師希雄，王建忠，陳敬敬，張珍，郭兆斌，余群力

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

藏羊?qū)儆谖覈湫偷牟莸匦筒叵稻d羊，主要分布于四川、青海、甘肅等省的高原地區(qū)，能在海拔3 000 m 以上缺氧的環(huán)境中生存[1]。甘南藏羊可分為歐拉，甘加和喬科3種類型。其中，歐拉羊的數(shù)量和產(chǎn)肉量最多。歐拉藏羊肉具有高蛋白、低脂肪、無污染、富含礦物質(zhì)和氨基酸等特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的天然綠色有機(jī)食品[2]。蛋白質(zhì)是羊肉的主要組成部分，包括肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和基質(zhì)蛋白。其中，肌原纖維蛋白約占總蛋白含量的50%～55%[3-4]。此外，肌原纖維蛋白是具有生物學(xué)功能的鹽溶性結(jié)構(gòu)蛋白，它們的生化特性與肉制品的乳化、流變、凝膠、組織特性和風(fēng)味有關(guān)，在肉制品的加工過程中起到非常重要的作用[5]，但是由于肌原纖維蛋白的分子質(zhì)量較大，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，肽鏈展開不足，與水接觸面積小，降低了溶解度，在一定程度上制約了乳化性、起泡性等其他功能特性，限制了其應(yīng)用。因此，改善藏羊肉肌原纖維蛋白的特性至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)的改性可通過超高壓、超聲波、熱處理、凍融等方式實(shí)現(xiàn)。其中，超高壓是一種新型的非加熱加工技術(shù)，能起到滅菌、鈍化酶活性及改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用[6-7]。肌原纖維蛋白被超高壓處理后，其生化性質(zhì)(乳化、發(fā)泡、膠凝等)可以通過分子間疏水作用、氫鍵、二硫鍵等化學(xué)作用得到改善[8-9]。目前，有關(guān)超高壓對肌原纖維蛋白特性的影響已有報(bào)道。BRAVO等[10]研究發(fā)現(xiàn)，脫脂牛乳超離心上清液蛋白經(jīng)超高壓處理后，其溶解度隨壓力強(qiáng)度的增大呈先上升后下降的趨勢，且在250 MPa時(shí)取得最大值。MARCOS 等[11]發(fā)現(xiàn)牛肉肌原纖維蛋白經(jīng)超高壓處理后溶解度隨壓力的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在200 MPa時(shí)溶解度達(dá)到最大。涂宗財(cái)?shù)萚12]研究發(fā)現(xiàn),超高壓處理能提高大豆分離蛋白的起泡性。XUE等[9]研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理能夠改善雞肉肌原纖維蛋白的溶解度。邱春江[13]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚經(jīng)超高壓處理后，提高了鰱魚肌原纖維蛋白的表面疏水性。近年來，超高壓技術(shù)已被用于牛肉、豆類、水產(chǎn)品等肌原纖維蛋白性的改性，但其對歐拉藏羊肉肌原纖維蛋白特性的影響尚未見報(bào)道。

因此，本研究以歐拉藏羊肉肌原纖維蛋白為實(shí)驗(yàn)對象，對其進(jìn)行不同壓力強(qiáng)度(0、150、250、350、450、550 MPa，保壓10 min)處理后，測定肌原纖維蛋白的乳化性、起泡性、溶解度、濁度、巰基和羰基含量，探究超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白特性的影響，以便為藏羊肉肌原纖維蛋白的改性和超高壓技術(shù)的運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)選取自然放牧、健康狀況良好、體重相近[(50±5) kg]的4～5歲甘南歐拉藏羊3只，采用伊斯蘭教屠宰法屠宰放血后，迅速取其后腿肉，剔去結(jié)締組織和表面筋膜等后，切成約10 g左右的小塊，液氮冷凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并在-80 ℃冷凍貯藏，以備后期提取肌原纖維蛋白并測定相關(guān)指標(biāo)。

NaCl、KCl、NaOH、NaKC4H4O6、CuSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)等均為分析純,北京索萊寶科技有限公司；金龍魚大豆油，蘭州北京華聯(lián)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

CQC2L-600超高壓設(shè)備，北京速原中天股份有限公司；TG16G型高速冷凍離心機(jī)，江蘇東華分析儀器有限公司；752 N紫外-可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；WB100-4F恒溫水浴鍋，瓊安電氣科技有限公司；380B型真空包裝機(jī)，安盛科技有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[14]的方法并略作修改。稱取2 g肉樣于離心管中，然后加入8 mL標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0)，13 000 r/min 勻漿10 s，然后在4 ℃條件下離心( 3 000×g，20 min)，倒掉上清液后，沉淀繼續(xù)用8 mL標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解，隨后在4 ℃條件下以3 000×g的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄上清；沉淀用8 mL 0.1 mol/L NaCl溶液以上述條件洗滌2次，0.1 mol/L NaCl溶液溶解沉淀后，經(jīng)組織搗碎機(jī)振蕩均勻，用單層紗布過濾去除殘留筋膜，然后用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，最后離心(4 ℃，3 000×g，20 min)，棄去上清液，所得沉淀為肌原纖維蛋白。

