李明哲，徐龍飛，2，陳照立，王新興，蒲玲玲，劉偉麗，王天輝△

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050；2.天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動生理與運(yùn)動醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

應(yīng)激及創(chuàng)傷性事件對多種疾病的發(fā)生發(fā)展影響巨大，常常作為疾病發(fā)病或惡性轉(zhuǎn)歸的重要誘因［1-3］。其中，以精神類疾病最為典型，常見的疾病包括抑郁癥、躁狂和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等，即便是遺傳背景主導(dǎo)的某些疾病如精神分裂癥、雙相情感障礙等也常常是遺傳基因和應(yīng)激性事件共同作用的結(jié)果［4，5］。因此，應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究目的是為細(xì)胞應(yīng)激水平的評估和細(xì)胞應(yīng)激損傷調(diào)控研究提供一種可行的實(shí)驗(yàn)對象，構(gòu)建一種應(yīng)激激素誘導(dǎo)的細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型。相比于經(jīng)典的應(yīng)激激素誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激損傷模型，該模型通過調(diào)節(jié)應(yīng)激激素的干預(yù)水平，模擬生物體系不同的應(yīng)激損傷程度，構(gòu)建一種梯度變化的應(yīng)激損傷狀態(tài)，為應(yīng)激損傷的檢測評估技術(shù)開發(fā)和應(yīng)激基礎(chǔ)研究提供一種良好的、可行的實(shí)驗(yàn)對象。

在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA），并促進(jìn)重要的應(yīng)激激素——糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）大量分泌［6-8］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為應(yīng)激損傷的重要靶點(diǎn)，比其他器官集中更高濃度的糖皮質(zhì)激素受體，因此是對應(yīng)激特別敏感、易受應(yīng)激損傷的組織［8-10］。所以，神經(jīng)細(xì)胞是構(gòu)建應(yīng)激損傷模型的良好選擇。PC12細(xì)胞是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞株。其來源于一種可移植的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，該細(xì)胞對神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）有可逆的神經(jīng)元顯形反應(yīng)，該細(xì)胞不合成腎上腺素。其具有可傳代的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究［11］。因此可作為應(yīng)激損傷細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)主體。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12，購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

高糖杜氏培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，貨號：L110KJ，BasalMedia）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered solution，PBS，貨號：P1020，Solarbio）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，貨號：04-001-1ACS，BI，Israel）、青鏈霉素雙抗（貨號：SV30010，Cytiva，America）、胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），不含酚紅（貨號：T1300，Solarbio）、皮質(zhì)酮（貨號：M5533，Abmole，America）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，貨號：D8372-500ml，Solarbio）、96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板（貨號：701001，NEST）、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（貨號：703001，NEST）、T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶（貨號：707003，NEST）CCK-8試劑盒（Cell counting Kit-8，CCK-8，貨號：M4839，Abmole，America）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貨號：A003-1，南京建成）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒（貨號：A001-1，南京建成）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020，Solarbio）、NAD（H）測定試劑盒（貨號：A114-1-1，南京建成）、乳酸脫氫酶檢測試劑盒（貨號：BC0685，Solarbio）、電子天平（型號：ARA1140，OHAUS，America）、臺式高速冷凍離心機(jī)（型號：TLL-C，北京四環(huán)科學(xué)）、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（型號：SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技有限公司）、酶標(biāo)儀（型號：Multiskan MK3，Thermo，Germany），超凈臺（型號：GH802-2，天津生物凈化設(shè)備廠）、熒光倒置顯微鏡（型號：DMIRB，OLMPUS，Switzerland）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基內(nèi)（DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%青鏈霉素雙抗），于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%的對數(shù)生長期時，傳代培養(yǎng)或用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型的構(gòu)建

1.4.1 皮質(zhì)酮溶液的配制 皮質(zhì)酮的分子式：C21H30O4；分子量：346.46；溶解性：10 mmol/L in DMSO；儲存方式：固體粉末可在-20℃下長期保存，溶液密封后可于-20℃下保存一個月。解凍后，稱取10 mg皮質(zhì)酮粉末并溶解于2.8863 ml DMSO中，配成10 mmol/L皮質(zhì)酮溶液備用。

