崔方超，韓瑜娟，李婷婷，趙貴琴，勵(lì)建榮*，林 洪，勞敏軍，于建洋，郭曉華，王 轟

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600 3 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100 4 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316022 5 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300 6 山東美佳食品股份有限公司 山東日照 276800 7 蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái) 264000）

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的飛速發(fā)展，國民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其中以高能量、高嘌呤類食物攝入顯著增加為特征。在人體內(nèi)的代謝途徑中，嘌呤類物質(zhì)在黃嘌呤氧化酶 （Xanthine oxidase，XOD）的催化作用下最終轉(zhuǎn)化為尿酸。XOD 活性過高或患有代謝系統(tǒng)疾病會(huì)使尿酸大量累積，進(jìn)而引發(fā)運(yùn)動(dòng)功能受損、高尿酸血癥和痛風(fēng)，長(zhǎng)期高尿酸血癥還可誘發(fā)高血壓、糖尿病、冠心病、腎衰竭等疾病[1]。隨著高尿酸血癥和痛風(fēng)病發(fā)率呈逐年增加且年輕化的趨勢(shì)，高尿酸血癥成為繼“三高”之后的第4 個(gè)危險(xiǎn)因素[2]。

目前，對(duì)痛風(fēng)的治療主要從兩方面入手：一方面是抑制尿酸的生成，另一方面是促進(jìn)尿酸的排泄。抑制尿酸生成是通過抑制腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA） 和XOD 的活性達(dá)成，它們是催化并調(diào)控尿酸生成的關(guān)鍵酶。促進(jìn)尿酸排泄是通過調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來完成，抑制其在腎臟的重吸收，減少尿酸在血液中的積累，降低血清尿酸水平[3]。其中對(duì)XOD 的抑制研究較多，在臨床治療中，別嘌呤醇、非布司他等已被廣泛用于痛風(fēng)、高尿酸血癥等的治療，然而這些藥物具有較大的副作用，如引起患者肝功能損害，出現(xiàn)頭痛、胃腸道疾病以及腹瀉等不良癥狀[4]。關(guān)于植物活性物質(zhì)抑制XOD、降低尿酸含量的研究主要集中在多酚、黃酮和皂苷類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)如葛根素[5]、山奈酚（木犀草素）[6]、芥子酸[7]、阿魏酸[7]、丁香酸[7]、綠原酸[8]、咖啡酸[9]等都具有明顯XOD 抑制性。黃酮類物質(zhì)如槲皮素[10]、黃芩苷[11]也具有相同功效。皂苷類物質(zhì)如穿山甲總皂苷[12]，是從藥材穿山甲中提取的可抑制XOD 的活性成分。

由于活性肽具有分子質(zhì)量小，容易被人體吸收等優(yōu)點(diǎn)，近些年作為抑制劑成為新的研究熱點(diǎn)。Li 等[13]以核桃蛋白衍生肽為研究對(duì)象，對(duì)其體外XOD 抑制活性及其機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明：含色氨酸（Trp） 的核桃蛋白源肽能有效抑制XOD，Trp 數(shù)量的增加可顯著提高肽的XOD 抑制活性，且含Trp 的肽具有很好的抗氧化活性。He 等[14]從金槍魚蛋白水解物中分離出13 種二肽和三肽，采用高效液相色譜法驗(yàn)證了它們的XOD 抑制活性，結(jié)果表明：含苯丙氨酸（Phe）的肽比含Trp 的肽具有更高的XOD 抑制活性，其中Phe-His 的XOD抑制活性最高。趙謀明等[15]通過酶解金槍魚制備XOD 抑制肽，得到XOD 抑制率為30.96%的金槍魚酶解物。鄒琳[16]從鰹魚酶解物中分離得到具有XOD 抑制作用的五肽，人工合成此五肽證實(shí)其具有較強(qiáng)的XOD 抑制活性，分子對(duì)接結(jié)果顯示其能夠進(jìn)入XOD 中含Mo 原子的活性中心，并通過氫鍵、疏水相互作用及范德華力等與活性中心周圍的氨基酸殘基產(chǎn)生相互作用，與黃嘌呤之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