1.3.2 超高壓處理肌原纖維蛋白

在聚乙烯袋中裝入稀釋好的肌原纖維蛋白溶液20 mL，用真空機(jī)進(jìn)行封口。先打開恒溫槽預(yù)熱，待溫度達(dá)到(23±2) ℃時(shí)將樣品放入加壓艙內(nèi)，設(shè)置處理壓力分別為：0、150、250、350、450、550 MPa，保壓10 min，高壓介質(zhì)為水。其中0 MPa樣品不做任何處理。超高壓處理后立即冰水浴冷卻后測定相關(guān)指標(biāo)，如不能及時(shí)測定置于4 ℃環(huán)境中貯存，并于48 h內(nèi)使用。

1.3.3 乳化特性的測定

參考張維農(nóng)等[15]方法并略作修改。首先用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白溶液調(diào)至5 mg/mL，然后吸取9 mL與3.0 mL大豆油混合，9 500 r/min均質(zhì)1 min后，快速從乳濁液底部吸取20 μL，然后將其用1 g/L 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)調(diào)到5 mL，使其充分混合，然后于500 nm處測吸光值A(chǔ)0，并在10 min后再次從底部吸取20 μL并用1 g/L SDS稀釋至5 mL，測其吸光值A(chǔ)10，空白對照為1 g/L SDS。

(1)

(2)

式中：T為常數(shù)，2.303；A0和A10為均質(zhì)后乳濁液的吸光值；F為乳狀液中油的體積分?jǐn)?shù)25%；t為反應(yīng)時(shí)間，10 min；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL。

1.3.4 溶解度的測定

參考BENJAKUL等[16]方法并略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至2.5 mg/mL，吸取5 mL樣品溶液于塑料離心管中，振蕩使其充分溶解后，將其放置于4 ℃冰箱中1 h，取出后在4 ℃條件離心20 min(4 500 r/min)，測定其離心前后上清液中蛋白質(zhì)含量，按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3.5 起泡性的測定

參考張維農(nóng)等[15]方法并略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至10 mg/mL，然后取5 mL樣品溶液于玻璃量筒中，加入10 mL蒸餾水后體積記為V，均質(zhì)2 min(10 000 r/min)后快速記錄體積V0，放置30 min后，再次記錄體積為V30。計(jì)算如公式(4)和公式(5)所示：

(4)

(5)

1.3.6 表面疏水性測定

參考CHELH等[17]方法并略作修改，肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至2 mg/mL，取2 mL于離心管中，然后向離心管中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)(pH 6.0)，使其混合均勻。用2 mL磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)替換上述的樣品溶液作為對照組。樣品和對照組室溫下振蕩10 min，離心(7 000 r/min，15 min)，取1 mL稀釋10倍，在波長為595 nm處測定OD值。計(jì)算如公式(6)所示：

(6)

式中：A對照和A處理分別為對照組和處理組的OD值。

1.3.7 羰基含量的測定

參考LIU等[18]方法并略作修改。

1.3.8 巰基含量的測定

參考LIU等[18]方法并略作修改。

總巰基的測定：用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，取0.5 mL與4.5 mL緩沖液中(8 mol/L尿素，0.01 mol/L EDTA，0.1 mol/L KH2PO4，pH 6.0)混合在離心管中，然后再加入100 μL Ellman試劑[0.01 mol/L (2-硝基苯甲酸)，0.01 mol/L KH2PO4，pH 6.0]，振蕩30 s，充分混合，靜置25 min，最后在412 nm處測其吸光值，消光系數(shù)為13 600 L/(mol·cm)。

活性巰基的測定：除緩沖液中沒有尿素外，其他方法和總巰基一樣。計(jì)算如公式(7)所示：

(7)

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;A表示樣品OD值;73.53為常數(shù)。

1.3.9 濁度的測定

參照BENJAKUL等[19]方法略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋為1 mg/mL，然后取5 mL于離心管中，在45 ℃水浴保持30 min，隨后冷卻到室溫，其吸光度在波長為600 nm處測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。SPSS 22.0軟件被用于統(tǒng)計(jì)分析來驗(yàn)證顯著性差異，所有數(shù)值均通過單因素差異分析(ANOVA)結(jié)合Duncan′s多重范圍檢驗(yàn)進(jìn)行評估，其中P<0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