1.4.2 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞應(yīng)激損傷后的細(xì)胞活力檢測 檢測不同濃度應(yīng)激激素（皮質(zhì)酮，0～1 000μmol/L）在經(jīng)過不同干預(yù)時間（8～48 h）后PC12細(xì)胞活力，描述應(yīng)激激素對細(xì)胞活力的影響，篩選模型構(gòu)建的最佳藥物劑量和干預(yù)時間。向已鋪滿PC12細(xì)胞的96孔板中加入不同濃度的皮質(zhì)酮溶液（DMSO，pH：7.4），共設(shè)置了7個濃度梯度（25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400 μmol/L、600μmol/L、1 000μmol/L），每組5個復(fù)孔，同時設(shè)置了細(xì)胞未做任何處理的實(shí)驗(yàn)對照組（0 μmol/L），將其置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)8 h、12 h、24 h、48 h后，用無菌的PBS緩沖溶液洗去各孔中的培養(yǎng)基，重新?lián)Q上新的培養(yǎng)基和血清（100μl），同時向孔板中加入CCK-8溶液（10μl），37℃下共同孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0加藥）-A（空白）］×100%；A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和不同濃度化合物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒有化合物溶液的孔的吸光度。

1.4.3 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型的干預(yù)條件篩選 依據(jù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞應(yīng)激損傷后的細(xì)胞活力檢測結(jié)果，選擇模型的最佳干預(yù)條件。在滿足細(xì)胞活力保持在半數(shù)失活率以下的前提下，選擇皮質(zhì)酮的干預(yù)時間為12 h；皮質(zhì)酮的干預(yù)濃度梯度為25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，200μmol/L，同時設(shè)置DMSO溶劑對照組（solvent control，SC）和細(xì)胞未做任何處理的空白對照組（0μmol/L）。將各干預(yù)組細(xì)胞置于含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行模型構(gòu)建效果的檢測評價。

1.5 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型的評價

1.5.1 微量法檢測細(xì)胞中MDA及SOD水平 將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶5×105cells，每組設(shè)置5個重復(fù)組。各干預(yù)組內(nèi)細(xì)胞MDA和SOD水平檢測按相關(guān)試劑盒說明書操作執(zhí)行。

1.5.2 分光光度法檢測細(xì)胞中NADH和LDH水平 將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2×105cells，每組設(shè)置5個復(fù)孔。各干預(yù)組內(nèi)細(xì)胞NADH和LDH水平檢測按試劑盒說明書操作執(zhí)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮對PC12細(xì)胞活力的干預(yù)效應(yīng)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著PC12細(xì)胞暴露在皮質(zhì)酮溶液中時間的延長和皮質(zhì)酮濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降（表1）。同時，皮質(zhì)酮的干預(yù)時間為12 h，干預(yù)濃度在200μmol/L以下時，細(xì)胞活力可保持在50%以上，各組細(xì)胞活力呈現(xiàn)明顯的梯度下降趨勢，且各組間細(xì)胞活力存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。因此，可選擇此條件作為皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞應(yīng)激損傷的處理?xiàng)l件。

Tab.1 Changes in cell viability after corticosterone intervention in PC12 cells（%，±s，n=5）

Tab.1 Changes in cell viability after corticosterone intervention in PC12 cells（%，±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 200μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 400μmol/L group；○P＜0.05，○○P＜0.01 vs600μmol/L group