益生菌不僅能夠促進(jìn)人體健康，而且能改善食品屬性，被越來越多地應(yīng)用于食品工業(yè)。陳沈梁等[17]從泡菜中分離得到56 株乳酸菌，研究其對(duì)嘌呤核苷的降解能力，最終篩選到1 株具有高效降解嘌呤核苷的乳酸菌，進(jìn)一步的試驗(yàn)證明此菌株為短乳桿菌，具有耐膽鹽、耐酸以及耐受飽腹人工胃腸液的能力，這為進(jìn)一步研發(fā)功能性乳酸菌食品提供了理論依據(jù)。鄧英等[18]用短乳桿菌DM9218干預(yù)高果糖飲食誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠，結(jié)果表明：短乳桿菌DM9218 一方面可以通過改善腸屏障功能，降低內(nèi)毒素水平，從而緩解XOD 的表達(dá)及活性，另一方面由“肝-腸循環(huán)”直接降解肌苷，從而影響血清尿酸水平。牛春華等[19]從5 株植物乳桿菌中篩選出1 株UA149，具有較強(qiáng)的嘌呤核苷降解能力，能夠顯著降低高尿酸血癥模型大鼠血尿酸水平，降低血清XOD 活性，同時(shí)降低白三烯、血栓素和炎癥因子水平，可應(yīng)用于高尿酸血癥的預(yù)防和輔助治療。

目前研究較多的是益生菌自身對(duì)高尿酸血癥的影響，而對(duì)益生菌代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少。本文將研究乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)XOD 的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌 NRRLB-14768、IMAU 4005、NCL 13、SC 3-2-1、DLL-500 均為實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定的乳酸菌菌株。

MRS 肉湯、黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純級(jí)），上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸（色譜純級(jí)）、十二烷二酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四丁基氫氧化銨離子對(duì)試劑（色譜純級(jí)），上海邁瑞爾公司；二氫咖啡酸，北京天威泰達(dá)科技有限公司；4-十二烷基苯磺酸，上海賢鼎生物科技有限公司；16-羥基棕櫚酸，北京格瑞通達(dá)科技有限公司；其它試劑（均為分析純級(jí)）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-D 臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Multifuge X1R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾（中國）有限公司；LC-2030高效液相色譜儀島津，日本島津公司；MS105DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；imark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD；分子模擬軟件Discovery Studio （DS）2017 R2 Client，美 國Accelrys 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 取-80 ℃冰箱保存的菌種，以2%接種量接種于10 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h 左右。以2%接種量依次傳代，取第2代培養(yǎng)液1 mL 于50 mL 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 乳酸菌代謝產(chǎn)物的獲得 取第3 代培養(yǎng)液30 mL 于離心管中，4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器（0.22 μm）過濾，所得無菌濾液即為乳酸菌的代謝產(chǎn)物[20]，將無菌濾液在95℃高溫條件下滅酶10 min 備用。

1.3.3 乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制XOD 效果驗(yàn)證 參考宋敏杰[21]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取0.0100 g黃嘌呤標(biāo)品用超純水溶解，并用1 mol/L 的NaOH助溶，用50 mL 的容量瓶定容，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。隨后所需溶液均用超純水進(jìn)行稀釋，所有待測(cè)樣品過0.22 μm 濾膜，在特定的色譜條件下進(jìn)行嘌呤含量的測(cè)定，從而確定代謝產(chǎn)物對(duì)XOD 抑制效果。