如圖1所示，隨著超高壓處理強(qiáng)度的增加，肌原纖維蛋白的羰基含量顯著上升(P<0.05)，150～250 MPa范圍內(nèi)羰基含量變化沒有顯著性差異，在550 MPa時(shí)，比對照組高54.8%。由此可見，超高壓處理引起了肌原纖維蛋白氧化程度的增加。

圖1 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 The effect of ultra-high pressure treatment on the carbonyl content of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

如圖2所示，當(dāng)壓力強(qiáng)度增加時(shí)，顯著降低了肌原纖維蛋白總巰基含量(P<0.05)，而活性巰基含顯著上升(P<0.05)，在550 MPa時(shí)，總巰基含量比對照組低30.3%，活性巰基含量比對照組高56.7%。超高壓處理能使肌原纖維蛋白總巰基含量降低，活性巰基含量增加。

圖2 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響Fig.2 The effect of ultra-high pressure treatment on the total sulfhydryl and active sulfhydryl of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.3 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

如圖3所示，在壓力強(qiáng)度不高于350 MPa時(shí)，表面疏水性隨著壓力強(qiáng)度的增加顯著上升(P<0.05)，且350 MPa時(shí)取得最大值94.9 μg，比對照組高39.8%，350～550 MPa沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，超高壓處理提高了肌原纖維蛋白的表面疏水性。

圖3 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 The effect of ultra-high pressure treatment on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.4 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白溶解度的影響

如圖4所示，在壓力強(qiáng)度不高于350 MPa時(shí)，溶解度隨壓力強(qiáng)度的增加顯著上升(P<0.05)，并且在350 MPa時(shí)取得最大值93.3%，比對照組高54.8%(P<0.05)，壓力強(qiáng)度高于350 MPa時(shí)，溶解度隨壓力強(qiáng)度的增加呈降低的趨勢，且450～550 MPa溶解度差異不顯著(P>0.05)。超高壓強(qiáng)度處理能提高肌原纖維蛋白的溶解度。

圖4 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.4 The effect of ultra high-pressure treatment on the solubility of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.5 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白濁度的影響

如圖5所示，在150～350 MPa范圍內(nèi)，隨著超高壓強(qiáng)度的增加藏羊肉肌原纖維蛋白的濁度顯著下降(P<0.05)，且在450 MPa時(shí)取得最小值0.60，比對照組低20%，350 MPa以后差異不顯著(P>0.05)，由此可見，超高壓處理可以降低肌原纖維蛋白的濁度。

圖5 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.5 The effect of ultra-high pressure treatment on the turbidity of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.6 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

如圖6所示，在0～250 MPa，起泡性顯著上升(P<0.05)，在350～450 MPa差異不顯著(P>0.05)，550 MPa時(shí)起泡性顯著降低；在0～350 MPa，起泡穩(wěn)定性隨著壓力強(qiáng)度的增加顯著上升(P<0.05)，且在350 MPa 時(shí)獲得最大值75%，比對照組高26.7%(P<0.05)，450～550 MPa沒有顯著性差異(P>0.05)。說明，超高壓處理改善了肌原纖維蛋白的起泡性能。

圖6 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of ultra-high pressure treatment on the foamability and foaming stability of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.7 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

如圖7所示，藏羊肉肌原纖維蛋白的乳化性隨壓力強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(P<0.05)，并且在 350 MPa 時(shí)達(dá)到最大值 76.3 m2/g，比對照組高56.6%，在壓力強(qiáng)度不高于250 MPa時(shí)，隨著壓力強(qiáng)度的增加，肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)，在250 MPa時(shí)取得最大值，并且比對照組高13.1%。超高壓處理改善了肌原纖維蛋白的乳化性能。

圖7 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 The effect of ultra-high pressure treatment on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

3 討論

羰基反映蛋白質(zhì)的氧化程度，羰基含量越高，說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化越大[20]。巰基是蛋白質(zhì)中最具有反應(yīng)活性的功能基團(tuán)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性與巰基的含量有關(guān)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白經(jīng)超高壓處理后，其活性巰基和羰基含量顯著增加，而總巰基含量顯著降低。原因可能是肌原纖維蛋白經(jīng)超高壓處理后，其分子結(jié)構(gòu)展開，包埋在內(nèi)部的巰基基團(tuán)暴露其表面，增加了活性巰基含量，并且暴露在蛋白表面的一些巰基與氧氣結(jié)合形成了二硫鍵，降低了總巰基含量；而羰基含量增加的原因是蛋白經(jīng)超高壓處理后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起各種氧化酶產(chǎn)生活性氧和非氧自由基[21]。郭麗萍[21]研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理使豬肉肌漿蛋白的羰基含量升高。李長樂[22]研究發(fā)現(xiàn)鰹魚肌原纖維蛋白總巰基含量在100～500 MPa時(shí)表現(xiàn)出下降，而活性巰基含量升高。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。

