羅瀟瀟，方雷，趙健，龔鑫，王林，鄭蘭榮，丁見(jiàn)

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)作為一種常見(jiàn)的癡呆類型，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。VD的主要臨床特點(diǎn)與其他癡呆相似，表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶喪失等[2]。有研究表明，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎術(shù)(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)可導(dǎo)致慢性腦灌注不足，而VD 的發(fā)生發(fā)展與其有密切關(guān)系[3]。神經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)結(jié)果已證實(shí)，因血管阻塞或者病變引起腦血供減少時(shí)，會(huì)引起大腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞活化增多，促使炎癥因子及氧自由基大量釋放損傷神經(jīng)元，而長(zhǎng)期慢性缺血會(huì)導(dǎo)致海馬、皮質(zhì)損傷伴隨認(rèn)知功能障礙[4-5]。隨著我國(guó)老齡化的加劇以及心血管疾病發(fā)病率的增加，受到血管性癡呆困擾的人群越來(lái)越多，VD已成為亟待解決的重大醫(yī)療衛(wèi)生問(wèn)題，但迄今為止仍然缺乏有效治療手段，迫切需要尋找防治VD的有效靶點(diǎn)。

多項(xiàng)研究表明，炎癥機(jī)制參與了VD 后的神經(jīng)病理?yè)p傷，而抑制炎癥可以減緩VD引起的一系列慢性腦缺血神經(jīng)損傷[6]。白藜蘆醇(3，4′，5-trihydroxystilbene， Rsv)是一種多酚化合物，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，如抗炎、抗氧化等，其對(duì)于認(rèn)知功能障礙同樣具有有效的改善作用[7-8]。據(jù)報(bào)道，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulat-or of transcription 1，SIRT1)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙?；割?histone deacetylases，HDACs)，可以調(diào)節(jié)多種組織和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[9]。白藜蘆醇作為SIRT1的有效化學(xué)激動(dòng)劑，可以通過(guò)介導(dǎo)SIRT1轉(zhuǎn)錄，從而抑制或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用[10]。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的促炎和抗炎反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，可促進(jìn)與炎癥相關(guān)的基因表達(dá)[11]。此外，有研究表明，抑制SIRT1的表達(dá)可以在表觀遺傳學(xué)上促進(jìn)STAT3的表達(dá)[12]。通過(guò)抑制STAT3來(lái)改善炎癥反應(yīng)在一定程度上依賴于SIRT1的表達(dá)，但目前未見(jiàn)有關(guān)白藜蘆醇對(duì)VD大鼠的治療作用與SIRT1/STAT3通路有關(guān)的報(bào)道[13]。本研究采用BCCAO復(fù)制VD大鼠模型，旨在探討白藜蘆醇對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其通過(guò)SIRT1/STAT3信號(hào)通路改善炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，8～10周齡，體重190～220 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK(皖)2018-004，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(魯)20190003。所有動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)于皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，大鼠能夠自由地獲取食物和飲水，保持12 h的明暗循環(huán)，溫度適宜。本實(shí)驗(yàn)的所有流程均按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)意見(jiàn)》指導(dǎo)進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 白藜蘆醇(寶雞市方晟生物開(kāi)發(fā)有限公司，純度：98%)；SIRT1一抗(mAb #8469，美國(guó)Cell Signaling Technology)；STAT3一抗(mAb #30835，美國(guó)Cell Signaling Technology)；IL-17一抗(bs-1183R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；β-actin(AA128)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PVDF膜(0.45 μm)、彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10-180kD)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；免疫組織化學(xué)染色試劑盒、多聚賴氨酸 (武漢博士德生物工程有限公司); ELISA試劑盒(EIA-3479，上海艾萊薩生物科技有限公司)；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；病理級(jí)顯微鏡載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器械有限公司)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；石蠟組織切片機(jī)( RM2145型，德國(guó)Lica)；立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；實(shí)驗(yàn)室超純水制造系統(tǒng)(安徽久智電子科技有限公司)；BX51正置顯微鏡 (日本OLYMPUS)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Amersham)；Western blot儀器(美國(guó)Bio-Rad)；高通量組織研磨儀(中國(guó)上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek Instruments)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 將30只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠中22只進(jìn)行BCCAO建立VD模型。術(shù)前保持空腹8 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)手術(shù)區(qū)域消毒，備皮。頸部作正中切口，暴露出雙側(cè)的頸總動(dòng)脈后，小心地將其與周?chē)M織進(jìn)行鈍性分離，并用無(wú)菌絲線在距離頸外動(dòng)脈起點(diǎn)約1 cm處進(jìn)行結(jié)扎，切口常規(guī)縫合。假手術(shù)組大鼠作正中切口暴露出雙側(cè)頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，其他處理同模型組。隨機(jī)選取其中造模成功的大鼠16只，隨機(jī)分為VD模型組、VD治療組，另設(shè)置假手術(shù)組作為對(duì)照，每組8只。治療組大鼠每天給予白藜蘆醇(20 mg/kg)灌胃治療，持續(xù)30 d；假手術(shù)組和模型組每天給予同等體積的生理鹽水灌胃，持續(xù)30 d。

