張炳楊，逯素梅，馬萬山，3△

1.山東大學(xué)，山東濟(jì)南 250010；2.山東省千佛山醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250014；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250014

乙型肝炎(以下簡稱乙肝)流行范圍廣，嚴(yán)重危害國人健康。在發(fā)展中國家，乙型肝炎病毒(HBV)被認(rèn)為是導(dǎo)致肝硬化的主要原因[1]。采用干擾素(IFN)治療乙肝方法經(jīng)典，但是治療效果個(gè)體差異大[2]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，肥胖體質(zhì)的乙肝患者對(duì)IFN治療敏感性下降，深入研究其原因及機(jī)制意義重大。研究表明，肥胖體質(zhì)加劇了乙肝肝硬化的進(jìn)展[3-4]。肝臟常駐細(xì)胞(如庫普弗細(xì)胞等)和因損傷而被招募的細(xì)胞(如單核-巨噬細(xì)胞)都會(huì)發(fā)出促炎癥信號(hào)，包括(但不限于)細(xì)胞因子、趨化因子、脂質(zhì)信使和活性氧，可促使肝細(xì)胞的凋亡或壞死[5-7]。同時(shí)，垂死的肝細(xì)胞釋放出損傷相關(guān)的分子模式，與進(jìn)化保守的模式識(shí)別受體結(jié)合后，激活先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞，進(jìn)一步刺激炎癥反應(yīng)，建立一個(gè)高度肝臟毒性的炎癥和細(xì)胞死亡的前饋循環(huán)[8-9]。乙型肝炎病毒蛋白X(HBX)是HBV的一種調(diào)節(jié)蛋白，它激活Stat1，導(dǎo)致產(chǎn)生Ⅰ型IFN，表達(dá)HBX的肝細(xì)胞分泌的Ⅰ型IFN通過與同源的Ⅰ型IFN受體結(jié)合增強(qiáng)抗病毒信號(hào)[10-11]。慢性炎癥是肥胖患者體內(nèi)的狀態(tài)，白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、IFN等是最常見的炎癥因子[12-13]。本研究旨在探討肥胖導(dǎo)致乙肝患者IFN治療敏感性下降的機(jī)制與炎癥細(xì)胞因子的關(guān)系，為乙肝患者的個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017-2021年在山東省千佛山醫(yī)院診治的HBV感染且行IFN治療的患者91例為研究對(duì)象，其中男62例，女29例。根據(jù)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)將其分為對(duì)照組(BMI≤25 kg/m2，61例)和肥胖組(BMI≥28 kg/m2，30例)，跟蹤IFN治療48周，檢測(cè)谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和乙肝表面抗原(HBsAg)變化。收集該院健康查體人群(無基礎(chǔ)疾病，25人)血漿，根據(jù)BMI指數(shù)分為A組(BMI≤25 kg/m2)15人，B組(BMI≥28 kg/m2)10人，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子，篩選靶點(diǎn)。

乙肝患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)于該院就診的確診為HBV感染的成年門診和住院患者；(2)無重大遺傳性疾病家族史，未見同時(shí)患有其他感染性疾病或自身免疫性肝炎等。(3)治療期間無飲酒、輸血、懷孕、血色病等的發(fā)生。

1.2方法

1.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子 儀器為BD FACS CantoTMⅡ型，試劑盒為青島瑞斯凱爾生物科技有限公司生產(chǎn)的8種細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(多重微球流式免疫熒光發(fā)光法)。主要包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ。具體操作及分析步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人HBV基因組的HepG 2.2.15細(xì)胞，培養(yǎng)液為10%胎牛血清-DMEM，添加2 mmol/L谷氨酰胺，100 IU/mL青鏈霉素。接種24 h后按分組分別加入IFNα2b(500 IU/mL)，IL-2、IL-6、IL-10、IL-17(10 ng/mL)單獨(dú)及聯(lián)合作用于細(xì)胞3 d，更新培養(yǎng)基及對(duì)應(yīng)藥物后繼續(xù)作用3 d，收集細(xì)胞或上清液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)檢測(cè) 借助RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)，Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，以β-actin為內(nèi)參照基因，檢測(cè)JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2的蛋白表達(dá)水平，抗體均來自Cell Signaling Technology公司，使用濃度為1∶1 000。二抗為中杉金橋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，借助Nanodrop 2000檢測(cè)RNA的濃度和純度，基于cDNA合成試劑盒(thermo scientific，貨號(hào)k1622)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步借助SYRB(applied biosystems，貨號(hào)A25742)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。IFITM1上游引物為5′-CCAAGGTCCACCGTGATTAAC-3′,下游引物為5′-ACCAGTTCAAGAAGAGGGTGTT-3′；MX1上游引物為5′-GTTTCCGAAGTGGACATCGCA-3′，下游引物為5′-CTGCACAGGTTGTTCTCAGC-3′；OAS1上游引物為5′-TGTCCAAGGTGGTAAAGGGTG-3′，下游引物為5′-CCGGCGATTTAACTGATCCTG-3′；PKR上游引物為5′-GCCGCTAAACTTGCATATCTTCA-3′，下游引物為5′-TCACACGTAGTAGCAAAAGAACC-3′。