表面疏水性能反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化情況，蛋白質(zhì)中的非極性氨基酸和疏水基團(tuán)與表面疏水性具有一定的相關(guān)性[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在壓力強(qiáng)度不高于350 MPa時(shí)，表面疏水性隨著壓力強(qiáng)度的增加呈顯著性上升，高于350 MPa后，表面疏水性降低?？赡茉蚴?50 MPa以下的壓力改變了蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，暴露了一些疏水性氨基酸殘基，從而導(dǎo)致表面疏水性增加。但當(dāng)壓力強(qiáng)度超過350 MPa后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，更多的氨基酸暴露出來并且重新開始分布，使得部分疏水性下降。本研究結(jié)果與邱春江[13]報(bào)道的研究結(jié)果相一致。

溶解度是反映蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨超高壓強(qiáng)度的增強(qiáng)，肌原纖維蛋白的溶解度呈先上升后下降?？赡苁怯捎趬毫Φ陀?50 MPa時(shí)蛋白質(zhì)經(jīng)適度變性后與水分子的結(jié)合能力增強(qiáng)，造成溶解度升高，而過大的壓力強(qiáng)度會(huì)使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，疏水基團(tuán)暴露并聚集形成不溶性聚集體，從而降低了溶解度[11]。本試驗(yàn)結(jié)果與MARCOS等[11]關(guān)于牛肉肌原纖維蛋白溶解度在0.1～400 MPa范圍內(nèi)隨壓力增大呈先上升后下降趨勢的報(bào)道相一致。BRAVO等[10]發(fā)現(xiàn)超高壓處理乳清蛋白也有類似的現(xiàn)象。溶解度是由電荷頻率和表面疏水性所決定，當(dāng)電荷頻率越高、表面疏水性越低時(shí)，肌原纖維蛋白的溶解度越高，反之則越小。本研究結(jié)果表明溶解度隨表面疏水性的增加而變大，這可能是由于電荷頻率對肌原纖維蛋白溶解度的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于表面疏水性的作用。

濁度是反映蛋白質(zhì)顆粒大小的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白的濁度隨壓力強(qiáng)度的增大呈先下降后略微升高趨勢。結(jié)果與WU等[4]報(bào)道的研究結(jié)果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肌原纖維蛋白濁度在0～120 MPa時(shí)表現(xiàn)出顯著下降。其原因可能是在超高壓的作用下，一些大的聚集體逐漸解體，使蛋白質(zhì)顆粒變小，導(dǎo)致濁度降低。因蛋白質(zhì)顆粒變小，暴露出更多的表面積，增加了水分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致溶解度升高，這與上述溶解度增加的結(jié)果一致。

反映蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要指標(biāo)包括起泡性和乳化性，一般情況下蛋白質(zhì)分子越小，起泡能力越弱[23]。乳化性是指蛋白質(zhì)能使油水結(jié)合形成穩(wěn)定乳化液的能力[24]。乳化穩(wěn)定性是指在水油不分離情況下蛋白質(zhì)能保持乳濁液的能力[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，藏羊肉肌原纖維蛋白的起泡性和乳化性隨著壓力強(qiáng)度的增大呈先上升后降低。MARCOS等[11]報(bào)道的牛血清蛋白的起泡性能隨著壓力強(qiáng)度的增加先升高后降低。李長樂[22]研究發(fā)現(xiàn)鰹魚肌原纖維蛋白被壓力處理后，提高了肌原纖維蛋白的乳化性能。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。可能原因是較低的壓力使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生適度解離，使內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出，導(dǎo)致乳濁液水油界面的張力減小，增加了分子柔性，有助于起泡性能和乳化性能增強(qiáng)。之后，隨著壓力的進(jìn)一步增大蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致暴露出的疏水基團(tuán)再次聚合增加了乳濁液中不溶性物質(zhì)的含量，削弱了乳化性能和起泡性能[22]。

4 結(jié)論

超高壓(150～550 MPa)處理藏羊肉肌原纖維蛋白后，其乳化性、乳化穩(wěn)定性、溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性及表面疏水性隨著壓力的增大呈先上升后下降的趨勢，壓力強(qiáng)度為350 MPa時(shí)，乳化性、溶解度、起泡穩(wěn)定性和表面疏水性達(dá)到最大值，濁度呈先下降后保持穩(wěn)定，壓力強(qiáng)度為450 MPa時(shí)，達(dá)到最小值。另外，羰基含量和活性巰基含量顯著上升，總巰基含量顯著下降?？傊?，適宜的壓力條件可以顯著改善藏羊肉肌原纖維蛋白的功能特性，并且防止氧化，從而為肉制品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。