1.2.2 Morris水迷宮 Morris水迷宮設(shè)備由一個(gè)直徑150 cm、高50 cm的圓形水池和自動(dòng)錄像及視頻分析系統(tǒng)組成，實(shí)時(shí)記錄每只大鼠的游泳路徑，可以用來(lái)檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。白藜蘆醇灌胃治療30 d結(jié)束后，前6 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將各組大鼠分別放在4個(gè)象限內(nèi)尋找平臺(tái)，記錄逃避潛伏期。平臺(tái)直徑約10 cm，將其置于第4象限的中央位置，低于水面2 cm。若大鼠90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其至平臺(tái)上并停留15 s，并將其逃避潛伏期記為90 s。休息1 d后，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。去除平臺(tái)，讓各組大鼠從原來(lái)平臺(tái)附近兩個(gè)象限之一進(jìn)入水迷宮，不設(shè)限地進(jìn)行90 s的游泳，記錄各組大鼠穿過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)以及在各個(gè)象限停留的時(shí)間。

1.2.3 標(biāo)本收集 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，用10%水合氯醛將各組大鼠深度麻醉，取各組大鼠眼眶血，4 ℃過(guò)夜后于2 000 r/min離心20 min后取上清液用于ELISA實(shí)驗(yàn)。確定大鼠劍突位置，沿劍突橫剪開(kāi)胸腹腔，看見(jiàn)心臟后，一手持針頭，對(duì)比穿刺距離，從左心室穿至主動(dòng)脈弓，固定好針頭后迅速剪開(kāi)右心耳，快速注入100 mL預(yù)冷的生理鹽水沖洗。斷頭取腦后一側(cè)腦用4%多聚甲醛充分浸泡固定后用于免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)；另一側(cè)快速分離額葉皮層組織置于-80 ℃凍存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SIRT1、STAT3及IL-17陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá) 將放入4%多聚甲醛中固定的一側(cè)腦參照《大鼠腦立體定位圖譜》進(jìn)行分段，保留含有額葉皮質(zhì)的部分，依次進(jìn)行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、貼片(切片厚度為5 μm)。將切片放入二甲苯中脫蠟至梯度酒精脫水后放入蒸餾水中。隨后將切片移入枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中進(jìn)行熱修復(fù)抗原(高火3 min、低火15 min)。加熱結(jié)束后取出，待枸櫞酸鹽緩沖液自然冷卻后，用蒸餾水洗3次，無(wú)時(shí)間要求。將3%過(guò)氧化氫溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)滴于已熱修復(fù)并完成的切片，室溫下避光孵育10 min。蒸餾水洗3次，每次5 min，擦干后滴加破膜劑孵育30 min。PBS緩沖液洗3次，每次5 min，擦干后滴加5%BSA置于37 ℃溫箱中封閉2 h。取出后甩干封閉液，滴加SIRT1、STAT3或IL-17一抗(1∶150)4 ℃孵育16～24 h。將切片移入37 ℃溫箱中復(fù)溫30 min，取出用PBS洗3次，每次5 min。擦干后滴加二抗山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1∶100)，移入37 ℃溫箱中孵育2 h。取出后，PBS洗3次，每次5 min，擦干后滴加三抗(SABC)，37 ℃溫箱中孵育1 h。洗滌干凈擦干后滴加DAB顯色劑(HRP∶A液∶B液=1000∶50∶50)。雙蒸水沖洗切片終止反應(yīng)，梯度酒精脫水后用中性樹(shù)膠封片。采用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)400倍光學(xué)顯微鏡視野下額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1、STAT3與IL-17平均免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均細(xì)胞灰度值，灰度值越小蛋白表達(dá)越強(qiáng)，灰度值越大則蛋白表達(dá)越弱。