馬春玲，藺玉剛，楊 雪，龔真莉，岳亞輝，任善會，王相偉，楊增岐，殷相平，孫躍峰，陳豪泰，萬學瑞*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅蘭州 730070；2.新疆塔里木大學，新疆阿拉爾 843300；3.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730016；4.西北農(nóng)林科技大學，陜西楊凌 712100)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)又稱牛結(jié)節(jié)疹、牛結(jié)節(jié)性皮炎或牛疙瘩皮膚病，是由痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV)牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的一種牛的急性、亞急性傳染病[1-2]。LSDV主要傳播途徑是通過蚊蟲叮咬和機械性接觸進行傳播，主要引起牛頭、頸、肩和乳房等處發(fā)生炎癥反應，會引起牛發(fā)熱、丘疹或皮膚結(jié)節(jié)，嚴重時形成膿皰狀損傷及組織發(fā)生壞死結(jié)痂。目前，缺少針對LSDV 病原體的有效疫苗及防治措施。

世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將LSD列為必須報告的動物疫病，LSD也是《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》 中的二類傳染病[3]。該疫病在1929年首次出現(xiàn)于贊比亞共和國，其后疫情迅速向中東、東歐和中亞等國家地區(qū)蔓延[1-2]。2019年8月12日，中國動物衛(wèi)生與流行病學中心-國家外來動物疫病研究中心確診我國新疆維吾爾自治區(qū)伊犁州發(fā)生LSD，這是我國首次報道LSD疫情。

有研究指出LSDV能在牛腎細胞(MDBK)、非洲綠猴腎臟細胞(Vero)、綿羊睪丸細胞(ovis aries testis,OA3.Ts)、原代羊睪丸細胞和綿陽胚胎皮細胞(ESH-L)中復制傳播[4-5]。幼齡倉鼠腎臟細胞(BHK-21)是多種動物病毒的易感細胞系。BHK-21細胞易于規(guī)?；囵B(yǎng)，是多種動物病毒疫苗生產(chǎn)常用的細胞模型，該細胞經(jīng)過馴服后可以懸浮培養(yǎng)，且已成功應用于多種獸用疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)過程[6-7]。雖然減毒重組的LSDV病毒能夠在BHK-21細胞中成功復制[8]，但是否國內(nèi)流行的LSDV野生型毒株也能夠在BHK-21細胞中復制，LSDV在BHK-21細胞中的復制是否存在毒株及細胞品系的差異，需要進一步研究確定。

考慮到BHK-21細胞模型在動物疫苗生產(chǎn)及動物病毒研究中的重要功能，本試驗用我國流行的LSDV野毒株，探究LSDV對BHK-21細胞的易感性，進而明確LSDV在BHK-21細胞中的生物學特性，期望為后期小鼠動物模型的建立及弱毒疫苗的研制奠定前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 LSDV ORF123及ORF29單克隆抗體,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物病毒病團隊實驗室制備保存；胎牛血清(FBS,貨號CF602)，諾萊生物有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基(貨號66001-20012)，健碩生物科技有限公司產(chǎn)品；支原體檢測試劑盒(貨號40601ES20)，上海翊圣生物有限公司產(chǎn)品；40 mL/L多聚甲醛(貨號P1110)和25 mL/L戊二醛電鏡固定液(貨號P1126)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品； Alexa Fluor 568 goat anti-Mouse IgG熒光二抗(貨號B40942)，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.2 細胞和病毒 BHK-21細胞,中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物病毒病團隊保存提供；LSDV毒株(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)蘭州獸醫(yī)研究所草食動物病毒病團隊分離保存。BHK-21細胞系及LSDV毒株均經(jīng)過支原體檢測為陰性。

1.1.3 主要儀器設備 Bio-Rad蛋白印跡電泳儀及轉(zhuǎn)膜槽(貨號1703930)，廣州威佳科技有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(型號HT770)，上海日立電子有限公司產(chǎn)品；萊卡TCS SP8 MP多光子顯微鏡(型號TCS SP8)，德國萊卡儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)接毒 將BHK-21細胞傳代與9瓶T25培養(yǎng)瓶中，待細胞生長覆蓋率達到90%～100%時，將其中8瓶BHK-21接種LSDV/FJ/CHA/2021毒株，攻毒劑量為1×107TCID50/mL，將其中1瓶細胞作為空白對照，置37℃和5% CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，標記日期。隨后，每日拍照觀察細胞狀態(tài)和形態(tài)變化，整個試驗期間確保細胞營養(yǎng)狀態(tài)良好，連續(xù)觀察8 d。