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C18 Plus（4.6 mm×250 mm × 5 μm）；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。將超純水、冰乙酸、四丁基氫氧化銨按體積比997∶1.5∶1.5 混合作為流動(dòng)相C，再與甲醇（流動(dòng)相B）按95∶5 混合作為最終流動(dòng)相。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：空白組為黃嘌呤（880 μL）+磷酸鹽緩沖液（120 μL）；對(duì)照組為黃嘌呤（880 μL）+磷酸鹽緩沖液（40 μL）+XOD（80 μL）；試驗(yàn)組：黃嘌呤（880 μL）+無菌濾液（40 μL）+XOD（80 μL）。試驗(yàn)所用黃嘌呤質(zhì)量濃度均為50 μg/mL，XOD 為0.1 U/mL，XOD 作用時(shí)間為30 min，反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)結(jié)束后，需將反應(yīng)管放在95 ℃水浴滅酶10 min，滅酶后用高效液相色譜法檢測(cè)體系中黃嘌呤的含量。為排除空白培養(yǎng)基的影響，將無菌濾液換成等量的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.4 乳酸菌代謝物成分的搜集 通過對(duì)在線數(shù)據(jù)庫PubChem（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）以及已經(jīng)出版的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，對(duì)無菌濾液中的化學(xué)成分進(jìn)行收集、整理。對(duì)搜集的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，包括2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)，加氫、能量最小化以及添加HRRMM 力場(chǎng)，建立無菌濾液所含成分3D 結(jié)構(gòu)的化合物庫。

1.3.5 抑制劑特性研究

1.3.5.1 pH 值排除試驗(yàn) 由于乳酸菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸等酸類物質(zhì)，從而使上清液的pH 降低，為排除pH 值對(duì)XOD 活性的影響，對(duì)上清液的pH 值進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5.2 有機(jī)酸排除試驗(yàn) 為確定有機(jī)酸是否為抑制XOD 的活性物質(zhì)，將乳酸菌上清液使用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 為7，采用高效液相色譜法測(cè)定中和后的乳酸菌上清液對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用[22]。

1.3.6 分子對(duì)接 分子對(duì)接可以通過研究分子間相互作用從而預(yù)測(cè)分子間的結(jié)合方式，因而被廣泛地應(yīng)用于分析小分子配體與蛋白相互作用的結(jié)合機(jī)制以及進(jìn)行抑制劑的篩選。參考Li 等[23]的方法，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）選擇XOD 的3D 結(jié)構(gòu)（PDB ID：3NVY），去水加氫，修復(fù)不完整殘基，刪除配體，準(zhǔn)備分子對(duì)接。

XOD 的X 射線晶體結(jié)構(gòu)表明，它有兩個(gè)對(duì)稱相關(guān)的結(jié)構(gòu)域單體，是以同型二聚體形式表示的氧化還原酶，每個(gè)單體都包含一個(gè)C-末端的鉬（Mo）結(jié)構(gòu)域，包括4 個(gè)氧化還原中心、1 個(gè)中心黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子和1 個(gè)具有兩個(gè)鐵硫中心的N-端結(jié)構(gòu)域。XOD 含有兩個(gè)分離的底物結(jié)合位點(diǎn)，Mo 中心和FAD 中心。黃嘌呤的氧化發(fā)生在Mo 中心，底物氧的還原發(fā)生在FAD 中心，轉(zhuǎn)移電子產(chǎn)生超氧陰離子（O2-）或過氧化氫（H2O2）自由基[11]。

3NVY 是牛乳中的XOD 與槲皮素相結(jié)合的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)，張岑等[24]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過占據(jù)底物黃嘌呤進(jìn)入XOD 活性中心的通道，抑制了XOD 對(duì)黃嘌呤的催化，從而減少了尿酸的生成。在本次分子對(duì)接過程中選擇槲皮素所在位置作為結(jié)合位點(diǎn)，即活性位點(diǎn)AC5。該結(jié)合位點(diǎn)共有18個(gè)氨基酸殘基結(jié)合位點(diǎn)：Phe1150、Ser1008、Ala1079、Arg880、Thr1010、Phe1009、Phe914、Ser876、Leu1014、Leu873、Leu648、Val1011、Phe649、Phe1013、Lys771、Pro1076、Glu802、Ala1078 在該結(jié)合位點(diǎn)處能與這些氨基酸殘基結(jié)合，則有抑制XOD 的可能性。