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)SIRT1、STAT3及IL-17的表達(dá) 取出-80 ℃冰箱凍存的各組大鼠額葉皮質(zhì)組織樣本約30 mg，加入RIPA裂解液和PMSF進(jìn)行組織裂解(RIPA∶PMSF=99∶1)，組織研磨儀充分研磨組織后放入4 ℃冰箱靜置1.5～2 h，使其充分裂解。離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白含量。將蛋白上樣緩沖液溶解，按照樣品：5×蛋白上樣緩沖液=4∶1，計(jì)算出蛋白上樣緩沖液體積，充分混勻。根據(jù)各目標(biāo)蛋白的分子量大小配置SDS-PAGE凝膠，上樣后先選擇80 V恒壓電泳，30 min后再調(diào)至110 V，繼續(xù)電泳約60 min。根據(jù)蛋白Marker指示，待溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部時(shí)停止電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST洗3次，每次10 min，孵育SIRT1、STAT3、 IL-17或β-actin一抗(1∶1000)，4 ℃冰箱過(guò)夜。第2天取出后，TBST洗3次，每次10 min，孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(1∶1000)1 h。TBST洗3次，ECL化學(xué)曝光顯影。采用Image J分析條帶灰度值。

1.2.6 ELISA法測(cè)定下游炎癥因子IL-17表達(dá) 將所有試劑及樣本平衡至室溫；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣品孔(至少3個(gè))，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；3個(gè)樣品孔中加入樣本50 μL(空白孔不加)；除空白孔外，其他各孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IL-17抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔后，37 ℃溫箱孵育1 h；棄去各孔液體，在吸水紙上拍干后加滿350 μL洗滌液洗滌，靜置1 min后甩干液體，如此重復(fù)5次；每孔加入底物A、B各50 μL，放入37 ℃溫箱中避光孵育15 min；每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)；15 min內(nèi)通過(guò)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。將樣品的OD值分別帶入所求得的直線回歸方程中，分別計(jì)算出各組樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以確定白藜蘆醇灌胃治療后是否能改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，VD模型組于第4天開(kāi)始逃避潛伏期明顯增加(P<0.01)。然而，白藜蘆醇灌胃給藥治療30 d后，逃避潛伏期顯著降低(P<0.05)。另外，除去平臺(tái)后，與VD模型組相比，白藜蘆醇治療組通過(guò)原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)和停留在目標(biāo)象限的時(shí)間比例顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A.定位航行實(shí)驗(yàn)中各組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間(逃避潛伏期)比較；B.空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠的游泳軌跡示例圖；C.空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠在90 s內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)比較；D.空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比比較。*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001。圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力

