè)置5個鹽度梯度5、10、20、30和40，每一梯度設(shè)置3個平行組，將鹽度30條件下培養(yǎng)的藻細胞接種到滅菌后的各鹽度梯度f/2培養(yǎng)液(500 mL三角錐瓶加300 mL培養(yǎng)液)中，培養(yǎng)期間每天定期搖勻藻液。

1.2 生長、光合潛力及生物量測定

每個鹽度梯度設(shè)置3個平行，實驗期間每天定時取1 mL藻液，使用紫外分光光度計(U-3310,日本)測定藻液OD750值，采用相對生長速率[20]計算公式 μ=(lnNt-lnN0)/t計算不同鹽度條件下隱秘小環(huán)藻的相對生長速率，式中Nt為第t天細胞OD750值，N0為初始細胞OD750值。

每天同一時間各取2 mL藻液，暗處理7 min，使用脈沖振幅調(diào)制式熒光計(Water-PAM fluorometer, Walz, Effeltrich, Germany)測定葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm(PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率)和Y(Ⅱ)(PSⅡ的實際光能轉(zhuǎn)化效率)。

在實驗周期末(第7天)進行生物量的測定。取各鹽度3個平行組的搖勻后的藻液10 mL(V)，使用提前烘至恒重(m0)的GF/C膜(WhatmanTM)抽濾藻細胞，并使用蒸餾水沖洗2～3次，60 ℃烘至恒重后進行稱量(m1)，采用下式計算生物量(g/L)，生物量=(m1-m0)÷V×1 000。

1.3 細胞大小測定

在實驗周期第3天取出搖勻后的各鹽度培養(yǎng)條件下若干體積的藻液，該藻液用于細胞大小的測量，使用光學顯微鏡(CX22LED,OLYMPUS,日本)目微尺測量35個藻細胞的高度(h)和直徑(D)，將細胞視為圓柱體來計算細胞體積(V)。

1.4 沉降率測定

為比較鹽度對試驗微藻沉降速率的影響，待藻細胞培養(yǎng)到平臺期時，每一鹽度水平各準備12支玻璃試管，每支試管加入搖勻藻液4 mL，之后將藻液放置于靜置環(huán)境中使其自然沉降。實驗初始保持各鹽度水平細胞密度一致(OD750值)，分別靜置1、2、4和7 h后取樣，于每個取樣時間點在試管固定位置取1 mL藻液，使用紫外分光光度計(U-3310,日本)測定取樣藻液OD750值。沉降率計算方法如下：沉降率=(OD750值(初始)-OD750值(t))÷OD750值(初始)，式中OD750值(初始)為初始時藻液吸光值，OD750值(t)為第t小時藻液吸光值。

1.5 藻殼物理性質(zhì)測定

將培養(yǎng)至一定濃度的隱秘小環(huán)藻離心(4 000 r/min,5 min,5840R,Eppendorf,Germany)并棄上清，用于提取藻殼。具體方法為：藻泥中加入20 mL濃硫酸，60 ℃水浴1 h，然后加入等體積濃硝酸于60 ℃水浴24 h，篩絹(2 500目)過濾、無水乙醇洗滌，烘干后觀察藻殼形態(tài)及分析物理特性[18]。使用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日立S-4800,日本)觀察藻殼形態(tài)。使用自動氣體吸附分析儀(Autosorb-IQ,Konta,美國)進行N2-解吸等溫線測量藻殼比表面積、孔容和孔徑[18]，隨后根據(jù)吸脫附數(shù)據(jù)進行自動計算。

1.6 數(shù)據(jù)分析

首先計算每個處理的三次重復平均值和標準誤差。用Excel 2019繪圖。使用SPSS 25進行單向方差分析(One-way ANOVA)，在方差分析結(jié)果顯著或極顯著時(P<0.05或P<0.01)，采用多重比較(LSD法)進行組間的顯著性比較。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對隱秘小環(huán)藻的生長、光合系統(tǒng)及生物量的影響