圖1 XOD 與槲皮素結(jié)合活性位點(diǎn)2D 示意圖Fig.1 2D schematic diagram of XOD binding active site with quercetin

將得到的XOD 晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子模擬軟件DS 中，并對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接前的去水、加氫等一系列準(zhǔn)備操作。從NCBI 數(shù)據(jù)庫中收集酸類代謝產(chǎn)物的3D 結(jié)構(gòu)，并將3D 結(jié)構(gòu)作為配體，進(jìn)行能量最小化，并建立分子庫。

以3NVY 作為受體蛋白，以乳酸菌代謝物為配體，以原配體結(jié)合作用位點(diǎn)（X：36.3141，Y：11.793，Z：17.8448） 為對(duì)接中心，以15 為對(duì)接半徑，采用配體對(duì)接工具欄的半柔性對(duì)接，并且設(shè)置參數(shù)為剛性優(yōu)化、快速篩選，其余設(shè)置為默認(rèn)值進(jìn)行分子對(duì)接。按打分將篩選出的乳酸菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行下一步操作。

1.3.7 黃嘌呤氧化酶抑制效果驗(yàn)證 對(duì)比已經(jīng)研究出的具有XOD 抑制活性的物質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子對(duì)接的打分，選出打分較高的物質(zhì)通過高效液相色譜法進(jìn)行活性驗(yàn)證，以黃嘌呤轉(zhuǎn)化量反映酶活性變化，通過梯度濃度反應(yīng)探索抑制率與抑制劑之間的關(guān)系。用880 μL 黃嘌呤（50 μg/mL）與80 μL XOD（0.1 U/mL）反應(yīng)作為對(duì)照，在反應(yīng)體系中分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品40 μL，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品后對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系中黃嘌呤轉(zhuǎn)化量的影響確定其抑制作用。整個(gè)反應(yīng)體系在35 ℃下反應(yīng)30 min，隨后在95 ℃條件下水浴10 min 進(jìn)行滅酶。用1.3.3 節(jié)的色譜條件進(jìn)行等度洗脫檢測(cè)。抑制率計(jì)算公式為：

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 使用Excel 2010 及OriginPro 8.5 對(duì)試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌代謝物對(duì)XOD 抑制效果驗(yàn)證

由圖2可知，在設(shè)定的液相條件下，黃嘌呤的出峰時(shí)間為6.596 min，其峰面積為3 294 685；在相同條件下加入80 μL XOD 后黃嘌呤的峰面積明顯減?。ǚ迕娣e為1 821 383），說明在該反應(yīng)條件下XOD 具有良好的酶活，能夠催化黃嘌呤。在相同反應(yīng)體系中分別加入40 μL NRRLB-14769、IMAU 4008、DLL-500、NCL 13、SC 3-2-1 5 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物后黃嘌呤的峰面積分別為3 222 677，3 099 157，3 096 238，2 415 234，2 161 694，可以看出5 株乳酸菌的代謝產(chǎn)物均對(duì)XOD 具有明顯的抑制作用，且抑制效果大小為NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1，其中菌株NRRLB-14769、IMAU 4008和DLL-500 的代謝產(chǎn)物對(duì)XOD 的抑制效果較強(qiáng)。由此可以得出不同乳酸菌代謝物對(duì)XOD 抑制性有顯著差異，可能是不同的乳酸菌所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)及其含量不同影響對(duì)XOD 的抑制率。

圖2 不同乳酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)XOD 的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different metabolites of lactic acid bacteria on XOD

從圖3中可以看出，與不加XOD 組相比，加入XOD 組黃嘌呤的含量顯著減少。加入空白培養(yǎng)基的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，黃嘌呤的含量沒有明顯變化，說明空白培養(yǎng)基不含有抑制XOD 的活性成分，從而說明是乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制了XOD活性。

圖3 培養(yǎng)基對(duì)XOD 的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of culture medium on XOD

