孫武，徐靜靜，尹忠偉，朱莉，詹曉北*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(A&F生物技術(shù)有限公司,加拿大 本拿比，V5A3P6)

中國傳統(tǒng)米酒是一種以糯米為原料，經(jīng)半固態(tài)發(fā)酵而成的商品酒精飲料，其營養(yǎng)豐富，歷史悠久，一般可以分為釀造米酒和蒸餾米酒[1-2]，其中蒸餾米酒是在釀造米酒的基礎(chǔ)上經(jīng)蒸餾工藝而得到的酒精含量較高的米白酒，如桂林三花米香型白酒等[3]。已有研究表明，米酒對(duì)人體健康有多種益處，包括抗氧化、提高免疫等。如鄧志輝[4]研究發(fā)現(xiàn)蔣巷米酒抗氧化性較好，還具有一定的抗疲勞能力。

近年來，關(guān)于米酒功能因子的研究多有報(bào)道。米酒發(fā)酵過程中，在酒曲中微生物以及各種酶的共同作用下，蛋白質(zhì)、多糖類和脂肪等物質(zhì)被降解成單糖、低聚糖和氨基酸等[5]。其中米酒中的多糖有兩個(gè)來源：在發(fā)酵過程中，糯米中的淀粉被微生物降解，轉(zhuǎn)化為低聚糖和多糖；除了原料外，也可由微生物產(chǎn)生，例如在酵母生長和裂解過程中，細(xì)胞壁中的β-葡聚糖被釋放到米酒中，其中β-葡聚糖具有降血糖和抗氧化作用[6]。CHO等[7]表明韓國傳統(tǒng)米酒中的多糖能增加正常小鼠免疫力，促進(jìn)免疫抑制模型小鼠的免疫細(xì)胞增殖。因此米酒中的多糖可能具有多種生物活性功能。其中部分多糖類化合物由于可以調(diào)節(jié)腸道酸堿度、腸道微生物組成和豐度以及促進(jìn)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等有益代謝物的形成[8-9]，有益于宿主的健康，越來越多的應(yīng)用于益生元的研究。

蒸餾米酒在蒸餾過程中會(huì)產(chǎn)生大量的蒸餾殘液，而蒸餾工藝中酒精會(huì)與多糖類物質(zhì)分離，導(dǎo)致大量多糖類物質(zhì)溶解在殘液中。不僅會(huì)提高生產(chǎn)成本，同時(shí)也會(huì)對(duì)環(huán)境造成大量污染。因此本文旨在研究蒸餾米酒的蒸餾殘液中功能糖的提取及其益生功能，既可以獲得酒精度較高的蒸餾米酒，又可以將蒸餾殘液再利用，極大地降低了蒸餾米酒的生產(chǎn)成本和對(duì)環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糯米，五常市興旺米業(yè)有限公司；米酒曲，安琪酵母股份有限公司；3 500 Da透析袋，無錫恒康醫(yī)療科技有限公司；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)菌種：短雙歧桿菌(FWX346)、動(dòng)物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)、鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)、干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)，均從健康人群糞便中分離，保藏單位為江南大學(xué)(中國無錫)食品微生物菌種保藏中心，保藏地址為江蘇省無錫市蠡湖大道1800號(hào)。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，乙酸鈉2，檸檬酸氫二氨2，硫酸鎂0.58，硫酸錳0.25，碳源5，L-半胱氨酸0.5。

1.2 儀器與設(shè)備

K15型冷凍高速離心機(jī)，美國Sigma公司；LC-1200型高效液相色譜、7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；ICS5000離子色譜儀，美國戴安公司；MuLtimode 8原子力顯微鏡，德國布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蒸餾殘液中多糖的分離純化