5個鹽度水平下培養(yǎng)的隱秘小環(huán)藻的相對生長速率見表1。表1顯示，不同鹽度(5、10、20、30和40)培養(yǎng)條件下最大相對生長率的差異并不顯著(P>0.05)，但達到最大相對生長率所需的時間不同，與接種前培養(yǎng)液的鹽度(30)相差越大，達到最大相對生長率所需的時間就越長。

表1 不同鹽度培養(yǎng)條件下隱秘小環(huán)藻的相對生長率

與相對生長率的比較結(jié)果不同，初始鹽度為5、10、20、30和40時，隱秘小環(huán)藻第0天的Fv/Fm分別為0.273、0.340、0.510、0.634和0.478，One-way ANOVA表明不同鹽度組的Fv/Fm差異極顯著(P<0.01,見圖1a)。經(jīng)過2 d的適應后，鹽度5、10、20和40條件下Fv/Fm逐漸達到最大值，隨后各鹽度培養(yǎng)下微藻的Fv/Fm均逐漸下降。整個培養(yǎng)期間各鹽度條件下試驗微藻的Y(Ⅱ)一直呈下降趨勢(圖1b)。至培養(yǎng)末期，各實驗組Fv/Fm值和Y(Ⅱ)均差異極顯著(P<0.01)，鹽度5、鹽度10組均顯著高于鹽度20、鹽度30、鹽度40組。

圖1 不同鹽度培養(yǎng)條件下隱秘小環(huán)藻葉綠素熒光參數(shù)變化

隱秘小環(huán)藻的生物量隨培養(yǎng)環(huán)境鹽度的增加而增大。結(jié)果如圖2所示，鹽度5～40水平下隱秘小環(huán)藻的生物量分別為0.170、0.223、0.250、0.343和0.367 g/L,One-way ANOVA分析表明各鹽度組藻細胞生物量差異極顯著(P<0.01)。

(圖中字母為多重比較結(jié)果，鹽度水平間字母相同為差異不顯著、字母不同為差異顯著。The letters represent the multiple comparison results, representing not significantly when same letter exists between the salt levels and significantly when no same letter.)

2.2 鹽度對隱秘小環(huán)藻沉降性能的影響

圖3顯示不同鹽度培養(yǎng)條件下隱秘小環(huán)藻沉降率的變化。在細胞密度一致的條件下靜置1 h，鹽度40實驗組的細胞沉降率為33.2%，其他實驗組細胞并未沉降，相反存在因擴散導致沉降率下降的現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未列出)。靜置2 h，鹽度40實驗組沉降率已達到60%以上，其他鹽度實驗組才開始沉降，但沉降率最大也未超過20%。從靜置4 h開始，各實驗組均開始快速沉降，隨著試驗組鹽度的升高，試驗微藻的沉降率也越高。這說明高鹽度可以促進試驗微藻的快速沉降。

(字母為多重比較結(jié)果，同一取樣時間下鹽度水平間字母相同為差異不顯著,字母不同為差異顯著。The letters represent the multiple comparison results, representing not significantly when same letter exists between the salt levels and significantly when no same letter at same sampling time.)

2.3 鹽度對隱秘小環(huán)藻細胞大小的影響

隱秘小環(huán)藻細胞大小隨培養(yǎng)環(huán)境鹽度水平增加而增大。統(tǒng)計測量結(jié)果如表2所示，鹽度5實驗組與鹽度40實驗組的相比較，藻細胞的高(h)增加約2.1 μm、直徑(D)增加約2.5 μm、體積(V)增加約487 μm3。對鹽度5～40條件下的藻細胞大小進行One-way ANOVA分析表明，藻細胞的高、直徑、體積均差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同鹽度培養(yǎng)條件下隱秘小環(huán)藻細胞大小

