王余北，肖蓮梅，何帥涵，孫厚偉，朱紹偉，李肖，產(chǎn)舒恒，郭雷，李久慶，方美英*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.山東福藤食品有限公司，山東滕州 277599；3.滕州市畜牧漁業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，山東滕州 277599；4.棗莊市畜牧漁業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，山東棗莊 277000）

棗莊黑蓋豬是我國(guó)優(yōu)良的華北型地方豬種，蘊(yùn)含獨(dú)特的種質(zhì)基因，是我國(guó)寶貴的遺傳資源。但隨著外來(lái)商業(yè)豬種的引入，棗莊黑蓋豬的養(yǎng)殖數(shù)量越來(lái)越少，以至于到90 年代末，棗莊黑蓋豬只零星散見于山東部分偏僻村莊中。2004 年在山東省相關(guān)部門、企業(yè)與科研單位的支持下，山東福藤食品有限公司著手開展棗莊黑蓋豬的保種工作，對(duì)其進(jìn)行了搶救性保護(hù)與提純復(fù)壯。但在開展實(shí)際工作的過(guò)程中遇到了2 個(gè)方面問(wèn)題：一方面，由于棗莊黑蓋豬最初的核心群主要從一些散在農(nóng)戶手中購(gòu)買，具體遺傳背景未知，給配種計(jì)劃的安排帶來(lái)不少困難；另一方面，傳統(tǒng)的畜禽遺傳學(xué)研究中，遺傳參數(shù)評(píng)估主要依賴于育種過(guò)程中的表型數(shù)據(jù)與系譜記錄，而棗莊黑蓋豬育種工作開展時(shí)間短，再加上實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中常發(fā)生系譜記錄與表型數(shù)據(jù)錯(cuò)誤、缺失等情況，難以通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法對(duì)棗莊黑蓋豬群體進(jìn)行遺傳參數(shù)評(píng)估。因此，從分子層面研究棗莊黑蓋豬的群體遺傳結(jié)構(gòu)，明確群體遺傳背景，對(duì)于棗莊黑蓋豬遺傳資源的保護(hù)和發(fā)掘利用具有重要意義。

近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，在豬、雞等畜禽中均推出高效的商業(yè)化SNP 芯片。SNP 芯片具有密度高、分型準(zhǔn)確性高、可自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)藥、生物、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的全基因組研究中被充分利用。目前利用SNP 標(biāo)記分析群體遺傳結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)方法較為成熟，使得分析未知遺傳背景群體的遺傳結(jié)構(gòu)成為了可能。本研究使用豬全基因組SNP 芯片對(duì)棗莊黑蓋豬核心群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，為群體的種質(zhì)資源保護(hù)與發(fā)掘利用工作提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)樣本采集于山東省福藤食品有限公司棗莊黑蓋豬原種豬場(chǎng)，所用芯片為紐勤生物科技（上海）有限公司的50K SNP 芯片。本研究共采集200 頭棗莊黑蓋豬核心群，其中公豬12 頭，母豬188 頭。采樣部位為耳組織，用消毒的耳號(hào)鉗剪下少許耳組織放入5 mL 離心管中后，迅速放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因型測(cè)定 所有組織樣品均浸泡在75% 的酒精中，經(jīng)沖洗晾干，進(jìn)行DNA 提取并質(zhì)控后，使用NEOGEN GGP-Porcine 50K 芯片進(jìn)行基因分型。