Group（μmol/L） 8 h 12 h 24 h 48 h 0 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 25 0.966±0.022 0.940±0.007** 0.908±0.030 0.802±0.040**50 0.874±0.016**## 0.870±0.014**## 0.859±0.083** 0.727±0.045**##100 0.831±0.024**## 0.844±0.022**## 0.766±0.064**## 0.614±0.047**##△△200 0.684±0.014**##△△▲▲ 0.724±0.048**##△△▲▲ 0.542±0.043**##△△▲▲ 0.336±0.034**##△△▲▲400 0.466±0.036**##△△▲▲▽▽ 0.374±0.040**##△△▲▲▽▽ 0.260±0.031**##△△▲▲▽▽ 0.119±0.011**##△△▲▲▽▽600 0.379±0.059**##△△▲▲▽▽▼▼ 0.277±0.037**##△△▲▲▽▽▼▼ 0.206±0.034**##△△▲▲▽▽ 0.061±0.004**##△△▲▲▽▽1000 0.309±0.018**##△△▲▲▽▽▼▼○0.232±0.015**##△△▲▲▽▽▼▼○○0.098±0.022**##△△▲▲▽▽▼▼○ 0.028±0.004**##△△▲▲▽▽▼▼

2.2 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型的驗(yàn)證與評價

2.2.1 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型MDA及SOD水平變化 檢測結(jié)果顯示，不同濃度皮質(zhì)酮干預(yù)PC12細(xì)胞后，胞內(nèi)MDA水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，皮質(zhì)酮濃度在25μmol/L以上的各組間的MDA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。胞內(nèi)SOD水平呈下降趨勢。相比于空白對照組，與皮質(zhì)酮濃度為25μmol/L和50μmol/L的兩組間的SOD水平差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍然存在下降趨勢（表2）。通過這兩個指標(biāo)基本可確認(rèn)隨著皮質(zhì)酮濃度的升高，細(xì)胞應(yīng)激損傷逐漸加重。

Tab.2 Changes of MDA and SOD after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

Tab.2 Changes of MDA and SOD after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 150μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 200μmol/L group

Group（μmol/L）MDA（nmol/mg prot）SOD （U/mg prot） 0 0.509±0.025 0.897±0.045 25 0.962±0.058** 0.827±0.030 50 0.872±0.047** 0.821±0.034 100 1.317±0.060**##△△ 0.792±0.027*150 1.054±0.052**##△△▲▲ 0.655±0.018**##△△▲▲200 1.232±0.050**##△△▲▲▽▽ 0.582±0.027**##△△▲▲Solvent control 0.661±0.068**△△▲▲▽▽▼▼ 0.841±0.034▲▽▽▼▼

2.2.2 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型NADH及LDH水平變化 檢測結(jié)果顯示，不同濃度皮質(zhì)酮干預(yù)PC12細(xì)胞后，胞內(nèi)NADH水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，與皮質(zhì)酮濃度在50 μmol/L以上的各組間的NADH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與皮質(zhì)酮25μmol/L組間的NADH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍呈現(xiàn)上升趨勢（表3）。不同濃度皮質(zhì)酮干預(yù)PC12細(xì)胞后，細(xì)胞LDH水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，與皮質(zhì)酮濃度在150 μmol/L以上的各組間的LDH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與皮質(zhì)酮100μmol/L及以下的各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示皮質(zhì)酮濃度在100μmol/L以下時對細(xì)胞的損害較低（表3）。

Tab.3 Changes of NADH and LDH after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

Tab.3 Changes of NADH and LDH after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 150μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 200 μmol/L group

Group（μmol/L）NADH（nmol/mg prot）LDH （U/mg prot） 0 0.140±0.007 506.684±23.35 25 0.173±0.011 467.885±30.72 50 0.232±0.027** 526.756±20.35 100 0.231±0.002** 545.840±24.01#150 0.363±0.028**##△△▲▲ 707.074±29.06**##△△▲▲200 0.347±0.012**##△△▲▲ 745.471±24.46**##△△▲▲Solvent control 0.148±0.040△△▲▲▽▽▼▼ 519.616±31.63▽▽▼▼