2.4 鹽度對隱秘小環(huán)藻藻殼物理性質(zhì)的影響

掃描電鏡顯示，隱秘小環(huán)藻殼面呈圓盤形(見圖4a1—a5)，平均直徑約為10 μm(鹽度30左右時)，表面由殼孔區(qū)、中心區(qū)、肋以及管狀突出結(jié)構(gòu)等組成。藻殼局部(見圖4b1—b5)清晰顯示，殼孔區(qū)所有孔都呈徑向有序排列，大小與形狀存在一定差異，相鄰孔區(qū)之間有呈放射狀分布的肋，多數(shù)肋在殼面邊緣具有管狀突出結(jié)構(gòu)，殼面中心部分相對平整，具有一個或兩個管狀突出結(jié)構(gòu)。局部進一步放大(見圖4c1—c5)顯示，藻殼具有兩層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層孔徑比外層小。比較發(fā)現(xiàn)，鹽度并未明顯影響隱秘小環(huán)藻殼面的形態(tài)特征。

(a,b,c分別代表殼面整體、局部、局部放大；1,2,3,4,5分別代表鹽度5,10,20,30,40。a,b,c represent the frustules entirety, part, partial enlargement respectively； 1, 2, 3, 4, 5 represent salinity 5, 10, 20, 30, 40 respectively.)

為進一步分析鹽度對隱秘小環(huán)藻硅質(zhì)壁物理性質(zhì)的影響，本研究選取鹽度5和40這兩個鹽度差別最大的實驗組，對這兩個實驗組的微藻硅質(zhì)壁的3個物理參數(shù)進行比較，比較結(jié)果如表3所示，雖然這兩個鹽度下硅質(zhì)壁的平均孔徑?jīng)]有差別，但鹽度40實驗組中藻殼的孔容為0.47 cm3/g，是鹽度5實驗組中藻殼孔容(0.15 cm3/g)的3倍以上，說明高鹽度下藻殼的孔數(shù)量大幅增加。由于孔數(shù)量增加，鹽度40實驗組微藻硅質(zhì)壁的比表面積為256.31 m2/g，也是鹽度5實驗組藻殼比表面積(83.40 m2/g)的3倍左右。

表3 鹽度5和40培養(yǎng)條件下隱秘小環(huán)藻藻殼物理性質(zhì)

3 討論

通常認為鹽度是決定河口硅藻分布的一個重要因素，對鹽度變化的耐受性是河口和沿海濕地多數(shù)硅藻生存的先決條件[4]。已有的研究表明[21]，有些微藻可耐受廣泛的鹽度，并表現(xiàn)出對較低鹽度的偏好。我們的實驗結(jié)果表明，本研究的隱秘小環(huán)藻藻株具有廣泛的鹽度適應性，對低鹽度(5、10、20)表現(xiàn)出更好的適應性。當細胞從接種前鹽度30轉(zhuǎn)移到各設(shè)定鹽度時，受鹽度變化的影響，在恢復生長前需要一定時間的代謝調(diào)整，實驗鹽度與接種前鹽度30相差越大，適應時間越長。伴隨著鹽度適應期，可見到接種微藻初始光合能力受到顯著影響。這說明長期適應自然環(huán)境變化的隱秘小環(huán)藻具有突出的應對鹽度波動的調(diào)節(jié)能力[22-23]。在本實驗鹽度條件設(shè)置范圍內(nèi)，隱秘小環(huán)藻的生物量隨鹽度梯度增加而增高。

有研究表明，T.pseudonana和T.weissflogii細胞隨鹽度升高而減小[9,14]，而A.normanii則隨鹽度升高而增大[10]，這說明鹽度對微藻細胞體積的影響存在藻種的差異性。本實驗測量了各實驗鹽度下35個藻細胞的高度、直徑和體積，發(fā)現(xiàn)均具有隨培養(yǎng)環(huán)境鹽度增加而增大的現(xiàn)象，其中鹽度水平差別最大(5和40)的兩組細胞的這三項指標分別相差0.25、0.34和1.26倍，根據(jù)多重比較(LSD法)結(jié)果分析，可將差異來源分為三組，即鹽度5、鹽度10和20、鹽度30和40。細胞大小作為微藻的基本特征之一，從營養(yǎng)獲取到光合生理特征都隨細胞大小而變化[24-25]，由于水生食物網(wǎng)在很大程度上是由被捕食者(如微藻)形態(tài)大小決定的，初級生產(chǎn)者形態(tài)大小的改變可能會影響能量向更高營養(yǎng)水平的傳遞[26-27]。