2.2 乳酸菌中代謝產(chǎn)物成分收集

通過文獻(xiàn)收集、整理、分析，共得到乳酸菌的代謝產(chǎn)物76 種（見表1）。目前，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在食品行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，如發(fā)酵乳制品、肉制品、泡菜、酒類飲料等，是生產(chǎn)中非常重要的發(fā)酵劑和風(fēng)味物質(zhì)。乳酸菌發(fā)酵代謝的最終產(chǎn)物包括多種酸類物質(zhì)（乳酸、乙酸、甲酸）和乙醇等[25]，具體成分因菌種不同有較大差異，本文主要研究乳酸菌的胞外代謝物。從表1中可以看出，乳酸菌代謝物除有機(jī)酸外，還含有一些氨基酸、嘌呤和嘧啶類物質(zhì)為乳酸菌生長(zhǎng)所需要的物質(zhì)，另外甜菜堿、對(duì)香豆酸、別嘌呤醇是經(jīng)研究證明具有XOD抑制活性。

表1 乳酸菌代謝產(chǎn)物Table 1 Lactobacillus metabolites

2.3 抑制劑特性研究

乳酸菌代謝會(huì)產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，使上清液呈現(xiàn)酸性環(huán)境，為排除pH 值對(duì)XOD 活性的影響，對(duì)上清液的pH 值進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示上清液的pH 值為4.20～4.9，有文獻(xiàn)[30]表明，在此pH 值條件下，XOD 的活性不受影響，說明導(dǎo)致XOD 活性降低的物質(zhì)來源于乳酸菌代謝產(chǎn)物。使用氫氧化鈉溶液將上清液的pH 值調(diào)至中性，研究上清液對(duì)XOD 的抑制作用。從圖4可以看出中和后的上清液對(duì)XOD 沒有抑制作用，而沒有中和的上清液對(duì)XOD 具有明顯的抑制作用，判斷對(duì)XOD 產(chǎn)生抑制作用的是有機(jī)酸類物質(zhì)。

圖4 pH 值對(duì)XOD 活性的影響Fig.4 Effect of pH value on XOD activity

2.4 有機(jī)酸類物質(zhì)XOD 分子對(duì)接結(jié)果

已經(jīng)判斷出上清液中的有機(jī)酸類物質(zhì)抑制了XOD 活性，將表1中的有機(jī)酸與XOD 進(jìn)行分子對(duì)接，并且選擇打分較高的幾個(gè)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。從表中可以看出3，4-二羥基苯基丙酸（Dihydrogen caffeic acid，DHCA）、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸（Dodecanedioic acid，DDA）、4-十二烷基苯磺酸這4 種物質(zhì)與XOD 分子對(duì)接打分較高，處于前列。

化合物需要與XOD 結(jié)合后，才能產(chǎn)生正向或反向的作用，基于此分析DHCA、16-羥基十六烷酸、DDA、4-十二烷基苯磺酸等化合物在分子對(duì)接過程中與XOD 的結(jié)合形式。圖5為4 種化合物與XOD 結(jié)合后的2D 可視化分析圖。

圖5a 為DHCA 和XOD 的相互作用模式圖，其中DHCA 與XOD 的氨基酸殘基Ser876、Val1011、Ala1079 以及XOD 中心Mos1328 之間形成氫鍵相互作用，并與Val1011 之間形成疏水相互作用。圖5b 為4-十二烷基苯磺酸與XOD 相互作用模式圖，其中4-十二烷基苯磺酸與XOD 的氨基酸殘基Lys771 之間形成氫鍵相互作用，與Leu1014、Ser876 之間形成疏水相互作用。圖5c 為16-羥基十六烷酸與XOD 的相互作用模式圖，其中16-羥基十六烷酸與XOD 的氨基酸殘基Arg880 之間形成氫鍵相互作用。圖5d 為DDA 與XOD 的相互作用模式圖，其中DDA 與XOD 的氨基酸殘基Asn768、Ala179 以 及 XOD 中 心Mos1328 之間形成氫鍵相互作用。以上小分子與黃嘌呤氧化酶之間形成的化學(xué)鍵有助于小分子發(fā)揮作用，從而對(duì)酶產(chǎn)生一定的促進(jìn)或抑制作用。