3 討論

細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型是研究及評估細(xì)胞應(yīng)激損傷程度的可行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可用于模擬不同應(yīng)激水平的實(shí)驗(yàn)對象，滿足階梯型應(yīng)激增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)需求。依據(jù)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞應(yīng)激損傷后的細(xì)胞活力檢測結(jié)果，篩選出模型的最佳藥物濃度（0μmol/L～200μmol/L）和干預(yù)時間（12 h），滿足各濃度梯度組的細(xì)胞活力均在半數(shù)衰減量以下，從而排除細(xì)胞活力差異過大而產(chǎn)生的混雜因素影響。

為了評估細(xì)胞梯度應(yīng)激模型的構(gòu)建是否成功，選擇MDA、SOD、NADH及LDH四個生化指標(biāo)與空白組進(jìn)行比較。MDA和SOD是評價細(xì)胞應(yīng)激損傷情況的常用指標(biāo)。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性［12，13］。MDA水平是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過氧化損傷程度［12，13］。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分［14，15］。檢測模型MDA和SOD水平變化有助于評估細(xì)胞的應(yīng)激損傷情況。研究結(jié)果顯示，不同濃度皮質(zhì)酮干預(yù)PC12細(xì)胞后，胞內(nèi)MDA水平呈上升趨勢，胞內(nèi)SOD水平呈下降趨勢，基本可確認(rèn)隨著皮質(zhì)酮濃度的升高，細(xì)胞應(yīng)激損傷程度逐漸加重。

NADH是評價細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。研究顯示NADH水平的增加，可刺激離體腦線粒體H2O2的產(chǎn)生增加約10倍。線粒體ROS積累的增加與NADH/NAD+比值的增加有關(guān)［16，17］。這主要由于NADH過量積累導(dǎo)致還原應(yīng)激增加［18］，并可能直接導(dǎo)致O2

·-和H2O2的產(chǎn)生。特別是過量的NADH可被NADH氧化酶（NADH oxidase，NOxs）利用來產(chǎn)ROS［19，20］。有證據(jù)表明，在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中，缺氧增加細(xì)胞NADH水平和ROS的產(chǎn)生。在低氧條件下，線粒體NADH和FADH2不能被線粒體電子傳遞鏈（electron transfer chain，ETC）氧化，導(dǎo)致這些還原當(dāng)量的積聚和隨后的還原應(yīng)激［21］。還原應(yīng)激能使氧的單電子還原形成O2·-，因此是缺氧條件下活性氧產(chǎn)生增加的基礎(chǔ)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著皮質(zhì)酮濃度的增加，干預(yù)后的細(xì)胞內(nèi)NADH水平呈上升趨勢，可以反映出細(xì)胞處于梯度應(yīng)激增強(qiáng)的狀態(tài)。

LDH廣泛存在于動物、植物、微生物和離體細(xì)胞內(nèi)，是糖酵解的終末限速酶，可催化丙酮酸和乳酸可逆反應(yīng)，伴隨著NAD+/NADH之間互變。當(dāng)細(xì)胞損傷破裂時，LDH會溢散胞外，因此常作為臨床上指示病情進(jìn)展的重要指標(biāo)。LDH升高產(chǎn)檢與心肌梗死、肝疾病及血液疾?。?2，23］。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)皮質(zhì)酮濃度增加到150μmol/L以上時，細(xì)胞LDH水平呈顯著上升，而皮質(zhì)酮濃度在100μmol/L以下時，LDH的變化相比于空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一方面證明細(xì)胞應(yīng)激程度在逐漸上升，也證明皮質(zhì)酮對細(xì)胞活力的影響較小，可滿足細(xì)胞應(yīng)激程度的穩(wěn)定維持。

本研究結(jié)合應(yīng)激損傷的研究現(xiàn)狀，構(gòu)建一種方便可行的細(xì)胞梯度應(yīng)激損傷模型。該方法通過改變激素干預(yù)濃度的變化，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞模型應(yīng)激損傷程度的梯度變化，可以滿足后期應(yīng)激損傷評價及基礎(chǔ)研究干預(yù)的實(shí)驗(yàn)需求。