羅群鳳， 馮源恒， 吳東山， 楊章旗

( 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院， 國家林業(yè)局馬尾松工程技術(shù)研究中心， 廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心， 南寧 530002 )

大明松(var.)為松科(Pinaceae)松屬()植物，因1974年首次在廣西大明山發(fā)現(xiàn)而得名，1975年由中國裸子植物分類學(xué)家鄭萬鈞、傅立國等鑒定并發(fā)表于《植物分類學(xué)報》(鄭萬鈞等，1975)。它是黃山松()在我國西南分布區(qū)的一個變種(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1978；梁盛業(yè)，1994)，它們之間的區(qū)別在于大明松葉內(nèi)兼有中生與邊生樹脂道，而黃山松只有中生樹脂道(樊國盛和薛紀(jì)如，1993)。大明松主要分布于廣西、貴州海拔1 000 m以上的高山，自南向北分別是廣西的大明山、大瑤山、銀竹老山以及貴州的雷公山、云臺山、梵凈山、大沙河等地，總體呈不連續(xù)點(diǎn)狀分布。大明松喜光，適應(yīng)涼爽、空氣濕度較大的高山氣候，在土層深厚、排水良好的酸性土及向陽山坡生長良好，耐瘠薄，但生長遲緩。大明松材質(zhì)堅(jiān)實(shí)，富含樹脂，可制作家具、器具、板材等，也可作建筑、礦柱及木纖維工業(yè)原料等，為西南高海拔地區(qū)重要的用材造林樹種，且其樹形姿態(tài)優(yōu)美，亦是重要的景觀樹種。

由于長期被人們忽視，大明松沒有被系統(tǒng)地利用與保護(hù)，種群分布狀況、遺傳多樣性水平、自然更新能力都缺乏系統(tǒng)、針對性的調(diào)查與研究。目前，對大明松的研究報道很少，僅賈婕等(2019)通過比較研究大明松、馬尾松、細(xì)葉云南松、拉雅松的種實(shí)性狀，分析了這4種松樹的繁育對策及交配系統(tǒng)狀況；馮源恒等(2019)對廣西和貴州的大明松種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查，摸清了黔桂兩省(區(qū))大明松種質(zhì)資源的分布特征，但沒有對其群體遺傳多樣性水平進(jìn)行分析與評價。因此，亟須對現(xiàn)存的大明松天然群體遺傳資源進(jìn)行多樣性研究。

遺傳多樣性是生物群體長期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存適應(yīng)和發(fā)展的前提。遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。因此，對其進(jìn)行研究有助于生物群體的保護(hù)與利用。目前，遺傳標(biāo)記是研究遺傳多樣性最常用的手段，其中SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記是多態(tài)性最高，也是應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記之一。周海蘭等(2021)用23對SSR多態(tài)性引物對收集的54份油梨種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析了這些種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系；臧明月等(2021)利用SSR分子標(biāo)記對白櫟天然居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，為其種質(zhì)資源的合理開發(fā)與保護(hù)提供指導(dǎo)；陳罡等(2020)利用10對新開發(fā)的蒙古櫟特異的核SSR分子標(biāo)記，分析了遼寧省境內(nèi)分布蒙古櫟天然群體的遺傳多樣性水平；陳林楊等(2020)利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對取自不同地方的35份柚種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為柚資源的保護(hù)、品種鑒定及遺傳改良提供借鑒與依據(jù)。

鑒于此，本文利用SSR分子標(biāo)記對大明松天然群體開展遺傳多樣性研究，分析其多樣性水平及遺傳分化情況，將有力加強(qiáng)對稀有樹種的保護(hù)力度，促進(jìn)生物多樣性保護(hù)與生態(tài)環(huán)境建設(shè)，為科學(xué)利用稀有松類資源打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。因此，研究我國黔桂地區(qū)大明松天然群體遺傳多樣性具有重要理論和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料包括3個天然群體，分別為廣西大明山群體、貴州梵凈山群體、貴州大沙河群體(表1)。其中，大明山群體(DM)取自廣西大明山國家級自然保護(hù)區(qū)仙人臺(108°25′54″—108°25′58″ E、23°30′12″—23°30′13″ N)，屬南亞熱帶濕潤山地季風(fēng)氣候。無霜期292～312 d，日照時間長，光熱充足。夏濕冬干，干冷同期，濕熱同季，氣候垂直變化明顯(馮源恒等，2019)。