取500 mL蒸餾米酒的蒸餾殘液，50 ℃減壓濃縮至原體積的1/3，添加95%乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為30%，4 ℃醇沉12 h，取上清液(6 000 r/min，離心15 min)添加95%乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌充分后，4 ℃繼續(xù)醇沉12 h，收集沉淀(6 000 r/min，離心15 min)，添加30%乙醇復(fù)溶后，4 ℃靜置12 h，收集上清液(6 000 r/min，離心15 min)，減壓濃縮、冷凍干燥得到粗多糖，取一定量的粗多糖溶解后，采用Sevag試劑[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]除蛋白，添加樣液1/5的Sevag試劑，放入搖床充分振蕩后取上清液，重復(fù)操作直至中間無蛋白層出現(xiàn)，收集上清液減壓濃縮除去樣品中的有機(jī)試劑，使用截留分子質(zhì)量3 500 Da的透析袋在超純水中透析72 h后，減壓濃縮凍干得到多糖樣品并命名為CRWPs。

1.3.2 蒸餾殘液中多糖的總糖和蛋白質(zhì)的測(cè)量

總糖含量利用硫酸苯酚法測(cè)定，蛋白質(zhì)的測(cè)定利用紫外全光譜掃描。

1.3.3 蒸餾殘液中多糖的單糖組成的測(cè)定

采用ICS-5000離子色譜儀測(cè)定多糖的單糖組成，具體方法參照劉衛(wèi)寶等[10]的研究報(bào)道，并略作修改。取5 mg 多糖樣品加入300 μL三氟乙酸(2 mol/L)溶液，混勻后于100 ℃下水解6 h；冷卻至室溫后用氮?dú)獯蹈?，接著加?00 μL甲醇再次吹干，重復(fù)以上操作4～5次，以完全除去三氟乙酸。再加入25 mL超純水溶解，稀釋10倍后上樣測(cè)定。色譜條件如下：CarboPac PA20陰離子交換柱，包括250 mm×4 mm分析柱、50 mm×4 mm保護(hù)柱；色譜柱溫度為30 ℃；流動(dòng)相由A(超純水)、B(0.25 mol/L NaOH)和C(1 mol/L NaAc)組成，其中流動(dòng)相B的比例分別為體積分?jǐn)?shù)2.6%(0～30.0 min)、2.6%～80.0%(30.0～50.0 min)；其中流動(dòng)相C的比例分別為體積分?jǐn)?shù)5.0%～80.0%(21.1～30.0 min)；流量為0.5 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL。

1.3.4 蒸餾殘液中多糖的分子質(zhì)量的測(cè)定

利用高效凝膠過濾色譜法(high performance gel filtration chromatography，HPGFC)[11]，以Superose 12(1.0 cm×30 cm)為色譜柱，進(jìn)一步分析多糖的平均分子質(zhì)量。由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=-0.098 76x+6.782 9,R2=0.995)，將多糖溶于超純水(5 mg/mL)，過0.22 μm濾膜，色譜條件如下：流動(dòng)相：0.01 mol/L NaOH；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.5 流變特性測(cè)定

稱取不同質(zhì)量的多糖樣品溶于超純水得到不同質(zhì)量濃度(5、10、20 mg/mL)的多糖溶液，待其充分溶解后，采用TA DHR-1型流變儀測(cè)量多糖溶液的流變特性。選取錐板C60夾具進(jìn)行測(cè)量，在25 ℃、剪切速率0.1～1 000 s-1條件下進(jìn)行掃描，并記錄相應(yīng)的表觀黏度。

1.3.6 原子力顯微鏡分析

將多糖用超純水配制成10 μg/mL的溶液，渦旋使其完全溶解。取5 μL滴至硅片上，室溫條件下，置于干燥皿中過夜干燥。待完全干燥后，采用MuLtimode 8型原子力顯微鏡進(jìn)行觀察，掃描條件為：空氣中非接觸模式，氮探針；曲率半徑10 nm；氮化硅懸臂，彈性系數(shù)2.80 N/m，掃描頻率1.001 Hz。