1.2.5生化及免疫指標(biāo)檢測(cè) ALT、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)均使用羅氏診斷公司生化分析儀及試劑盒分別通過比色法測(cè)定；HBsAg、乙型肝炎e抗原(HBeAg)使用希森美康HBsAg/HBeAg定量系統(tǒng)通過電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.2.6HBV-DNA檢測(cè) 通過羅氏Cobas AmpliPrep/cobas TaqMan48病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)，使用羅氏HBV核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，跟隨檢測(cè)質(zhì)控，質(zhì)控合格。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1RevMan軟件分析 綜合檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，將肥胖設(shè)為唯一影響因素，基于篩選出的文獻(xiàn)提取數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)分為乙肝治療有效組與乙肝治療無效組。采用RevMan軟件分析肥胖與乙肝治療的關(guān)系。

1.3.2IFN治療 臨床患者跟蹤IFN治療48周，統(tǒng)計(jì)其治療終點(diǎn)時(shí)的ALT、HBsAg等指標(biāo)差異，并繪制散點(diǎn)圖對(duì)其進(jìn)行分析，同時(shí)分析BMI與上述指標(biāo)的相關(guān)性，觀察肥胖對(duì)臨床IFN治療的效果影響。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù) 借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A組與B組主要差異的細(xì)胞因子，作為體外實(shí)驗(yàn)的切入點(diǎn)。

1.3.4體外細(xì)胞培養(yǎng) 收集上清液，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg、HbeAg水平，磁珠法檢測(cè)HBV-DNA。觀察不同藥物作用下，3種指標(biāo)變化趨勢(shì)，探索藥物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞系表觀的影響。

1.3.5JAK-STAT信號(hào)通路和抗病毒蛋白檢測(cè) 收細(xì)胞蛋白及RNA，Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2抗體；qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗病毒蛋白引物IFITM1、MX1、OAS1、PKR水平。

2 結(jié) 果

2.1RevMan軟件結(jié)果 結(jié)果顯示，乙肝治療有效組和乙肝治療無效組優(yōu)勢(shì)比為3.85(95%CI2.36～6.27)，提示肥胖是乙肝治療有效的不利因素。

2.2兩組ALT、HBsAg水平比較 對(duì)照組ALT水平為(43.54±20.37)U/mL，肥胖組ALT水平為(60.63±32.85)U/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組HBsAg水平為(2 977.90±1 412.57)IU/mL，肥胖組HBsAg水平為(3 024.43±1 586.76)IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為兩組ALT水平均值散點(diǎn)圖。B為兩組HBsAg水平均值散點(diǎn)圖。

2.3各組不同條件下各項(xiàng)指標(biāo)水平比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ水平在A組和B組中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平在B組中明顯升高(P<0.05)，有參考意義，作為研究切入點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2A。

分別以IL-2、IL-6、IL-10、IL-17作用于體外培養(yǎng)的人HepG2.2.15細(xì)胞后，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述4種IL單獨(dú)作用均能夠下調(diào)HbsAg水平，尤其是IL-2、IL-17下調(diào)作用明顯(P<0.05)，但是IL和IFN聯(lián)合作用未見明顯變化(P>0.05)；HbeAg、HBV-DNA水平較對(duì)照組均無明顯變化(P>0.05)。見圖2B。