2.2 各組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1、STAT3、IL-17的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)情況比較 結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)SIRT1陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色深染，細(xì)胞散在分布，細(xì)胞輪廓呈小圓形或者橢圓形。VD模型組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組減少(P<0.001)，胞質(zhì)染色變淡，細(xì)胞平均灰度值升高(P<0.01)；與VD模型組相比，VD治療組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1陽(yáng)性神經(jīng)元深染，陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P<0.01)，平均灰度值明顯降低(P<0.01)。此外，各組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)均有STAT3、IL-17的表達(dá)，二者陽(yáng)性神經(jīng)元均呈棕黃色淡染；與假手術(shù)組比較，VD模型組STAT3和IL-17陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，平均灰度值均降低(P<0.01)；與VD模型組比較，VD治療組STAT3和IL-17陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，平均灰度值顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1、STAT3、IL-17的蛋白量表達(dá)變化 各組大鼠額葉皮質(zhì)SIRT1、STAT3、IL-17蛋白表達(dá)與免疫組化染色結(jié)果趨勢(shì)一致。與假手術(shù)組比較，VD模型組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低，而STAT3與IL-17蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與VD模型組相比，白藜蘆醇治療組大鼠額葉皮質(zhì)內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)顯著升高，而STAT3與IL-17蛋白表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A.各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1、STAT3、IL-17陽(yáng)性神經(jīng)元的染色示例圖；B.各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1、STAT3、IL-17平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較；C.各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1、STAT3、IL-17平均灰度值比較。放大倍數(shù)×400；標(biāo)尺長(zhǎng)度50 μm。*P<0.05，** P<0.01，***P<0.001。圖2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1、STAT3及IL-17免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)情況

注：A.各組蛋白印跡示例圖；B.各組大鼠額葉皮質(zhì)中SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較；

2.4 ELISA法檢測(cè)各組大鼠中炎癥因子IL-17的分泌情況 結(jié)果如圖4所示，與假手術(shù)組比較，VD模型組炎癥因子IL-17分泌顯著增加(P<0.001)；與VD模型組相比，白藜蘆醇治療組IL-17分泌顯著降低(P<0.05)。

3 討論

VD是僅次于阿爾茨海默癥(alzheimer disease，AD)的第二大常見(jiàn)的癡呆類型，約占所有癡呆癥患者的20%，預(yù)計(jì)到2050年，這一數(shù)字將增加兩倍[3]。VD作為迄今為止唯一可防治的癡呆類型，若盡早干預(yù)治療可有效延緩疾病進(jìn)展，因此，尋找新的治療策略至關(guān)重要。大鼠BCCAO可導(dǎo)致慢性腦灌注不足，本研究利用BCCAO法復(fù)制VD大鼠模型，是研究VD相關(guān)機(jī)制較為理想的動(dòng)物模型。白藜蘆醇具有多重有益的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)各種神經(jīng)退行性疾病起到神經(jīng)保護(hù)作用，已被用作很多動(dòng)物模型中治療認(rèn)知功能缺陷的藥物。盡管許多研究報(bào)道了白藜蘆醇與認(rèn)知功能之間的密切聯(lián)系，但其潛在機(jī)制仍不清楚。本課題組研究了白藜蘆醇對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，模型組在空間探索實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期與穿越原平臺(tái)次數(shù)均顯著減少。而白藜蘆醇灌胃治療30 d后，可以逆轉(zhuǎn)這一改變。這不僅證明了白藜蘆醇治療可以有效治療VD大鼠的認(rèn)知功能障礙，改善了VD大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，同時(shí)也從側(cè)面驗(yàn)證了造模成功。

注：*P<0.05，***P<0.001。圖4 各組大鼠血清炎癥因子IL-17分泌情況比較(ELISA法)