1.3.7 發(fā)酵益生菌研究

選擇短雙歧桿菌(FWX346)、動(dòng)物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)、鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)、干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)4株菌作為目標(biāo)菌種進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行益生活性評(píng)價(jià)，以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并稍作修改，添加0.5 g/LL-半胱氨酸。以無碳源的MRS作為空白對(duì)照，以菊粉(5 g/L)為碳源作為益生參照物，以蒸餾殘液中提取的多糖(5 g/L)為碳源作為實(shí)驗(yàn)組。首先制備益生菌種子液，取5 mL種子液加入30 mL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)中制成菌懸液，將菌懸液接種于厭氧管中，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，分別在0、24、48 h取樣，測(cè)定OD600值、pH、SCFAs和乳酸的變化。

1.3.8 SCFAs含量的測(cè)定

采用氣相色譜法對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行SCFAs含量分析[12]。發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液依次加入20 μL二乙基丁酸、500 μL鹽酸、2 mL乙醚渦旋3～5 min，靜置至液面分層，分離有機(jī)相，加入無水硫酸鈉渦旋30 s，靜置2 min取上清液過0.22 μm有機(jī)相膜，樣品(0.5 μL)注入Agilent 7890A GC系統(tǒng)，采用HP-INOWAX色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm,Agilent,USA)和火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)。色譜條件：流速為1.5 mL/min，分流比為1∶20，加熱過程為60～190 ℃，4 min，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，F(xiàn)ID溫度為250 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS軟件進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

從蒸餾米酒蒸餾殘液中分離得到的粗多糖得率為4.23 g/L，通過硫酸苯酚法(y= 9.741 4x-0.003 2,R2=0.999)測(cè)得雜多糖(CRWPs)中的總糖含量為(84.30±0.23)%，CRWPs的紫外全光譜掃描結(jié)果如圖1所示，在260 nm和280 nm處均無明顯吸收峰，結(jié)果表明CRWPs溶液不含有核酸和蛋白質(zhì)。

圖1 波長為190～400 nm的紫外全光譜掃描曲線Fig.1 Ultraviolet full spectrum scan in the wavelength range of 190-400 nm

2.2 多糖分子質(zhì)量測(cè)定

HPGFC在多糖分子質(zhì)量測(cè)定上應(yīng)用廣泛，具有高效、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，本研究通過HPGFC測(cè)定CRWPs的分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示，根據(jù)分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到CRWPs的重均分子質(zhì)量為8 554 Da，分子均一度為1.236，表明該多糖分子質(zhì)量分布較窄。

圖2 CRWPs的HPGFC色譜圖Fig.2 HPGPC chromatography of CRWPs

2.3 單糖組成分析

CRWPs的單糖組成結(jié)果如圖3所示，CRWPs主要由葡萄糖(91.56%)、半乳糖(2.13%)、甘露糖(1.61%)、葡萄糖醛酸(1.84%)、半乳糖醛酸(1.34%)、巖藻糖(0.67%)和少量阿拉伯糖(0.12%)組成。CHO等[7]從韓國傳統(tǒng)米酒中分離出的多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，其中甘露糖含量高達(dá)24.5%，不含糖醛酸。與韓國米酒多糖相比，CRWPs具有不同的單糖組成，這可能與原料、提取方法的不同有關(guān)。以上結(jié)果表明CRWPs是一種雜多糖。

a-單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-CRWPs的單糖組成圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和CRWPs的單糖組成Fig.3 Standard curve of the monosaccharide and the monosaccharide composition of CRWPs

2.4 流變學(xué)特性分析

多糖的流變學(xué)特性是其應(yīng)用到功能性食品的研究基礎(chǔ)，具有重要的研究意義，如圖4所示，當(dāng)剪切速率為0.1～10 s-1時(shí)，不同濃度的多糖溶液的表觀黏度逐漸降低，在10～100 s-1時(shí)趨于穩(wěn)定，且都表現(xiàn)出典型的剪切變稀行為[13]。然后經(jīng)牛頓冪律方程N(yùn)=Krn-1擬合后，得到相應(yīng)的稠度系數(shù)K值和流動(dòng)特性指數(shù)n值，結(jié)果見表1。CRWPs流動(dòng)特性指數(shù)n值均<1，且n值隨多糖溶液濃度的增加而減小，稠度系數(shù)K隨著多糖溶液濃度增加而上升，這表明CRWPs溶液具有假塑性流體的特征，且多糖溶液濃度越高，越能呈現(xiàn)更好的假塑性。