表 1 大明松群體樣本信息Table 1 Population sample information of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

梵凈山群體(FJ)取自貴州梵凈山國家級自然保護(hù)區(qū)棉絮嶺(108°39′46″—108°39′52″ E、27°54′45″—27°54′46″ N)，屬中亞熱帶濕潤山地季風(fēng)氣候。無霜期270～278 d，相對濕度平均達(dá)80%(馮源恒等，2019)。

大沙河群體(DS)取自貴州大沙河國家級自然保護(hù)區(qū)甑子巖(107°35′04″—107°35′09″ E、29°08′13″—29°08′22″ N)，屬北亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候。大沙河地形北高南低，最高海拔1 939.9 m，最低海拔560 m，平均海拔1 400 m，相對濕度88%(馮源恒等，2019)。

每個群體按照株距30 m，采集30株以上樣本。因大明山群體空間較小，僅采集到26株。將采集的針葉裝入離心管，填充硅膠進(jìn)行干燥處理，便于保存。

1.2 方法

1.2.1 大明松DNA提取方法 采用改良的CTAB裂解—硅珠吸附法(Doyle & Doyle，1990)提取大明松針葉DNA并純化，通過瓊脂糖凝膠電泳(1%濃度)抽樣檢測樣本DNA 質(zhì)量，采用紫外分光光度計(jì)測定各樣本DNA濃度，稀釋至統(tǒng)一濃度后置于-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大明松SSR引物來源及PCR反應(yīng)條件 研究所使用的SSR引物是根據(jù)馬尾松基因組DNA 測序所得序列設(shè)計(jì)開發(fā)獲得(馮源恒等，2016)，并使用8個大明松DNA樣品進(jìn)行引物篩選，選取主帶清晰且有多態(tài)性的引物12對，用于本實(shí)驗(yàn)的群體遺傳多樣性研究。引物設(shè)計(jì)由上海捷瑞基因技術(shù)有限公司合成，Taq酶、dNTPs等也購自該公司。

PCR反應(yīng)體系為10 μL：10 mmol·LpH 8.0Tris-HCI，50 mmol·LKCI，2.5 mmol·LMg，0.2 mmol·LdNTPs，2.5 pmol引物，0.08 U Taq聚合酶，10～20 ng DNA。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃4 min；94 ℃15 s，55～60 ℃15 s，72 ℃30 s，25 cycles； 72 ℃延伸20 min結(jié)束PCR反應(yīng)(馮源恒等，2016)。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并銀染檢測，實(shí)驗(yàn)方法參照楊章旗等(2014)方法進(jìn)行。

1.2.3 遺傳多樣性分析 SSR 條帶判讀參照楊章旗等(2014)方法進(jìn)行。獲得SSR分型數(shù)據(jù)后，采用POPGENE32軟件(Yeh et al., 1997)計(jì)算12個位點(diǎn)的下列遺傳多樣性參數(shù)：多態(tài)位點(diǎn)百分率(percentage of polymorphic loci，PPL)；多態(tài)信息含量(polymorphic information content, PIC)；觀察等位基因數(shù)(number of observed alleles，)；有效等位基因數(shù)(number of effective alleles，)(Hartl et al., 1989)；Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index，)(Shannon et al., 1949)；觀察雜合度(observed heterozygosity，)；期望雜合度(expected heterozygosity，)(Nei et al., 1973)；Nei’s基因多樣度()。并基于上述參數(shù)進(jìn)一步計(jì)算大明松群體的固定指數(shù)()、基因分化系數(shù)()和基因流()及遺傳距離(genetic distance，GD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于種間通用性的大明松SSR引物篩選