1.2.2 透射電鏡觀察 將細胞接種于直徑T75細胞瓶中，在細胞達到培養(yǎng)瓶的70%～80%時，接毒種LSDV/FJ/CHA/2021毒株。待感染后第5天，加入適量4℃預冷的PBS，洗滌細胞2次，接著用細胞刮沿著一個方向輕輕將細胞刮下，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。輕輕加入預冷的25 mL/L戊二醛混合液固定，4℃冰箱中靜置過夜。第2天送交電鏡處理室進行處理。待檢測樣品制備后，放于透射電子顯微鏡(HT770，日立電子)觀察并拍照。

1.2.3 蛋白免疫印跡 病毒感染試驗完畢后，連續(xù)8 d收集BHK-21細胞并裂解提取總蛋白，獲得已感染LSDV的蛋白樣品，將樣品置100℃金屬浴15 min煮沸處理后使蛋白變性，進行蛋白質(zhì)免疫印跡。用SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)印到NC膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h。用LSDV ORF123和ORF29單克隆抗體進行內(nèi)源性病毒蛋白檢測，內(nèi)參對照選擇β-actin。最后用免疫印跡方法分析蛋白表達情況。

1.2.4 間接免疫熒光(IFA) LSDV(LSDV/FJ/CHA/2021毒株)感染BHK-21細胞，在感染后第3天，收集IFA樣品。PBS清洗后用40 mL/L多聚甲醛4℃條件下，固定1 h，用5 mL/L Triton X-100透化10 min，用50 g/L BSA于37°C恒溫箱封閉1 h，LSDV ORF123單克隆抗體(1∶1000)在37℃條件下孵育 3 h后，用Alexa Fluor 594 goat anti-Mouse IgG熒光二抗(1∶1000)孵育1 h，最后用DAPI(1∶1000)染色細胞核，用抗淬滅劑封片，過夜干燥后，用萊卡激光共聚焦顯微鏡，觀察并拍照。

1.2.5 BHK-21細胞培養(yǎng)液上清中病毒含量的測定 將凍存在-80℃冰箱中的LSDV感染BHK-21的細胞培養(yǎng)液上清樣品，進行10-1～10-11細胞毒稀釋，加入到已經(jīng)鋪好BHK-21細胞的96孔板，逐日觀察并記錄LSDV在BHK-21細胞上的生長特性，計算TCID50，利用GraphPad軟件繪制LSDV生長曲線。

1.2.6 生物安全聲明 LSD感染的相關(guān)實驗均在中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所完成，整個試驗過程嚴格按照中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所的3級生物安全實驗室的操作指南進行。

2 結(jié)果

2.1 LSDV感染BHK-21細胞誘導的細胞病變觀察結(jié)果

相較于陰性照組(Mock組)BHK-21細胞呈柳葉形，LSDV接毒感染的第2天BHK-21細胞核周圍匯聚及腫脹皺縮現(xiàn)象(白色箭頭所指)。細胞接毒感染到第4天后，細胞核周圍的染色質(zhì)發(fā)生明顯凝聚，部分細胞脫落和大量崩解，最后形成多個待脫落的細胞團(圖1)。表明LSDV感染能夠在BHK-21細胞中產(chǎn)生細胞聚集、細胞皺縮及細胞脫落的典型細胞病變，提示LSDV能夠成功感染BHK-21細胞。