圖4 不同濃度的CRWPs溶液的表觀黏度隨剪切速率變化的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)曲線Fig.4 Steady shear flow curves of CRWPs solutions with different concentrations as a function of shear rate

表1 不同濃度CRWPs溶液下穩(wěn)態(tài)流變的冪率方程擬合參數(shù)Table 1 Power law equation fitting parameters of different concentrations of CRWPs static rheological curve

2.5 原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

原子力顯微鏡近幾年來廣泛應(yīng)用于研究多糖的表面形貌與結(jié)構(gòu)，圖5為10 μg/mL的CRWPs溶液在原子力顯微鏡下的平面圖和立體圖像。其中圓環(huán)的直徑為0～149.34 nm，推測(cè)該多糖具有多分支的結(jié)構(gòu)，在支鏈和直鏈的共同作用下，分子發(fā)生了聚集。多糖鏈的平均高度為0～23 nm，一般來說，多糖分子的單鏈高度為0.1～1.0 nm[14]，說明觀測(cè)到的不是多糖單鏈，可能是多條單鏈聯(lián)結(jié)在一起。該結(jié)果可能是樣品干燥時(shí)由于水分降低造成局部樣品凝聚結(jié)塊，由于多糖質(zhì)量濃度大，羥基數(shù)目多，使得分子間氫鍵締合作用增強(qiáng)。其中多糖鏈間聚合而形成點(diǎn)狀或棒狀結(jié)構(gòu)，從而能夠在AFM圖像上看到接近23 nm的多糖鏈聚集結(jié)構(gòu)，因此推測(cè)立體中細(xì)鏈條是由單條或多條糖鏈通過分子間的相互作用力形成的螺旋結(jié)構(gòu)[15]。

a、b-掃描范圍為400.0 nm×400.0 nm的平面圖、立體圖；c、d-掃描范圍為4.0 μm×4.0 μm的平面圖、立體圖圖5 CRWPs原子力顯微鏡圖Fig.5 AFM image of CRWPs

2.6 發(fā)酵益生菌結(jié)果分析

2.6.1 OD600值的變化

CRWPs對(duì)2株雙歧桿菌和2株乳桿菌增殖的影響如圖6所示，與空白組相比，CRWPs和菊粉均能顯著提高這4株菌的生物量(P<0.05)，說明CRWPs能被這4株細(xì)菌利用，進(jìn)而促進(jìn)這4株菌的生長。其中短雙歧桿菌的促生長效果最好，在48 h時(shí)OD600值達(dá)到了0.697±0.012，此外，CRWPs對(duì)短雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌的促生長效果比菊粉好，表明了CRWPs具有一定的益生活性。

a-短雙歧桿菌(FWX346)；b-動(dòng)物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)；c-鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)；d-干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)圖6 不同碳源發(fā)酵益生菌后OD600值的變化Fig.6 Changes in OD600 after prebiotics fermentation with different carbon sources注：數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；不同小寫字母表示不同碳源間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.6.2 pH變化、SCFAs和乳酸的產(chǎn)量變化