表2 分子對(duì)接結(jié)果Table 2 The results of molecular docking

圖5 二氫咖啡酸-XOD（a）、4-十二烷基苯磺酸-XOD（b）、16-羥基十六烷酸-XOD（c）和十二烷二酸-XOD（d）Mo中心結(jié)合位點(diǎn)2D 模式圖Fig.5 2D pattern diagram of Mo binding sites of DHCA-XOD （a），4-dodecyl benzene sulfonic acid-XOD （b），16-hydroxyhexadecanoic acid-XOD （c） and DDA-XOD （d）

2.5 黃嘌呤氧化酶抑制效果的驗(yàn)證

從圖6中可以看出，16-羥基十六烷酸和DHCA 對(duì)XOD 的抑制率都是呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中16-羥基十六烷酸在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大抑制率（90%），DHCA 在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 左右時(shí)達(dá)到最大抑制率 （約為67%）。16-羥基十六烷酸又稱16-羥基棕櫚酸，在此處表現(xiàn)出很強(qiáng)的XOD 抑制能力，這可能與棕櫚酸具有抗氧化性[31]相關(guān)，16-羥基十六烷酸作為棕櫚酸的衍生物可能也具有抗氧化活性。DHCA 表現(xiàn)出良好的XOD 抑制作用，同樣與其很強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān)。據(jù)報(bào)道，酚類化合物具有減少自由基形成的特性，其中咖啡酸對(duì)氧自由基的生成具有良好的抑制作用，具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，并且咖啡酸能在一定程度上抑制XOD 活性[9，32]。從圖6中可以看出十二烷二酸和4-十二烷基苯磺酸對(duì)XOD 的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著抑制劑質(zhì)量濃度的升高，抑制率也在增加，十二烷二酸的抑制率最終會(huì)趨于平緩，而4-十二烷基苯磺酸的抑制率緩慢上升。

圖6 16-羥基十六烷酸（a）、DHCA（b）、DDA（c）、4-十二烷基苯磺酸（d）的抑制曲線Fig.6 Inhibition curve of 16-hydroxyhexadecanoic acid （a），hydrocaffeic acid （b），dodecanedioic acid （c）and 4-dodecylbenzenesulfonic acid （d）

3 總結(jié)

本文選取實(shí)驗(yàn)室保藏的5 株乳酸菌，對(duì)菌株上清液XOD 抑制性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，5 株菌上清液對(duì)XOD 均具有良好的抑制效果并且抑制能力大小為：NRRLB-14769>IMAU 4008>DLL-500>NCL 13>SC 3-2-1。進(jìn)一步試驗(yàn)證明上清液中的有機(jī)酸類物質(zhì)抑制了XOD，利用Discovery Studio 2017 R2 Client 將有機(jī)酸類代謝產(chǎn)物與XOD 的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)分子對(duì)接的結(jié)果，選擇了DHCA、16-羥基十六烷酸、十二烷二酸、4-十二烷基苯磺酸4 種物質(zhì)對(duì)XOD 的抑制效果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明這4 種物質(zhì)都對(duì)XOD 具有不同程度的抑制作用，其中16-羥基十六烷酸表現(xiàn)出良好的XOD 抑制作用。

4 展望

乳酸菌能夠改善宿主腸道菌群平衡并有效增強(qiáng)食用者身體健康水平，具有改善便秘、緩解腹瀉、抗腫瘤、保護(hù)口腔健康等重要身體功能，而其代謝物數(shù)以百計(jì)，其中許多生物活性物質(zhì)能夠提高產(chǎn)品的功能特性，后續(xù)試驗(yàn)中將對(duì)乳酸菌代謝物進(jìn)行深入的研究，期望找到能夠用于食品中的黃嘌呤氧化酶抑制劑。