黃宏山，韋春麗，易雪麗，韋貴將

(1. 廣西百色市人民醫(yī)院，右江民族醫(yī)學院附屬西南醫(yī)院超聲醫(yī)學科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 百色 533000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是世界上常見的腦血管疾病[1]。根據(jù)最近發(fā)布的流行病學調查結果顯示，在過去10年里我國IS發(fā)病率和患病率一直呈上升的趨勢[2-3]，IS已成為威脅廣大人民群眾健康的重要疾病，IS病因學研究亦成為醫(yī)學界一項緊迫而重要的任務。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人體內同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝的一個關鍵酶，它對血液中Hcy維持在一個正常水平上具有重要作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因參與了IS的發(fā)生，其遺傳變異與IS易感性的關系也成為研究的熱點[5-6]。由于基因遺傳變異在不同人群中分布有差別，因此不同人群疾病易感性亦有差別[7]。截止目前，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118和rs1801133與IS易感性的相關性少有充分研究。因此，本研究對MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118和rs1801133與IS易感性的相關性展開研究。

1 對象與方法

1.1 對象 病例組為2018年1月1日—2018年6月30日到右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科住院的200例IS患者。每例IS患者均由兩名經驗豐富的右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀、磁共振成像、計算機斷層掃描和其它神經血管系統(tǒng)檢查診斷。本研究病例組排除復發(fā)性IS、出血性腦卒中、心源性腦血管疾病、腫瘤性、外傷性、感染性及腦血管畸形等其他原因導致的腦卒中和原因不明性的腦卒中。病例組男131例，女69例，年齡49～88歲，平均年齡(61.45± 9.07)歲。對照組為2018年1月1日—2018年6月30日到右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院進行常規(guī)體檢的200名健康者。根據(jù)體檢過程中的臨床實驗室及影像學檢查結果和對體檢者的問詢，本研究對照組排除重大疾病史、腦卒中史、癌癥和遺傳性、自身免疫性、神經性或心源性疾病等。對照組男130例，女70例，年齡46～80歲，平均年齡(60.41±6.70)歲。本研究已獲得右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有病例和對照均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增 抽取2 mL病例或對照者靜脈血，提取血細胞基因組DNA(Transgen公司)后-80 ℃ 保存。從National Center for Biotechnology Information上下載MTHFR基因組序列，在Primer Premier 5軟件(Premier Biosoft公司)上設計MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118及rs1801133擴增和延伸引物，再由上海生工公司合成。引物信息如表1所示。20 μL的PCR反應體系：2.0 μL的10×PCR反應緩沖液，2.0 μL的0.3 mmol/L dNTPs，各1.0 μL的10 μmol/L上下游引物，1.0 U的HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen公司)，50 ng基因組DNA。PCR 反應程序：94 ℃ 15 min； 94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133 擴增和延伸引物

1.2.2 基因分型 使用MagS磁珠凝膠回收試劑盒(百奧萊博公司)純化PCR產物，再進行SNaPshot單堿基延伸反應(Applied Biosystems公司)。反應程序：96 ℃ 2min；96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共25個循環(huán)；4 ℃ forever。延伸產物在毛細管電泳儀(Applied Biosystems公司)上樣，最后使用Gene Mapper(Applied Biosystems公司)解析電泳結果。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測MTHFR基因遺傳變異位點的群體代表性；千人基因組計劃數(shù)據(jù)從Ensembl數(shù)據(jù)庫(http：//asia.ensembl.org/index.html)獲??；使用t檢驗對比年齡分布差異，使用χ2檢驗對比性別分布差異；使用Logistic回歸分析MTHFR基因遺傳變異位點基因型和等位基因型分布頻率與IS易感性的相關性，使用比值比(Odds Ratio，OR)及其95%置信區(qū)間(Confidence Interval，CI)表示IS發(fā)生的相對風險度，同時使用性別和年齡校正P值。檢驗水準=0.05。

2 結果

2.1 MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133基因型檢測結果 本研究中MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133基因型檢測結果顯示，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118存在3種基因型，分別為TT、TC和CC，Sanger測序結果如圖1所示。位點 rs1801133存在3種基因型，分別為CC、CT和TT，Sanger測序結果如圖2所示。

