劉吉英，羅剛，司徒旭祺，李木旺

（江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018）

MORC2（Microrchidia Family CW-type Zinc Finger 2，ZCWCC1）蛋白是MORC 蛋白家族的一員，是新的表觀調(diào)控蛋白，在植物、線蟲、哺乳動物不同發(fā)育階段起到重要作用。MORC2 蛋白主要包括氨基（N）端高度保守的GHKL 型-ATP 酶結(jié)構(gòu)域、CC 結(jié)構(gòu)域、CW 鋅指結(jié)構(gòu)域。是腓骨肌萎縮癥新致病基因。越來越多的研究表明，MORC2 蛋白作為新表觀遺傳調(diào)控蛋白是細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等過程中重要的調(diào)控因子。MORC2 主要通過識別組蛋白修飾或與組蛋白修飾酶相互作用或甲基化修飾影響細(xì)胞增殖與存活。同時，MORC2 作為染色質(zhì)重塑蛋白，主要參與DNA 依賴的ATP 酶活性調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑，促進(jìn)DNA 雙鏈斷裂修復(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡。MORC2 通過促進(jìn)組蛋白H2AX 磷酸化，促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)進(jìn)而影響細(xì)胞存活。除此之外，MORC2 還可以與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）形成復(fù)合體，使其靶基因DNA 超甲基化，或者作為轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合在基因的啟動子區(qū)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，最終影響細(xì)胞存活。由此可見，MORC2 作為表觀遺傳因子調(diào)控基因表達(dá)的方式有多種。目前關(guān)于基因的研究處于起始階段，基因的功能、表達(dá)調(diào)控和作用機制目前研究還不透徹。

在睪丸和卵巢中均高表達(dá)，小鼠同源基因MORC2b 被報道為PRDM9 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶點。PRDM9 是一種組蛋白H3 三甲基轉(zhuǎn)移酶，是減數(shù)分裂過程中必需的，PRDM9 通過MORC2 參與調(diào)控生殖細(xì)胞的形成。MORC2b 失活導(dǎo)致包括減數(shù)分裂特異性基因在內(nèi)的許多基因的錯誤表達(dá)。敲除的成年小鼠的卵巢組織中沒有成熟的卵泡，雌性敲除小鼠生殖功能喪失?？梢姡蚩赡軈⑴c了卵巢發(fā)育過程調(diào)控，但是基因在大型家畜例如豬的卵巢發(fā)育過程中的功能未知。本研究通過克隆測序技術(shù)獲得豬基因啟動子區(qū)序列，通過構(gòu)建啟動子區(qū)雙熒光素酶缺失載體鑒定豬基因的核心啟動子區(qū)，通過生物信息學(xué)軟件分析豬啟動子區(qū)序列特征，預(yù)測與卵巢發(fā)育和卵泡閉鎖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，以期為研究豬基因的表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 KOD OnePCR Master Mix（KMM-201，TOBOYO）購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶I、I、T4 DNA 連接酶購自TAKARA 公司；DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒pRLTK、pGL3-basic 購自生物工程（上海）股份有限公司；DH5感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（T101-01）和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（DL101-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。胎牛血清（Gibco）、0.25%胰蛋白酶、雙抗（青鏈霉素）、DMEM（11995）、DMEM/F12 均購于Therom Fisher Science，人胚腎細(xì)胞（293T）由實驗室保存。

1.2 豬基因5' 調(diào)控區(qū)片段擴(kuò)增及生物學(xué)分析 屠宰場取豬卵巢迅速放入液氮保存，利用DNA 提取試劑盒提取豬的基因組DNA。根據(jù)豬基因（NC_010456.5）序列，取ATG 前1 936 bp 序列作為模板設(shè)計引物。利用生物學(xué)分析軟件對核心啟動子區(qū)進(jìn)行預(yù)測與分析。使用Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）、PromoterScan（http://wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）、Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=index&group=programs&subgroup=promoter）、BDGP（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）等軟件對基因進(jìn)行啟動子分析；用CpGFinder 對目的基因可能含有的CpG 島進(jìn)行分析；PROMO（http://alggen.lsi.upc.es/cgibin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）和JASPAR（http://jaspar.genereg.net/ ）等對啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測分析。

1.3 雙熒光素酶缺失載體構(gòu)建和鑒定 根據(jù)核心啟動子預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果，利用Primer 5 設(shè)計引物，共設(shè)計6 條上游引物，下游引物相同，為pMORC2-R，上下游引物的5'端分別加入I、I 酶切位點（引物設(shè)計信息見表1）。PCR 片段使用東洋紡高保真酶KMM-201 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系為50 μL：1 μL KMM-201高保真酶，上下游引物各15 pmol，DNA 模板200 ng，補ddHO 至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98℃ 10 s；98℃10 s，68℃ 20 s，共40 個循環(huán)；72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，雙酶切，酶切產(chǎn)物用DNA 產(chǎn)物純化試劑盒純化后利用T4 DNA 連接酶連接到pGL3-Basic 載體上，重組質(zhì)粒經(jīng)I、I 雙酶切鑒定后送杭州尚亞生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與模板DNA 比對后確定載體構(gòu)建是否成功。