根據(jù)引物篩選結(jié)果獲得用于大明松遺傳多樣性檢測的SSR引物12對。比較這12對引物在大明松和馬尾松(馮源恒等，2016)群體間的觀察等位基因數(shù)可知，大明松有6對引物的等位基因數(shù)比馬尾松少，有3對引物與馬尾松相同，只有3對引物的等位基因數(shù)比馬尾松多，平均觀察等位基因數(shù)大明松、馬尾松分別為3.08和3.50，說明馬尾松在這些位點(diǎn)上具有更為豐富的遺傳變異(表2)。

表 2 大明松與馬尾松等位基因數(shù)比較Table 2 Comparison of allelic number between Pinus taiwanensis var. damingshanensis and P. massoniana

2.2 大明松天然群體遺傳多樣性分析

由表3可知，12對引物在3個群體94個樣本中共檢測到等位基因37 個，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%。12個SSR位點(diǎn)平均觀察等位基因數(shù)為3.08，有效等位基因數(shù)在1.16 ～2.87之間，平均為1.68，不同位點(diǎn)間有效等位基因數(shù)差異較大。觀察雜合度的值范圍在0.14～0.66之間，平均為0.35；期望雜合度的值在0.12～0.92之間，平均為0.40，不同位點(diǎn)的雜合度也存在較大差異。12個SSR位點(diǎn)Shannon’s信息指數(shù)平均為0.62，Nei’s基因多樣度平均為0.35。多態(tài)信息含量的值在0.13～0.58之間，平均為0.31，最高為PF695位點(diǎn)，最低為PF464位點(diǎn)。

表 3 大明松天然群體的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of natural populations of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

由表4可知，分別統(tǒng)計(jì)3 個大明松群體的遺傳多樣性參數(shù)，比較群體間遺傳多樣性水平。3個群體的觀察等位基因數(shù)高到低排序?yàn)榇笊澈尤后w>梵凈山群體>大明山群體。而3 個群體的有效等位基因數(shù)、期望雜合度、Shannon’s信息指數(shù)與Nei’s基因多樣度由高到低排序均為大沙河群體>大明山群體>梵凈山群體。說明大沙河群體遺傳多樣性最為豐富，其次為大明山群體，梵凈山群體最低。

表 4 大明松天然群體間遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversities among natural populations of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

2.3 大明松群體遺傳結(jié)構(gòu)與基因流分析

大明松群體的種群平均近交系數(shù)()為-0.16，復(fù)合種群平均近交系數(shù)()為-0.26，說明大明松群體偏離哈迪-溫伯格平衡，表現(xiàn)出雜合子過?，F(xiàn)象。大明松群體有親緣關(guān)系種群間的平均近交系數(shù)()為0.08，群體間不存在明顯的遺傳分化?；谥涤?jì)算大明松群體間基因流(gene flow，)，值在不同位點(diǎn)的變化范圍為0.43～31.68，平均為2.74，可知大明松3個群體間的基因交流比較充分。

通過分析大明松群體的遺傳分化情況可知(表5)，大明松群體內(nèi)的遺傳多樣性占87.64%，群體間遺傳多樣性占12.36%；由基因多樣度計(jì)算出的群體間的基因分化系數(shù)為0.10，而群體內(nèi)基因多樣性比值為0.90。這表明，大明松群體間的遺傳分化水平較低，大部分變異均存在群體內(nèi)。

表 5 大明松群體遺傳分化Table 5 Genetic differentiation of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

2.4 大明松天然群體遺傳距離分析

大明松天然群體間遺傳距離(genetic distance，GD<0.077 0)偏小，且大明山和大沙河群體遺傳距離相對較近(GD=0.026 9)；群體遺傳一致度(genetic identity，GI>0.925 9)較高(表6)。