2.2 LSDV能夠在BHK-21細胞中建立高效復制

為了進一步確定LSDV能夠感染BHK-21細胞，用病毒的特異性單克隆抗體檢測感染LSDV的BHK-21細胞中的LSDV ORF123和LSDV ORF29蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)在23 ku～40 ku能夠檢測到病毒蛋白的特異性條帶(圖2)，呈現(xiàn)時間依賴性增加，蛋白大小與預期結(jié)果相符，證明LSDV病毒蛋白獲得了良好的表達，而且也具有良好的反應原性。通過測定LSDV感染BHK-21細胞TCID50繪制生長曲線，生長曲線結(jié)果表明LSDV能夠在BHK-21中高效復制，該結(jié)果同圖3細胞內(nèi)LSDV ORF123和ORF29蛋白條帶與β-actin的灰度掃描的結(jié)果相一致。BHK21細胞培養(yǎng)上清中的病毒含量在第7天最高，達到復制的平臺期(圖4)。

為了進一步證明LSDV能夠感染BHK-21細胞，用IFA方法檢測在BHK-21細胞中LSDV ORF123蛋白表達的細胞定位(圖5)，在感染LSDV 3 d后的BHK-21細胞內(nèi)中有大量點狀紅色熒光，表明LSDV ORF123病毒蛋白在BHK-21細胞中獲得了良好的表達且位于細胞質(zhì)。結(jié)果表明國內(nèi)流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株能夠在鼠源BHK-21細胞中成功感染并高效復制。

a.空白對照; b.LSDV感染第2天; c.LSDV感染第4天; d.LSDV感染第6天

M.蛋白分子質(zhì)量標準; 0.空白對照組; 1～8.LSDV 感染天數(shù); a.LSDV ORF29蛋白; b.LSDV ORF123蛋白; c.內(nèi)參β-actin蛋白

2.3 BHK-21細胞內(nèi)LSDV病毒工廠及病毒粒子形態(tài)觀察

LSDV是大的雙鏈有囊膜DNA病毒，呈現(xiàn)典型的“磚型”或“大卵圓型”病毒粒子，大小約360 nm×270 nm×250 nm。為了觀察LSDV在BHK-21細胞中的病毒粒子形態(tài)及病毒工廠位置，用透射電鏡對LSDV感染BHK-21細胞的病毒復制工廠和各種病毒粒子形態(tài)進行觀察。圖6可清晰觀察到位于細胞質(zhì)中的“病毒工廠”(白色圓圈線)。也能夠在BHK-21細胞(1、2和3)中清晰觀察到位于LSDV病毒工廠內(nèi)部的各種未成熟病毒粒子形態(tài)。同時，在BHK-21細胞(圖7)病毒工廠中，可觀察到典型的“磚型”或“大卵圓型”胞內(nèi)成熟的病毒粒子。

圖3 LSDV在BHK21中ORF123和ORF29蛋白的灰度掃描

圖4 BHK-21細胞培養(yǎng)上清中LSDV滴度的一步生長曲線

成熟病毒粒子呈雙凹面核心體、兩個側(cè)小體、外面還有一層細胞囊膜，后者呈桶形，囊膜內(nèi)含有病毒特異性蛋白質(zhì)，囊膜外表呈皺褶狀，形成不規(guī)則的突起(圖7)。病毒粒子內(nèi)部的雙凹面核心體呈啞鈴狀，病毒基因組集中在核心體中，核心的外壁由兩層蛋白外膜組成。內(nèi)膜層是連續(xù)的，有一定數(shù)量的通道，內(nèi)膜厚度和密度與質(zhì)膜相似。外層膜結(jié)構(gòu)類似柵欄結(jié)構(gòu)，有釘子形狀物鑲嵌在內(nèi)層膜上。透射電鏡觀察結(jié)果表明，LSDV的“病毒工廠”位于感染細胞的“細胞質(zhì)”。

a.細胞核; b.細胞質(zhì); c.細胞核與細胞質(zhì)合并; (1) 牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒ORF123蛋白

a.病毒學工廠; 1～3.LSDV病毒工廠內(nèi)部的各種未成熟病毒粒子; b.未成熟病毒粒子

(a).LSDV病毒工廠內(nèi)部的各種成熟病毒粒子; (1～3).成熟的病毒粒子(a).The mature virions in the viral factory; 1-3.The mature virions

