倪 萌， 王 娟， 王 爽， 梅 燚， 柳李旺， 徐 良， 王 燕

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室/園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002)

蘿卜(RaphanussativusL.)為十字花科重要根菜類作物，營養(yǎng)豐富、藥用價值高[1-2]，屬于典型異花授粉植物，雜種優(yōu)勢明顯，多具有自交不親和性(Self-Incompatibility，SI)，保證了遺傳多樣性[3-4]。利用自交不親和系進行雜交制種是利用雜種優(yōu)勢的重要途徑之一，避免了去雄操作，具有優(yōu)勢強、選育易、周期短等優(yōu)點。然而在實際生產(chǎn)中，蘿卜自交結(jié)籽困難限制了自交不親和系的繁殖與保存，不利于其在優(yōu)勢育種中的廣泛應(yīng)用。

為提高自交不親和系的繁殖效率，育種工作者對克服SI的物理方法、化學(xué)方法、生物方法進行了研究。目前廣泛應(yīng)用的CO2處理[5]、高溫處理[6]、鋼刷授粉[7]、射線輻射[8]等方法均可在一定程度上提高自交結(jié)實率，但操作困難，且效果不穩(wěn)定，難以實現(xiàn)廣泛應(yīng)用。近年來，研究人員嘗試?yán)枚喾N化學(xué)方法進行SI的克服，如利用鹽硼溶液(5%的氯化鈉與2%的硼酸的復(fù)合溶液)、植物激素處理。結(jié)果表明，化學(xué)試劑能夠明顯提高甘藍(lán)、白菜等蕓薹屬作物的親和性[9-10]。汪騫等[11]發(fā)現(xiàn)，3%的NaCl溶液能有效提高蘿卜的親和性，可接近人工蕾期授粉效果?；ㄆ趪娛㎞aCl溶液雖然具有價格低廉、節(jié)省人力物力的優(yōu)點，但是效率不高，且在應(yīng)用上易造成作物鹽脅迫。此外，吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、細(xì)胞分裂素(6-BA)、赤霉素(GA3)等植物激素被發(fā)現(xiàn)可有效抑制蕓薹屬植物、百合和矮牽牛等植物的自交不親和性，但不同作物之間差異較大，且在蘿卜屬作物上克服自交不親和性的效果尚未明確。因此，急需尋找一種提高蘿卜自交不親和系親本繁殖效率的方法。

孢子體自交不親和主要表現(xiàn)為花粉水合與花粉管進入柱頭受到阻礙，導(dǎo)致受精過程不能完成。近期研究報道，孢子體SI植物的自交不親和性與柱頭活性氧(ROS)強度呈正相關(guān)[12-15]。在大白菜柱頭發(fā)育后期，自花花粉能夠誘導(dǎo)花期柱頭產(chǎn)生過量ROS，從而阻止花粉的萌發(fā)與花粉管的生長[15]。而在親和擬南芥中，自花授粉后ROS在柱頭中含量顯著降低，花粉能夠正常水合。因此，花粉管生長情況與柱頭ROS強度可作為判斷自交不親和性的依據(jù)。

本研究利用不同濃度的槲皮素(Quercetin，QUE)、油菜素內(nèi)酯(Bassinolide，BR)、褪黑素(Melatonin，MT)和激動素(Kinetin，KT)對3份蘿卜高代自交系花期柱頭進行噴施處理，比較不同處理下蘿卜的結(jié)莢率和親和指數(shù)。同時結(jié)合花粉管體外萌發(fā)及柱頭ROS強度變化的差異，篩選克服自交不親和性的最優(yōu)化學(xué)方法，以建立克服蘿卜自交不親和性技術(shù)體系，進一步提高蘿卜自交不親和材料的繁殖效率，促進蘿卜雜種優(yōu)勢的大面積應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用3個蘿卜高代自交系為試驗材料(表1)。種子消毒后在培養(yǎng)皿中催芽1～2 d，4 ℃春化30 d，2020年8月播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地的溫室大棚?；瘜W(xué)處理及授粉試驗于2020年11月至2021年5月進行。