對于細胞大小與藻細胞沉降的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)隱秘小環(huán)藻的沉降率隨著鹽度增加而增大。在實驗第4 h時，鹽度40組沉降率為88.9%，鹽度5組則僅為12.4%。這說明隱秘小環(huán)藻的大小似乎與藻細胞的沉降存在一定的關(guān)系。一般來說，下沉速率是隨著細胞大小的增加而增大[28]。培養(yǎng)微藻的沉降特性的重要性僅次于生長速率，沉降率不僅決定微藻的采收效率，也是微藻與環(huán)境相互作用、與其他群落營養(yǎng)聯(lián)系的關(guān)鍵生理生態(tài)參數(shù)[29]。為了滿足對光照和營養(yǎng)的需求，沉降是浮游微藻在整個生命周期及其面對不同生態(tài)環(huán)境不斷調(diào)整其浮游狀態(tài)的重要方式[30]。除細胞大小外，在實驗期間我們發(fā)現(xiàn)，沉降前細胞先在一定時間內(nèi)聚集成絮團，隨后以絮團的形式沉降，且在高鹽度下容易形成絮團。由于細胞表面許多官能團都是電負性的，已有研究通過外加成分，提高培養(yǎng)液的電子強度從而加快藻細胞的沉降[31]。我們推測培養(yǎng)液鹽度的增加，提高了培養(yǎng)液的電子強度，中和了細胞表面的電負性，使得高鹽度下藻細胞更容易形成絮團。

對于多數(shù)硅藻，其原生質(zhì)體外有剛性的、具有一定厚度的硅質(zhì)壁保護[32]，可以推斷硅藻細胞大小的變化必然影響硅質(zhì)壁的性質(zhì)，這說明環(huán)境條件變化(如鹽度)，會影響硅藻的硅化作用。對T.punctigera和T.weissflogii的研究表明，不同鹽度培養(yǎng)條件下外部離子強度可改變硅藻生物二氧化硅納米結(jié)構(gòu)，認為外部離子濃度是影響生物硅形成的重要非生物因素[33]。眾多實驗研究[34-37]表明鹽度變化能夠改變許多硅藻的殼面形態(tài)。隱秘小環(huán)藻體表具有硅質(zhì)細胞壁，細胞大小發(fā)生變化后硅質(zhì)細胞壁也應該會發(fā)生改變。但本研究的結(jié)果顯示，在本實驗鹽度水平下隱秘小環(huán)藻藻殼的殼面特征幾乎無顯著變化，對硅質(zhì)壁進行N2-解吸等溫線測量表明鹽度雖沒有影響孔徑大小，但鹽度40條件下該藻藻殼的比表面積和孔容均顯著大于鹽度5條件下的藻殼。有關(guān)藻殼特征與藻細胞沉降的關(guān)系尚未見報道，根據(jù)本研究結(jié)果推測，由比表面積增大導致的藻細胞表面吸附力增強可能是高鹽度下隱秘小環(huán)藻藻細胞容易沉降的原因。

4 結(jié)語

本文主要研究了不同鹽度培養(yǎng)條件對隱秘小環(huán)藻的生長、沉降和藻殼物理性質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明，隱秘小環(huán)藻對鹽度的適應性相當強，實驗鹽度對其相對生長率未產(chǎn)生顯著影響，但同時也看到不同鹽度條件下，隱秘小環(huán)藻的光合潛能存在顯著變化，表明該藻株的光合系統(tǒng)具有應對鹽度變化的調(diào)適能力。不同鹽度培養(yǎng)條件下，隱秘小環(huán)藻的沉降率表現(xiàn)出隨鹽度增加而增快的現(xiàn)象。雖然通過掃描電鏡觀察并未發(fā)現(xiàn)藻殼表面物理特征發(fā)生明顯改變，但藻細胞體積、藻殼總孔體積、藻殼比表面積均隨著鹽度的增加而顯著增大,這表明高鹽度造成的藻細胞體積變大及藻殼物理性質(zhì)變化是隱秘小環(huán)藻藻細胞容易下沉的原因。