表1 引物信息

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將生長狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞（培養(yǎng)基含10% FBS+90% DMEM）匯合至80% 左右時接種于24 孔板，置于37℃、5% 的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。屠宰場取豬卵巢，置于37℃生理鹽水中，并在2 h 內(nèi)運回實驗室，用含2%雙抗的PBS 沖洗3 次，并用酒精棉擦拭卵巢表面避免污染。用10 mL 注射器抽取卵泡液，800 g 離心5 min。棄上清，收集細(xì)胞，用含1% 雙抗的PBS 洗2 次，離心棄上清。將細(xì)胞接種在24 孔板（培養(yǎng)基為10%FBS+90% DMEM/F12），待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性測定 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取無內(nèi)毒質(zhì)粒。利用轉(zhuǎn)染試劑ExFect Transfection Reagent 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，pGL3-Basic 為對照組，pRL-TK 為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后24 h，收集細(xì)胞裂解液。根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說明書檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性值，通過計算比值獲得相對熒光素酶活性值，確定豬基因核心啟動子區(qū)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 相對熒光素酶活性數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行檢驗分析。其中<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 豬基因5' 調(diào)控區(qū)擴(kuò)增 以豬的基因組DNA 為模板，使用引物P1（表1）擴(kuò)增豬基因ATG 前1 936 bp 序列，擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1 所示，經(jīng)測序比對發(fā)現(xiàn)與引物源序列一致性為99.73 %，說明成功擴(kuò)增出豬基因5'調(diào)控區(qū)。

圖1 豬MORC2 基因5'調(diào)控區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 構(gòu)建豬基因5'調(diào)控區(qū)雙熒光素酶缺失載體根據(jù)在線啟動子預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果構(gòu)建豬基因啟動子區(qū)不同片段熒光素酶報告載體（圖2A），分別命名為pMORC2-630（-1～-630）、pMORC2-1075（-1～-1 075）、pMORC2-1207（-1～-1 207）、pMORC2-1347（-1～-1 347）、pMORC2-1479（-1～-1 479）、pMORC2-1936（-1～-1 936）。利用表1 中的引物擴(kuò)增豬基因啟動子區(qū)不同長度片段，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2B 所示。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接到pGL3-Basic 載體上，經(jīng)酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2C 所示。構(gòu)建好的載體經(jīng)測序比對確定插入序列的序列正確，說明成功構(gòu)建豬基因5' 調(diào)控區(qū)雙熒光素酶缺失載體。

圖2 豬MORC2 基因啟動子區(qū)雙熒光素酶缺失載體構(gòu)建、擴(kuò)增及雙酶切鑒定

2.3 豬基因核心啟動子區(qū)鑒定 將以上構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T 和豬卵泡顆粒細(xì)胞，PRL-TK 為內(nèi)參質(zhì)粒，pGL3-Basic 為對照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞裂解液進(jìn)行雙熒光素酶活性分析，結(jié)果如圖3 所示。圖3A 為轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后的相對熒光素酶活性，圖3B 為轉(zhuǎn)染豬卵泡顆粒細(xì)胞后的相對熒光素酶活性。結(jié)果顯示，在2 種細(xì)胞中基因啟動子的活性趨勢基本相同，pMORC2-1347、pMORC2-1479 和pMORC2-1936 相對熒光素酶活性均極顯著高于pGL3-Basic，說明豬基因-1207～-1347 含有MORC2啟動子重要的正調(diào)控元件，是豬基因的核心啟動子區(qū)。另外，pMORC2-1936 片段的熒光素酶活性與核心啟動子區(qū)相比有所下降，表明該區(qū)域（-1479～-1936）可能含有基因的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件。

圖3 豬MORC2 基因核心啟動子鑒定

2.4 豬基因核心啟動子區(qū)CpG 島和調(diào)控元件分析 經(jīng)在線網(wǎng)站預(yù)測，發(fā)現(xiàn)豬基因啟動子區(qū)存在1 個CpG 島，長度為1 152 bp，位于-682～-1834，如圖4 所示，表明基因表達(dá)可能受甲基化影響。該CpG 島與豬核心啟動子區(qū)有重疊，并且在豬基因核心啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了TATA-box、E-box、GC-box、SP1 和NF1 等多個調(diào)控元件，如圖5 所示，更加確定該區(qū)域是豬基因的核心啟動子區(qū)。

圖4 豬MORC2 基因5'調(diào)控區(qū)CpG 島預(yù)測結(jié)果

圖5 豬MORC2 基因5'調(diào)控區(qū)核苷酸序列

2.5 豬啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 利用在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件分析豬基因啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)存在110 種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。其中與卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子FOXO1、YY1、SMAD4 和E2F1 等在豬基因啟動子區(qū)有潛在的結(jié)合位點，如表2 所示。這些結(jié)合位點的核苷酸序列在不同物種間高度保守，提示基因可能參與了豬的卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能調(diào)控。