表1 供試蘿卜材料

1.2 試驗方法

1.2.1 化學(xué)處理 本試驗設(shè)置不同濃度的QUE、BR、MT和KT共10個處理(表2)，其中100 mg/L激動素為本研究室前期篩選，空白對照組為去離子水處理，同時進行花期自交(Flowering pollination，F(xiàn)P)與蕾期自交(Bud pollination，BP)處理。選取各自交系長勢一致的植株，提前套袋，隔離授粉。于盛花期選取當(dāng)天開的花進行噴施處理，每個處理5次重復(fù)，每個重復(fù)處理20～30朵花，柱頭干后進行人工自花授粉。其中MT易光解，處理后需要進行遮光處理。授粉5 d后拆袋，30～45 d后，待種子成熟后收獲。

表2 化學(xué)試劑及其處理濃度

1.2.2 親和性測定 待種莢成熟后，計算各處理與對照的結(jié)莢率及親和指數(shù)。蘿卜自交不親和性判定參照標(biāo)準(zhǔn)：親和指數(shù)小于0.5為強自交不親和，0.5～2.0為弱自交不親和，大于2.0為自交親和[16]。

1.2.3 花粉萌發(fā)試驗 取各處理及對照自交授粉后4.0 h及48.0 h花柱，固定于FAA固定液(50% 乙醇∶冰乙酸∶甲醛=18∶1∶1，體積比)中，4.0 h后倒掉固定液，用ddH2O清洗干凈并轉(zhuǎn)入10 mol/L NaOH中，42 ℃軟化0.5 h,用去離子水沖洗3次左右，加入適量0.1%苯胺藍(lán)染液(苯胺藍(lán)溶于1%的K3PO3)染色0.5 h以上[17-18]。樣品置于熒光顯微鏡奧林巴斯 BX53?DAPI通道，觀察花粉萌發(fā)狀態(tài)。每個處理至少取5個柱頭。

1.2.4 柱頭ROS測定 取各處理花柱浸入MES-KCl(各試劑終濃度為:10 mmol/L MES，5 μmol/L KCl，5 μmol/L CaCl2，pH=6.5)緩沖液中，抽真空10 min后，移至新鮮MES-KCl緩沖液中。用50 μmol/L的2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA,購自索萊寶科技有限公司)熒光染料黑暗染色1 h[19]。樣品于奧林巴斯BX53?熒光顯微鏡GFP通道下觀察ROS強度，曝光時間為800～900 ms[17]，每個處理至少取5個柱頭。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計整理采用Image J及Excel軟件，差異顯著性分析采用IBM SPSS Statistics Base V20.0軟件和GraphPad Prism軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)試劑類型對蘿卜自交結(jié)實性的影響

與對照相比，本試驗所選用的4種化學(xué)試劑均能在一定程度上克服蘿卜自交不親和性，可有效提高結(jié)莢率和親和指數(shù)(表3)。其中100 mg/L KT處理后親和指數(shù)可達2.45，接近于BP處理(2.85)，與王琴[20]的試驗結(jié)果一致；QUE試劑不同濃度處理平均親和指數(shù)可達2.10，親和性顯著提高；BR和MT處理后親和指數(shù)分別是1.26和1.73，也提高了自交親和性。結(jié)莢率的平均效應(yīng)與親和指數(shù)趨勢基本一致，各試劑處理后，結(jié)莢率高于FP處理和CK(表3)。

表3 化學(xué)試劑對蘿卜自交親和指數(shù)和結(jié)莢率的平均效應(yīng)

所選用的化學(xué)試劑雖然均能不同程度地提高蘿卜自交親和性，但也受品種基因型的影響。在NAU-YXYB和 NAU-LV791中，KT克服蘿卜自交不親和性的效果最顯著，親和指數(shù)分別提高至2.90與2.58；其次為QUE、MT；BR效果不明顯。而對自交系NAU-WXQ，QUE處理效果較好(圖1)。