圖1 MTHFR基因SNP rs9651118的Sanger測序結果

圖2 MTHFR基因SNP rs1801133的Sanger測序結果

2.2 MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133在不同地區(qū)人群中的分布對比 本研究中IS組和對照組的年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，同時兩組研究對象的MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有良好的群體代表性。不同地區(qū)人群rs9651118及rs1801133基因型和等位基因型頻率的比較結果分別如表2和表3所示。本研究MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118 TT、TC和CC 3種基因型在對照組中的頻率分別為34.00%、47.00%和19.00%，T、C等位基因型在對照組中的頻率分別為57.50%、42.50%，本研究人群與千人基因組計劃中的越南胡志明及中國華南地區(qū)人群的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是與中國北京、尼日利亞埃多、西班牙伊比利亞及斯里蘭卡泰米爾地區(qū)人群的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133 CC、CT和TT 3種基因型在對照組中的頻率分別為63.00%、32.00%和5.00%，C、T等位基因型在對照組中的頻率分別為79.00%、21.00%，本研究人群與千人基因組計劃中的越南胡志明及中國華南地區(qū)人群的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是與中國北京、尼日利亞埃多、西班牙伊比利亞及斯里蘭卡泰米爾地區(qū)人群的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 不同地區(qū)人群rs9651118基因型和等位基因型頻率的比較

表3 不同地區(qū)人群rs1801133基因型和等位基因型頻率的比較

2.3 MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118及rs1801133與IS易感性的相關性 MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118及rs1801133與IS易感性的相關性分析結果如表4所示。MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118 TT、TC和CC 3種基因型在IS組中的頻率分別為34.50%、45.00%和20.50%，在對照組中的頻率分別為34.00%、47.00%和19.00%。在共顯性模式中，相比rs9651118 TT基因型，TC和CC基因型對本研究人群罹患IS風險的影響差異無統(tǒng)計學意義(OR=0.92，95%CI：0.59～1.44，P=0.726；OR=1.06，95%CI：0.61～1.85，P=0.828)。在隱性模式中，相比TT + TC基因型，CC基因型對IS罹患風險的影響差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.12，95%CI：0.68～1.84，P=0.653)。在顯性模式中，相比TT 基因型，CC+ TC基因型對IS罹患風險的影響差異無統(tǒng)計學意義(OR=0.97，95%CI：0.64～1.47，P=0.880)。相比T等位基因型，C等位基因型對IS罹患風險的影響亦差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.01，95%CI：0.76～1.33，P=0.960)。MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133 CC、CT和TT 3種基因型在IS組中的頻率分別為56.00%、33.00%和11.00%，在對照組中的頻率分別為63.00%、32.00%和5.00%。在共顯性模式中，相比rs1801133 CC基因型，CT基因型對本研究人群罹患IS風險的影響差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.16，95%CI：0.76～1.78，P=0.493)，但是TT基因型則顯著增加IS罹患風險(OR=2.51，95%CI：1.14～5.55，P=0.023)。在隱性模式中，相比CC+CT基因型，TT基因型顯著增加IS罹患風險(OR=2.40，95%CI：1.10～5.23，P=0.027)。在顯性模式中，相比CC基因型，TT+CT基因型對IS罹患風險的影響差異無統(tǒng)計學意義(OR=2.18，95%CI：0.95～4.97，P=0.064)。相比C等位基因型，T等位基因型亦顯著增加IS罹患風險(OR=1.44，95%CI：1.04～2.00，P=0.028)。

表4 MTHFR基因遺傳變異位點 rs9651118及rs1801133與IS易感性的相關性

3 討論

IS是指由于腦部血管堵塞或者狹隘導致腦供血不足，神經細胞大量死亡進而致死或者致殘的疾病，它是世界上常見的腦血管疾病，在許多國家中是致死致殘的重要因素[1]。在過去10年里，我國IS發(fā)病率和患病率一直呈上升的趨勢，其中發(fā)病率和患病率分別由2007年的119/100 000和1053/100 000上升至2017年的156/100 000和1470/100 000，IS已成為威脅廣大人民群眾健康的重要疾病，IS病因學研究亦成為醫(yī)學界一項緊迫而重要的任務[2-3]。Hcy是人體內甲硫氨酸代謝的產物，過往研究顯示，血液中上升的Hcy是LAAIS發(fā)生的重要危險因素，在臨床調查研究中，Hcy上升人群罹患LAAIS的風險顯著大于一般人群[8]。MTHFR是人體內Hcy代謝的一個關鍵酶，它可以將5，10-亞甲基四氫葉酸轉換為5-甲基四氫葉酸，后者和Hcy在甲硫氨酸合成酶和維生素B12的催化作用下轉變?yōu)榧琢虬彼?，從而使Hcy保持在一個正常的水平[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因參與了IS的發(fā)生，其遺傳變異與IS易感性的關系也成為研究的熱點[5-6]。由于基因遺傳變異在不同人群中分布有差別，因此不同人群疾病易感性亦有差別[7]。截止目前，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118和rs1801133與IS易感性的相關性少有充分研究。