1.3 SNP 質(zhì)量控制 使用PLINKv1.90 軟件對(duì)檢測(cè)到的SNP 進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控條件為：①刪除檢出率低于90% 的SNP 標(biāo)記（PLINK 參數(shù)：--geno 0.1）；②刪除基因型缺失率高于10% 的個(gè)體（PLINK 參數(shù)：--mind 0.1）；③刪除次等位基因頻率（Minor Allele Frequency,MAF）小 于5% 的SNP標(biāo)記（PLINK 參數(shù)：--maf 0.05）；④刪除性染色體上的位點(diǎn)（PLINK參數(shù)：--chr 0-18）。后續(xù)使用質(zhì)控后的SNP 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SNP 質(zhì)量控制 本研究使用NEOGEN 公司的GGP-Porcine 50K 芯片對(duì)棗莊黑蓋豬基因組SNP 進(jìn)行基因分型，芯片上共檢測(cè)到50 697 個(gè)SNP 位點(diǎn)，刪除位于性染色體上的位點(diǎn)后剩余48 228 個(gè)位點(diǎn)，其中檢出率低于90%的SNP 標(biāo)記有367 個(gè)，次等位基因頻率小于5% 的SNP 標(biāo)記有3 691 個(gè)，整體質(zhì)控后共剩余44 170 個(gè)SNP 標(biāo)記用于后續(xù)分析。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)與相關(guān)遺傳參數(shù)分析 為研究棗莊黑蓋豬的群體遺傳結(jié)構(gòu)，首先使用質(zhì)控后的200 頭棗莊黑蓋豬群體的SNP 數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹分析，圖1 為使用最大似然法（ML）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹，圖中最外圈個(gè)體名帶黑點(diǎn)為公豬個(gè)體，其余為母豬個(gè)體。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生樹和KING 軟件對(duì)公豬血統(tǒng)的推斷結(jié)果，將棗莊黑蓋豬12 頭公豬確定為6 個(gè)血統(tǒng)，各血統(tǒng)內(nèi)公豬信息如表1 所示。

表1 棗莊黑蓋豬公豬血統(tǒng)表

結(jié)合公豬血統(tǒng)信息與系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）結(jié)果，將188 頭母豬劃分進(jìn)6 個(gè)公豬血統(tǒng)中，形成6 個(gè)母豬家系，圖中最外圈分別用數(shù)字1～6 來(lái)表示各血統(tǒng)/家系。圖2為結(jié)合血統(tǒng)與家系信息使用PLINK 軟件進(jìn)行的群體主成分分析，并使用R 繪制第一主成分和第二主成分的分析圖，其中不同血統(tǒng)/家系個(gè)體用不同的形狀代表，主成分分析中可看出棗莊黑蓋豬群體雖然在圖中的分布并不均勻，但大部分同血統(tǒng)/家系內(nèi)的樣本聚在一起，說(shuō)明同血統(tǒng)/家系內(nèi)的個(gè)體關(guān)系更近，血統(tǒng)與家系的劃分較合適。

圖1 棗莊黑蓋豬群體系統(tǒng)發(fā)生樹

圖2 棗莊蓋豬各血統(tǒng)/家系主成分分析（PCA）

為了對(duì)群體中的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，研究使用群體基因組血緣同源（IBD）信息進(jìn)行分析，群體內(nèi)200 個(gè)個(gè)體共產(chǎn)生19 900 個(gè)關(guān)系對(duì)，其分析結(jié)果表明群體平均親緣系數(shù)為0.089 0±0.109 6，其中90.95%的個(gè)體對(duì)間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（親緣系數(shù)<0.25），7.89% 的個(gè)體對(duì)間親緣關(guān)系較近（親緣系數(shù)0.25～0.50），其余1.16%的個(gè)體對(duì)間親緣關(guān)系很近（親緣系數(shù)>0.25）。各家系的平均親緣系數(shù)如表2 所示。

研究使用PLINK 軟件與R 包detectRUNS 對(duì)棗莊黑蓋豬群體的雜合度與近交系數(shù)等遺傳參數(shù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明棗莊黑蓋豬群體的平均觀測(cè)雜合率為0.389 0，平均期望雜合率為0.378 9，平均近交系數(shù)為0.111 7±0.072 3。其中各家系平均近交系數(shù)如表2 所示。

表2 棗莊黑蓋豬不同家系親緣系數(shù)與近交系數(shù)