炎癥反應(yīng)是腦缺血后引起腦細(xì)胞繼發(fā)性損傷的重要因素，臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究均表明，炎癥反應(yīng)參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為VD的重要發(fā)病機(jī)制之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)VD小鼠通過(guò)PNA5治療后發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)TNF和IL-7含量降低，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子IL- 10的表達(dá)水平；NF-κB(與炎癥反應(yīng)的放大和持續(xù)相關(guān))參與腦缺血后的炎癥反應(yīng)；在 VD 動(dòng)物模型中，CB2R 選擇性激動(dòng)劑能夠減少大鼠腦灌注不足和VD時(shí)的記憶障礙和梗塞面積[14-16]。已有研究證明，VD早期即可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，患者的基因譜中與炎癥相關(guān)的標(biāo)志物含量增加，腦組織中廣泛的炎癥反應(yīng)影響神經(jīng)元的增殖、遷移、分化和存活，從而誘導(dǎo)了一系列行為和認(rèn)知變化[17]。因此，以炎癥為靶標(biāo)進(jìn)行VD醫(yī)學(xué)干預(yù)，具有重要的醫(yī)學(xué)科學(xué)意義。目前有關(guān)該病癥的發(fā)病機(jī)制和治療的研究中，大多數(shù)都集中在海馬損傷上，對(duì)額葉皮質(zhì)研究關(guān)注較少。額葉皮質(zhì)作為大腦新皮質(zhì)中的重要聯(lián)絡(luò)腦區(qū)，也參與了高級(jí)認(rèn)知過(guò)程，在學(xué)習(xí)記憶等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18]。同時(shí)，炎癥反應(yīng)不僅是VD重要的發(fā)生發(fā)展因素，還會(huì)影響額葉皮質(zhì)功能，導(dǎo)致出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙[19]。作為SIRT1的有效激動(dòng)劑，有證據(jù)表明白藜蘆醇可能通過(guò)激活SIRT1信號(hào)通路從而逆轉(zhuǎn)VD造成的神經(jīng)損傷[20]。SIRT1通常被認(rèn)為是炎癥過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子。例如，白藜蘆醇可通過(guò)激活SIRT1有效改善錳誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥并通過(guò)去乙?；揎桼elA/P65的Lys310殘基，抑制 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制炎性基因表達(dá)，減少神經(jīng)元損傷[21-22]。STAT3作為調(diào)節(jié)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的促炎和抗炎反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，可促進(jìn)與炎癥相關(guān)的基因表達(dá)，其激活可增加神經(jīng)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子分泌。在細(xì)胞核中 STAT3 含量增加，為調(diào)控大量炎性基因的表達(dá)發(fā)揮重要功能，促炎因子 IFN-γ可通過(guò) JAK2/STAT3 促進(jìn) LPS、TNF-α、IL-1等引起的炎癥反應(yīng)，而抗炎因子 IL-10、IL-4 也可通過(guò)該通路抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展[23]。研究表明，SIRT1可激活誘導(dǎo)STAT3去乙?；?，從而降低其易位到細(xì)胞核與Rorc啟動(dòng)子結(jié)合的趨勢(shì)并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄的能力同時(shí)降低小鼠和人類Th17細(xì)胞的分化從而下調(diào)IL-17A，其在炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用[24]。基于上述發(fā)現(xiàn)，假設(shè)白藜蘆醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)參與VD引起的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色及Western blot法探究SIRT1/STAT3在VD大鼠模型中表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，SIRT1被白藜蘆醇激活后可在一定程度下調(diào)STAT3及其下游炎癥因子IL-17的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討激活SIRT1/STAT3信號(hào)通路后下游炎癥因子變化情況，本研究通過(guò)ELISA法檢測(cè)各組IL-17的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)，激活SIRT1/STAT3信號(hào)通路可以有效改善VD引起的炎癥反應(yīng)。

綜上，目前的研究表明，白藜蘆醇可能具有治療VD大鼠認(rèn)知功能損傷的潛力，其通過(guò)激活SIRT1/STAT3信號(hào)通路下調(diào)下游炎癥相關(guān)因子釋放，抑制 VD 引起的炎癥性損傷，進(jìn)而改善 VD 大鼠的學(xué)習(xí)、記憶障礙。然而，由于VD引起炎癥性損傷機(jī)制復(fù)雜，本研究的發(fā)現(xiàn)可能為VD提供了有益的治療干預(yù)靶點(diǎn)，但其確切機(jī)制仍有待于未來(lái)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探索。