在本研究中，通過檢測各200例的IS患者和對照者的2個MTHFR基因遺傳變異位點，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133與IS易感性具有相關性。相比MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133 CC基因型，TT基因型或者TT+ CT基因型顯著增加IS罹患風險；相比C等位基因型，T等位基因型亦顯著增加IS罹患風險。在最近一項由MAZDEH M等[5]開展的病例對照研究中，通過對來自伊朗的318例IS患者和400例對照者的rs1801133位點進行檢測分析后發(fā)現(xiàn)，rs1801133 TT基因型或者TT+ CT基因型相比CC基因型顯著增加伊朗人群罹患IS的風險，T等位基因型相比C等位基因型亦顯著增加伊朗人群罹患IS的風險。M’BAREK L等[6]通過對來自突尼斯的161例IS患者和114例對照者的rs1801133位點進行檢測分析后發(fā)現(xiàn)了相似的結果。這兩項在不同地區(qū)人群中開展的rs1801133與IS罹患風險相關性研究中得到的研究結果，與本研究的研究結果形成了相互驗證。National Center for Biotechnology Information中的信息(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)顯示，rs1801133位于MTHFR基因的蛋白編碼區(qū)，當rs1801133位點從C變成T時，其編碼的氨基酸從丙氨酸變成纈氨酸，過往研究顯示，氨基酸的改變可能會改變蛋白的空間結構，進而影響其功能[9-10]。Hcy是IS發(fā)生的一個重要因素，血液中高濃度的Hcy可以誘導血管內皮細胞的凋亡，導致動脈粥樣硬化，促進IS的發(fā)生[11-12]。如前所述，Hcy代謝同時也與MTHFR酶活性緊密相關[4]。研究表明，MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133 與Hcy血液水平顯著相關。ZHANG S Y等[13]通過分析875例冠心病患者和956例對照者的rs1801133基因型和等位基因型分布情況時發(fā)現(xiàn)，rs1801133 TT基因型個體血液中的Hcy水平顯著高于CC基因型個體。BAGHERI HAMIDI A等[14]在一項關于白癜風發(fā)病與rs1801133基因型分布關系的研究中也得到了類似的結果。而DU X X等[15]則在分析200例IS患者的rs1801133基因型和等位基因型分布情況時發(fā)現(xiàn)，rs1801133 TT基因型IS患者血液中的Hcy水平亦顯著高于CC基因型IS患者。由此可以初步推測， MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133基因型從C到T的改變可能影響了MTHFR蛋白的結構和活性，進而升高了血液中Hcy表達水平，最終促進了IS的發(fā)生。

在本研究中，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118基因型和等位基因型頻率在本研究IS患者和對照者中的分布差異無統(tǒng)計學意義。在一項探討rs9651118與嬰兒腦癱易感性相關性的研究中，HOU R Y等[16]調查了105例腦癱嬰兒和114例對照者rs9651118 位點基因型和分布情況，結果顯示，CC基因型相比TT基因型，C等位基因型相比T等位基因型顯著增加嬰兒腦癱發(fā)生的概率。LIN V C等[17]則在一項關于MTHFR基因遺傳變異在前列腺癌預后中作用的研究中發(fā)現(xiàn)，rs9651118 CC基因型患者相比TT基因型患者5年生存率顯著上升，癌旁組織中MTHFR表達水平相較癌組織顯著下降，而rs9651118 CC基因型患者血液中MTHFR表達水平相較TT基因型患者也顯著下降，rs9651118 CC基因型可能通過下調MTHFR表達水平，延長了前列腺患者的生存時間。在本研究中，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118與本研究人群IS易感性無顯著相關性。

綜上所述，MTHFR基因遺傳變異位點rs9651118與IS易感性無顯著相關性，但是rs1801133與IS易感性顯著相關。相比rs1801133 CC基因型，TT基因型或者TT+CT基因型顯著增加IS罹患風險；相比C等位基因型，T等位基因型亦顯著增加IS罹患風險。由于基因遺傳變異在不同人群中分布有差別，因此本研究的研究結果有待在世界上其它地區(qū)人群中開展的研究結果進一步驗證。此外，MTHFR基因遺傳變異位點rs1801133影響IS易感性分子機制目前尚未闡明，有待后續(xù)研究中進一步闡明。