FP、BP、CK、QUE、BR、MT、KT見表3注。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同化學(xué)試劑處理下蘿卜自交親和指數(shù)(A)和結(jié)莢率(B)Fig.1 Self-compatibility index(A)and podding rate(B)of radish under different chemical reagents treatments

2.2 化學(xué)試劑濃度對蘿卜結(jié)實性的影響

適宜的試劑濃度對提高蘿卜的親和性至關(guān)重要。本研究選用的3個濃度的QUE處理均能在一定程度上提高蘿卜親和性，其中1.5 mmol/L QUE效果最顯著，3個自交系處理后其親和性均大幅提高；不同濃度的MT效果差異較大，100 μmol/L為最優(yōu)處理濃度，可大幅提高不親和自交系的結(jié)莢率和親和指數(shù)，過高或過低的濃度效果不理想。100 mg/L KT在各基因型蘿卜中克服自交不親和性的效果顯著，普適性較好。BR在不同基因型中效果差異較大，廣譜性也未得到證明(表4、圖2)。

表4 不同濃度化學(xué)試劑對蘿卜自交親和性的影響

圖2 強自交不親和系NAU-YXYB自花授粉4.0 h(A)及48.0 h(B)后花粉管生長情況Fig.2 Pollen tube growth of the strongly self-incompatible line NAU-YXYB after self-pollination for 4.0 h(A)and 48.0 h(B)

綜上所述，克服蘿卜自交障礙的最優(yōu)化學(xué)試劑為1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT，這些化學(xué)試劑處理均能有效克服蘿卜自交障礙，提高蘿卜自交親和性。

2.3 化學(xué)試劑對蘿卜自花授粉后花粉管生長的影響

采用苯胺藍(lán)染色法進一步探究化學(xué)試劑對蘿卜自花授粉后花粉管生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自花授粉后，強不親和系NAU-YXYB柱頭上幾乎無萌發(fā)的花粉粒；而蕾期授粉4.0 h后，柱頭上可清楚看到大量花粉粒萌發(fā)，并隨時間的延長花粉管成束穿過柱頭乳突細(xì)胞進入花柱組織。說明供試材料花期自交不親和性明顯。

分別用1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理新鮮花朵后，柱頭上粘附的花粉粒與未處理相比增多，苯胺藍(lán)染色結(jié)果(圖3)顯示，花粉能正常在柱頭上萌發(fā)，授粉48.0 h后能在柱頭下部觀察到延伸的花粉管。以上試劑均能打破柱頭屏障，使花粉粒正常水合、萌發(fā)，且花粉管伸長進入子房，完成受精作用。

2.4 不同化學(xué)試劑處理對蘿卜花期柱頭ROS強度的影響

有研究結(jié)果表明，孢子體自交不親和植物的自交不親和性與柱頭活性氧強度呈正相關(guān)。Lan等[21]對不同發(fā)育階段柱頭的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，成熟期柱頭中參與ROS代謝的多個蛋白質(zhì)表達明顯上調(diào)，推測柱頭ROS強度是影響自交不親和的原因之一。利用熒光ROS檢測劑H2DCF-DA對對照蕾期、花期雌蕊及化學(xué)試劑處理后的花期雌蕊進行了染色并在熒光顯微鏡下成像記錄圖像，進行ROS差異分析。結(jié)果(圖3)表明，對照蕾期柱頭ROS強度遠(yuǎn)低于花期柱頭，約為花期柱頭的36%，而1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理后的花期柱頭ROS強度均有所下降，與對照花期柱頭相比，下降幅度均在40%～50%。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3 不同化學(xué)試劑處理后H2DCFDA ROS探針染色柱頭照片(A)與熒光強度(B)Fig.3 Images of stigma stained with H2DCFDA ROS probe (A) and fluorescence intensity (B) after treatment with different chemical reagents