表2 豬MORC2 基因啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果

3 討 論

卵巢發(fā)育和卵泡閉鎖是影響母豬繁殖力的重要因素，卵泡顆粒細(xì)胞在卵巢發(fā)育和排卵過程中起到重要作用，研究與卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控有利于揭示豬的繁殖性狀相關(guān)機制。MORC2屬于MORC 家族蛋白，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控以及DNA 損傷修復(fù)。目前研究最多的是在癌癥中的調(diào)控，該基因在胃癌和乳腺癌等多種癌癥中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的調(diào)控。核定位顯示MORC2 主要集中在細(xì)胞核中，也暗示了基因功能與基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。目前關(guān)于基因與哺乳動物繁殖力相關(guān)的研究很少，僅在小鼠中有研究。基因敲除小鼠的卵巢不能形成成熟的卵泡，并且卵母細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明基因是卵巢發(fā)育所必須的，但其調(diào)控機制尚不清楚。為了研究基因與卵巢發(fā)育和卵泡閉鎖的關(guān)系，本研究鑒定出基因5'調(diào)控區(qū)核心啟動子區(qū)位置，為今后研究該基因表達(dá)調(diào)控機制提供參考依據(jù)。

預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)在基因的5' 調(diào)控區(qū)含有多個與卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如FOXO1、YY1、SMAD4 和E2F1 等。FOXO1 轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖，從而降低產(chǎn)仔數(shù)。氧化應(yīng)激上調(diào)FOXO1 導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡，最終引起小鼠卵泡發(fā)生閉鎖。FSHFOXO1 信號通路通過抑制自噬來防御顆粒細(xì)胞氧化損傷，有證據(jù)表明磷酸化的MORC2 減少了與熱休克蛋白家族A 成員8（HSPA8）和溶酶體相關(guān)膜蛋白2A（LAMP2A）的相互作用，從而保護(hù)MORC2 免受分子伴侶介導(dǎo)的溶酶體的降解。本研究發(fā)現(xiàn)豬是FOXO1 潛在的作用靶基因，F(xiàn)OXO1 可能通過調(diào)控MORC2 進(jìn)而調(diào)控豬的卵泡閉鎖。YY1 作為轉(zhuǎn)錄因子參與了多種基因激活或沉默的調(diào)控，研究已經(jīng)證實YY1 參與了小鼠卵泡發(fā)育和卵巢功能，是卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞通信所必須的。YY1 還可以直接與長鏈非編碼RNA X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄物（long non-coding RNA X-inactive-specific transcript，lncRNA Xist）啟動子結(jié)合，促進(jìn)在圍產(chǎn)期小鼠卵巢中的表達(dá)。YY1 可以顯著提高FSHR 核心啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)FSH的傳導(dǎo)。SMAD4 是轉(zhuǎn)化生長因子信號通路的核心分子，與哺乳動物生殖能力和卵泡發(fā)育密切相關(guān)，TGF-/SMAD 信號通路通過與miR-183-96-182 簇/FOXO1 抑制顆粒細(xì)胞凋亡。研究者前期發(fā)現(xiàn)SMAD4 參與TGF-/SMAD 信號通路對豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控。MORC2 調(diào)控線粒體凋亡途徑可能是p53 依賴的方式，其調(diào)控異常也導(dǎo)致Hippo 途徑的異常激活，表明MORC2 是重要的凋亡調(diào)控蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)基因可能作為新的調(diào)控因子參與豬卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)控，后續(xù)將對該假設(shè)進(jìn)行驗證。E2F1 是E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Retinoblastoma，Rb）的下游效應(yīng)因子，調(diào)控DNA合成和復(fù)制在內(nèi)的多種細(xì)胞學(xué)行為?；蚯贸商岣邌幼拥幕钚?，調(diào)控豬顆粒細(xì)胞的生長和雌二醇的合成，進(jìn)而參與卵泡發(fā)育。MORC2作為重要的細(xì)胞增殖因子促進(jìn)多種細(xì)胞癌增殖，在正常細(xì)胞中的研究比較少，在C2C12 細(xì)胞中MORC2 通過抑制細(xì)胞分化維持細(xì)胞周期。鑒于是細(xì)胞增殖與凋亡重要的調(diào)控基因，研究豬基因表達(dá)調(diào)控有利于研究豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)在基因的5'調(diào)控區(qū)含有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，進(jìn)一步提示可能參與了卵巢發(fā)育或顆粒細(xì)胞功能的調(diào)控。本研究獲得了基因的核心啟動子區(qū)，后續(xù)將著重研究這些轉(zhuǎn)錄因子通過MORC2 調(diào)控豬卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能的機制。

4 結(jié) 論

本研究利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定了豬基因的核心啟動子區(qū)（-1207～-1347），并發(fā)現(xiàn)在該基因的5'調(diào)控區(qū)含有CpG 島，以及與卵巢發(fā)育和顆粒細(xì)胞功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。上述研究為解析豬基因在卵巢發(fā)育和卵泡閉鎖中的功能提供理論依據(jù)。