表 6 群體間的Nei’s遺傳距離和遺傳一致度Table 6 Nei’s genetic distance and genetic identity between populations

3 討論與結(jié)論

3.1 大明松總體遺傳多樣性評價

基于12個位點(diǎn)37個等位基因的遺傳多樣性結(jié)果顯示，大明松天然群體觀察等位基因數(shù)在2.33～2.83之間，平均為2.61；觀察雜合度和期望雜合度分別介于0.32～0.49、0.28～0.40，平均分別為0.40和0.33；Shannon’s信息指數(shù)為0.54，Nei’s基因多樣度為0.32。而Al-Rabab′ah和Williams(2002)研究火炬松()的觀察等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度分別為7.75、0.52、0.65，Mehes等(2009)研究白松()時的這三個值分別為6.50、0.72、0.81，Karhu等(2006)研究輻射松()的觀察等位基因數(shù)、觀察雜合度分別為8.19和0.73。與以上同屬植物相比較，大明松群體各項(xiàng)指數(shù)都較低，遺傳多樣性水平偏低(表7)。

表 7 松屬樹種間遺傳多樣性參數(shù)比較Table 7 Comparison of genetic diversity parameters among Pinus species

另外，歐洲云杉()雜合度為 0.79(Pfeiffer et al., 1997)，黃杉()雜合度為 0.67(Amarasinghe et al., 2002)，歐洲栓皮櫟()雜合度為 0.65(Hornero et al., 2001)。與以上不同屬樹種比較，大明松群體雜合度指數(shù)也較低。一方面，這可能與大明松片段化的地理分布特點(diǎn)有關(guān)。本次調(diào)查的3個大明松群體規(guī)模均較小，分布范圍也相對狹小，不同群體間地理間隔大。因而其遺傳變異水平低于火炬松、輻射松等種群規(guī)模且大面積連續(xù)分布的松類。另一方面，本研究采用的SSR引物是從馬尾松基因組中開發(fā)的，種間通用性較好的分子標(biāo)記其所在序列往往較為保守，從而導(dǎo)致標(biāo)記的多態(tài)性較低。

3.2 大明松群體遺傳結(jié)構(gòu)特征

研究中發(fā)現(xiàn)大明松群體內(nèi)的遺傳變異(87.64%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于群體間的遺傳變異(12.36%)，群體間的遺傳分化水平偏低，大部分變異均存在于群體內(nèi)。群體間的基因流平均為2.74，表明3個大明松群體之間基因交流比較充分。由于松樹屬于風(fēng)媒傳粉，花粉具有很強(qiáng)的遠(yuǎn)距離散播能力，因此， 遠(yuǎn)距離地理隔離雖然對大明松群體間的基因交流具有一定的限制作用，但還未導(dǎo)致群體間明顯的遺傳分化。許玉蘭等(2016)對云南松天然群體遺傳多樣性研究及武文斌等(2018)對油松群體遺傳多樣性研究時也得出近似結(jié)論。由此推論，大明松不同群體間的表型多樣性差異在很大程度上是因環(huán)境差異而形成，在遺傳水平還未發(fā)生明顯分化。因此，大明松種質(zhì)資源的選擇、收集及保存策略，應(yīng)以在各群體內(nèi)選擇、保存具有優(yōu)良性狀的單株為主。

研究中還發(fā)現(xiàn)大明松群體的觀測雜合度大于期望雜合度，表現(xiàn)出雜合子過剩的現(xiàn)象，說明大明松群體可能發(fā)生過外來基因的遷入或漸滲。大明松與黃山松一樣，都和馬尾松是垂直方向的替代種(馮源恒等，2019)。而黃山松與馬尾松間存在基因漸滲現(xiàn)象(羅世家等，2001；翟大才等，2018)，因此，大明松極有可能與本區(qū)域內(nèi)馬尾松發(fā)生基因漸滲。