3 討 論

在雜交育種實踐中，利用自交不親和系配制雜交種是蘿卜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑[22]。但是由于蘿卜本身自交親和性差，結(jié)籽率低，雜交親本繁殖與保存工作存在一定困難。因此，如何克服蘿卜的自交障礙，實現(xiàn)自交不親和系的高效繁殖成為蘿卜F1代雜交種生產(chǎn)實踐中亟待解決的關(guān)鍵問題。為了克服自交障礙，育種工作者已嘗試?yán)倨谑诜?、高溫處理后授粉[6]、電助授粉[23]等多種物理及生物學(xué)方法，但均由于操作復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等缺點的限制，難以廣泛應(yīng)用?；ㄆ趪娛}硼溶液、植物激素等方法在甘藍(lán)、白菜等蕓薹屬植物中取得了很好的效果，這些方法操作簡單、效率高、成本低，適合應(yīng)用于大面積田間制種。

本研究對克服蘿卜自交不親和性的最優(yōu)化學(xué)方法進行了篩選。通過比較不同化學(xué)試劑(QUE、BR、MT、KT)克服蘿卜自交不親和性的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT 3種試劑處理能夠大幅提高蘿卜的自交親和性，處理后親和指數(shù)均達到2.0以上，可有效替代剝蕾授粉法在雜交親本繁殖中的應(yīng)用。

孢子體自交不親和細(xì)胞學(xué)反應(yīng)涉及花粉與柱頭的相互作用，通過阻止花粉粒的水合與活化或限制花粉管發(fā)育而發(fā)生；反應(yīng)的信號傳導(dǎo)主要通過同一S單倍型的SRK與SCR/SP11相互識別，并激活下游信號傳導(dǎo)通路而發(fā)生[24-26]。QUE在克服孢子體自交不親和性上已有一定研究。作為一種蛋白激酶抑制劑，QUE可以抑制甘藍(lán)柱頭中SRK活性，克服甘藍(lán)自交不親和性[27-30]。本研究對QUE克服蘿卜自交不親和性能力及處理濃度進行探究，發(fā)現(xiàn)濃度1.0～2.0 mmol/L的QUE均能提高蘿卜的自交親和性。MT作為新型激素能增加受旱棉花雌蕊中物質(zhì)和能量的供應(yīng)，促進花粉管伸長和胚珠受精[31]。本研究首次應(yīng)用MT克服蘿卜自交不親和性，適宜濃度的MT克服蘿卜自交不親和性的效果十分明顯。100 mg/L KT對蘿卜自交不親和性的克服具有顯著效果，這與松原幸子等[32]的研究結(jié)果一致。

近年來，對SI機制的研究聚焦于柱頭ROS積累抑制自身花粉萌發(fā)上，Lan等[21]利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法研究發(fā)現(xiàn)，ROS代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)在羽衣甘藍(lán)柱頭發(fā)育成熟期明顯富集；Zhang等[15]的研究結(jié)果表明，柱頭活性氧強度與大白菜自交不親和性呈正相關(guān)作用，作用分子機制為活性氧合成酶受到上游調(diào)控因子Rac/ROP小G蛋白及細(xì)胞表面受體激酶FERONIA的調(diào)控，抑制該信號通路則阻止自花授粉引起的柱頭活性氧強度升高，使柱頭不再抑制自花花粉的萌發(fā)。本研究利用熒光ROS檢測劑H2DCF-DA對未使用化學(xué)試劑處理(對照)蕾期、花期及使用化學(xué)試劑處理后的花期雌蕊進行ROS差異分析，發(fā)現(xiàn)與未使用化學(xué)試劑處理的花期柱頭相比，1.5 mmol/L QUE、100 μmol/L MT和100 mg/L KT處理后的花期柱頭ROS強度均有所下降，下降幅度為40%～50%，這與在白菜及羽衣甘藍(lán)中的研究結(jié)果一致；同時與花期自交授粉相比，試劑處理后柱頭胼胝質(zhì)的產(chǎn)生明顯被抑制，萌發(fā)的花粉數(shù)及伸長的花粉管顯著增加。推測可能是所選化學(xué)試劑處理通過降低花期柱頭ROS強度，打破了柱頭對自花花粉的屏障作用，從而提高了親和性，其具體分子機制有待進一步研究。