注：A為A組、B組各項(xiàng)指標(biāo)水平比較；B為IL-2、IL-6、IL-10、IL-17對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平的影響。

2.4IL在IFNα2b作用下對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的影響 IL-2、IL-6、IL-10和IL-17均激活了JAK-STAT信號(hào)通路，使JAK1、STAT1、STAT2發(fā)生不同程度的磷酸化。其中IL-6、IL-10降低JAK1-STAT磷酸化的程度尤其明顯。見圖3。

圖3 IL在IFNα2b作用下對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的影響

2.5IL促進(jìn)抗病毒蛋白IFITM1、MX1、OAS1、PKR的表達(dá) qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN單獨(dú)作用下，抗病毒蛋白IFITM1、MX1、OAS1、PKR水平升高，與IL共同作用下上述指標(biāo)水平升高更加明顯(P<0.05)。見圖4。

圖4 IL促進(jìn)抗病毒蛋白IFITM1、 MX1、 OAS1、PKR的表達(dá)

3 討 論

本研究追蹤臨床乙肝患者IFN治療48周后主要指標(biāo)變化，并結(jié)合臨床，通過查閱、分析文獻(xiàn)等方式，發(fā)現(xiàn)肥胖是影響乙肝患者治療效果的因素之一，肥胖導(dǎo)致乙肝患者IFN治療敏感性下降。通過流式細(xì)胞術(shù)篩查BMI≥28 kg/m2與BMI≤25 kg/m2個(gè)體之間的炎癥細(xì)胞因子差異，以有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平為切入點(diǎn)，作用于體外培養(yǎng)的肝HepG 2.2.15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)4種IL能夠激活JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)抗病毒蛋白表達(dá)。因此，肥胖抑制IFN抗乙肝治療的效果不是與炎癥因子水平升高直接相關(guān)。推測(cè)炎癥與免疫的相互作用是主要分子機(jī)制，也是課題組下一步研究的重心。

本研究Western-blot結(jié)果驗(yàn)證了JAK-STAT信號(hào)通路的激活，這與已有研究一致[14-15]。急性期蛋白IL-6最近被認(rèn)為在肝癌發(fā)生中發(fā)揮了突出作用，激活caspase-8形成“壞死體”，誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死的發(fā)生[16-17]。有研究表明，IL-10/HBV-DNA被認(rèn)為是預(yù)測(cè)IFN-α治療反應(yīng)譜的有用指標(biāo)[18]。血清IL-10水平可能反映了宿主免疫激活的情況[19-21]。在本研究中，筆者以IL-2、IL-6、IL-10、IL-17這些炎癥因子為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)肥胖體質(zhì)導(dǎo)致上述指標(biāo)水平升高，促進(jìn)IFN抗病毒。但是本研究是體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，脫離了體內(nèi)免疫系統(tǒng)，不排除IL影響機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)控IFN抗病毒過程。

本研究采用了多種數(shù)據(jù)分析方式和研究手段，探索回顧IFN治療乙肝的分子生物學(xué)機(jī)制，通過臨床試驗(yàn)與基礎(chǔ)研究相結(jié)合，綜合流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為豐富。但是數(shù)據(jù)分析過程中，細(xì)胞上清液檢測(cè)數(shù)據(jù)不甚理想，考慮與藥物作用時(shí)間過短有關(guān)。單純體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示IL促進(jìn)IFN抗病毒，分析其原因與炎癥和免疫系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系密切相關(guān)，獨(dú)立因素下的研究不能反映機(jī)體實(shí)際情況。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，聚焦炎癥和免疫系統(tǒng)相互作用，尋找肥胖抑制IFN抗乙肝治療的機(jī)制是下一步的重點(diǎn)方向。

綜上所述，肥胖降低了乙肝患者IFN治療的敏感性，并導(dǎo)致體內(nèi)IL-2、IL-6、IL-10及IL-17水平不同程度升高。單純的IL具有抗炎作用，促進(jìn)IFN抗乙肝。但是在免疫系統(tǒng)共存的個(gè)體內(nèi)，推測(cè)肥胖致IFN治療敏感性下降與炎癥和免疫系統(tǒng)的復(fù)雜關(guān)系有關(guān)，課題組將繼續(xù)深入研究。