產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)益生元功能的一個(gè)重要指標(biāo)，培養(yǎng)基的pH下降程度可以反映發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸量[16]。由圖7可知，與空白組相比較，菊粉和CRWPs的pH都有所下降，而發(fā)酵48 h后，菊粉和CRWPs的pH都有明顯降低(P<0.05)，結(jié)果表明，這4株菌可以利用CRWPs產(chǎn)生有機(jī)酸，導(dǎo)致pH值下降。在益生元代謝過程中，SCFAs是主要的最終產(chǎn)物，它不僅反映了被評(píng)價(jià)的益生菌的增殖活性，還能反映細(xì)菌對(duì)碳源的利用程度。其中乙酸、丙酸、丁酸是主要的脂肪酸，也是評(píng)價(jià)益生效應(yīng)的重要指標(biāo)[17]。短雙歧桿菌的下降幅度最大(P<0.01)，由5.850±0.001降到4.780±0.025，且短雙歧桿菌的生物量增加幅度最大，這與圖8中，CRWPs和菊粉組發(fā)酵48 h后的乙酸的含量明顯高于空白組(P<0.05)的結(jié)果對(duì)應(yīng)，說明CRWPs能促進(jìn)乙酸的產(chǎn)生從而降低培養(yǎng)基的pH，因此表明在CRWPs為碳源的發(fā)酵過程中，短雙歧桿菌的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，其中干酪乳桿菌下降幅度較小，表明干酪乳桿菌產(chǎn)酸能力要弱于雙歧桿菌。

a-短雙歧桿菌(FWX346)；b-動(dòng)物雙歧桿菌(ZJTZ1M2)；c-鼠李糖乳桿菌(FFJLY7L1)；d-干酪乳桿菌(FJSSZ4L6)圖7 不同碳源發(fā)酵益生菌后pH的變化Fig.7 Changes in pH after prebiotics fermentation with different carbon sources

由圖8可知，發(fā)酵48 h后，CRWPs發(fā)酵中動(dòng)物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生的丙酸顯著高于其他組(P<0.05)。此外，CRWPs發(fā)酵中短雙歧桿菌產(chǎn)生的乙酸和丁酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)。乙酸可被腸壁吸收并通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官，為腦、肝及周圍組織提供能量[18]。丙酸能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗菌因子的產(chǎn)生[19]。由圖8-c可知，CRWPs為碳源的發(fā)酵過程中，鼠李糖乳桿菌有較好的產(chǎn)丁酸能力，丁酸鹽作為一種新型分子，具有廣泛的與腸道微生物和生理相關(guān)的生物學(xué)功能，有利于腸道上皮屏障的功能發(fā)揮[20-21]。由圖8-d可知，CRWPs和菊粉產(chǎn)乳酸量均高于空白組，說明CRWPs可以被這4種益生菌利用產(chǎn)生乳酸，同時(shí)乳酸在乳桿菌與病原菌的競(jìng)爭和排斥中扮演著重要作用[22]，其中短雙歧桿菌的產(chǎn)乳酸量最多，動(dòng)物雙歧桿菌產(chǎn)乳酸量最低。以上結(jié)果表明，CRWPs可以被這4株菌利用，引起細(xì)菌生物量的增加，同時(shí)顯著增加主要代謝產(chǎn)物如SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)和乳酸的產(chǎn)量，并降低培養(yǎng)基的pH。綜上所述，CRWPs可以作為益生元改善雙歧桿菌和乳桿菌的生長，可能具有良好的益生活性。

a-乙酸含量變化；b-丙酸含量變化；c-丁酸含量變化；d-乳酸含量變化圖8 不同碳源發(fā)酵益生菌后SCFAs和乳酸的變化Fig.8 Changes in SCFAs and lactic acid after prebiotics fermentation with different carbon sources

3 結(jié)論

本研究從蒸餾米酒的蒸餾殘液中分離純化出一種分子質(zhì)量為8 554 Da的多糖CRWPs，其主要是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸等組成。流變學(xué)分析表明CRWPs溶液具有假塑性流體的特征，通過原子力顯微鏡觀察推測(cè)該多糖具有多分支的結(jié)構(gòu)。發(fā)酵益生菌結(jié)果表明CRWPs能夠促進(jìn)短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌這4株菌的生長，降低培養(yǎng)基的pH以及增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。因此，CRWPs具有成為益生元的潛力，這極大地提高了蒸餾米酒蒸餾殘液的利用率，為其在經(jīng)濟(jì)型、環(huán)境友好型食品行業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。