3 討論

LSDV與牛痘病毒(Cowpox virus，CPXV)差異很大，而與綿羊痘病毒(Sheep pox virus，SPPV)和山羊痘病毒(Goat pox virus，GTPV)相似，同屬于羊痘病屬(CaPV)[9]。目前，針對LSDV感染的致病機制和免疫逃逸研究較少，缺少針對該疫病的特異性疫苗和較好的治療方法與手段。

針對LSDV的研究大部分集中在MDBK細胞、Vero細胞、OA3.Ts細胞和ESH-L等細胞中開展[4-5]。BHK-21細胞模型具有易于培養(yǎng)、傳代快以及可以無血清懸浮培養(yǎng)的特性，而且已被廣泛的應用在多種動物病毒感染及疫苗生產(chǎn)制備過程，如口蹄疫病毒[6]、狂犬病病毒[7]和新城疫病毒[10]的研制。考慮到BHK-21細胞模型的優(yōu)良特性和廣泛適用性，本研究利用BHK-21細胞培養(yǎng)LSDV，結(jié)果證實國內(nèi)流行的LSDV野毒株能夠感染BHK-21細胞，蛋白免疫印跡和生長曲線結(jié)果表明細胞內(nèi)和細胞外的LSDV病毒呈現(xiàn)時間依賴性的方式進行高效復制。研究結(jié)果為利用BHK-21懸浮擴大培養(yǎng)，用于LSDV滅活疫苗及小鼠動物模型的建立提供了理論基礎。

近年對于痘病毒生物學特性的大部分知識儲備來自于針對痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)的研究中[12-16]，特異性針對LSDV生物學特性的研究較少?；陔p脫氧測序方法，有研究繪制了LSDV(Neethling 2490毒株，GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為AF325528.1)的基因組結(jié)構(gòu)示意圖，編碼大約156個開放性閱讀框[11]。病毒工廠是由宿主細胞的細胞器膜的廣泛重排而構(gòu)成的隔間區(qū)間，位于細胞質(zhì)或細胞核。研究表明細小病毒等較小的DNA病毒的復制需要宿主“細胞核”內(nèi)的復制體系支持。然而，較大的痘苗病毒(VACV)由于自身攜帶完整的DNA合成系統(tǒng)，不依賴宿主細胞的復制體系，而是利用病毒的DNA聚合酶，可以在沒有宿主復制體系的“細胞漿”內(nèi)復制[12]。對于成熟的VACV來說，可以直接和細胞膜進行融合，也可以通過巨胞飲內(nèi)吞進細胞，在宿主細胞“內(nèi)體”里病毒的外膜與“內(nèi)體”膜融合釋放出內(nèi)膜包繞的病毒核心。釋放出來的病毒核心可以發(fā)生脫殼，將病毒的基因組釋放出來。VACV脫殼之后釋放DNA，在DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用下，在病毒復制工廠內(nèi)進行早期、中期和晚期基因組蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯。 VACA的病毒工廠位于“細胞質(zhì)”內(nèi)的一些內(nèi)膜的孔洞內(nèi)，在閉合的孔洞中VACA病毒粒子進一步成熟，形成典型的痘病毒的啞鈴形態(tài)[12]。LSDV能夠成功的在易感宿主細胞質(zhì)內(nèi)的“病毒工廠”建立高效感染與復制的每個過程，是一個精密嚴謹且復雜的生物學過程。本研究透射電鏡結(jié)果表明，相似于VACV，痘病毒科羊痘病毒屬中的LSDV不依賴于宿主復制系統(tǒng)，而是依賴于病毒編碼的DNA依賴的RNA聚合酶，在“細胞質(zhì)”內(nèi)的“病毒工廠”中高效復制，進行“早期、中期和晚期”病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄與復制，繁衍子代病毒[12]。成熟的LSDV粒子外觀呈現(xiàn)典型“磚型”或“大卵圓型”。對于LSDV在易感宿主細胞質(zhì)內(nèi)是如何準確的完成病毒顆粒組裝以及整個LSDV復制，周期過程中是如何實現(xiàn)病毒蛋白“早期、中期和晚期”的表達調(diào)控等一系列科學問題進行深入研究，將有助于人們更好地理解LSDV復制周期，有利于針對LSDV蛋白功能探尋新的藥物靶點。