3 討 論

本研究使用棗莊黑蓋豬的基因組信息對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹、主成分分析和群體IBD 等系統(tǒng)分析。系統(tǒng)發(fā)生樹是一種被認(rèn)為具有共同祖先的各物種間演化關(guān)系的樹狀圖，是一種親緣分支分類方法。本研究中由系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果可以看出棗莊黑蓋豬群體在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚合成幾個(gè)獨(dú)立的大分支，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果和群體親緣關(guān)系推斷結(jié)果將棗莊黑蓋豬公豬群體分為6 個(gè)血統(tǒng)，并進(jìn)一步將母豬群體劃分進(jìn)這6 個(gè)公豬血統(tǒng)中。根據(jù)血統(tǒng)與家系信息，進(jìn)一步對(duì)棗莊黑蓋豬群體進(jìn)行了主成分分析，主成分分析中棗莊黑蓋豬群體雖然分布并不均勻，但大多數(shù)同血統(tǒng)/家系內(nèi)的樣本聚在一起，說(shuō)明同血統(tǒng)/家系內(nèi)的個(gè)體關(guān)系更近，證明研究對(duì)棗莊黑蓋豬群體血統(tǒng)與家系的劃分較合適，可為后續(xù)育種工作提供研究基礎(chǔ)，而有些樣本在圖中分布較散可能是在其他主成分上密集分布。本研究使用群體IBD 信息進(jìn)行了棗莊黑蓋豬的親緣系數(shù)估計(jì)，與王繼英等人在2019 年分析的結(jié)果相比，本研究中棗莊黑蓋豬群體的平均親緣系數(shù)有一定程度的降低，說(shuō)明近幾年棗莊黑蓋豬群體在配種時(shí)已注意選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的個(gè)體進(jìn)行交配，避免了近交衰退的發(fā)生。綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)雖然棗莊黑蓋豬群體的親緣系數(shù)不高，處于較低水平，且與幾年前相比親緣系數(shù)已有所下降，但家系內(nèi)的親緣系數(shù)仍相對(duì)較高，因此在后續(xù)選配工作中應(yīng)繼續(xù)盡量避免同一血統(tǒng)公豬與同一家系母豬個(gè)體交配，以避免群體近交系數(shù)過(guò)快增長(zhǎng)，造成群體近交衰退的發(fā)生。

群體雜合度是評(píng)估一個(gè)群體遺傳多樣性的關(guān)鍵指標(biāo)，觀測(cè)雜合度是指在這個(gè)群體內(nèi)實(shí)際觀測(cè)到的雜合個(gè)體數(shù)占樣本總體的比例，期望雜合度是指樣本中任意一個(gè)個(gè)體某一位點(diǎn)雜合的期望概率，群體雜合度可以反映一個(gè)群體的遺傳多樣性，本研究中棗莊黑蓋豬群體的平均觀測(cè)雜合度為0.389 0，平均期望雜合度為0.378 9，群體平均觀測(cè)雜合度高于平均期望雜合度，一方面說(shuō)明棗莊黑蓋豬品種在形成過(guò)程中可能在一定程度上混入了其他品種豬的血統(tǒng)，另一方面也說(shuō)明棗莊黑蓋豬群體內(nèi)遺傳多樣性較高，具有較高的純化選育潛力。

近交是指由較近親緣關(guān)系個(gè)體進(jìn)行交配，而近交程度的升高會(huì)使基因組上有害基因純合子增多，產(chǎn)生近交衰退而降低生產(chǎn)性能。目前有研究表明根據(jù)ROH片段可以對(duì)個(gè)體的近交系數(shù)進(jìn)行有效評(píng)估，且基于ROH 計(jì)算的近交系數(shù)是更準(zhǔn)確評(píng)估個(gè)體近交水平的一種方法。本研究中使用ROH 計(jì)算了棗莊黑蓋豬群體的近交系數(shù)，群體平均近交系數(shù)為0.111 7±0.072 3，與其他同樣使用ROH 來(lái)評(píng)估近交系數(shù)的豬種相比，棗莊黑蓋豬的近交系數(shù)低于梅山豬、沙烏頭豬、法系大白豬、加系大白豬，略高于楓涇豬。整體來(lái)看，棗莊黑蓋豬群體的近交系數(shù)處于較低水平，說(shuō)明近些年該群體存在較低程度的近交，表明在棗莊黑蓋豬的選育工作中未進(jìn)行近交改良或較大程度的人工干預(yù)，群體遺傳多樣性良好，具有后續(xù)進(jìn)行分子選育的良好基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究基于豬50K SNP 芯片信息對(duì)棗莊黑蓋豬200 頭核心群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。研究表明棗莊黑蓋豬公豬群體可分為6 個(gè)血統(tǒng)，群體親緣系數(shù)與近交系數(shù)均處于較低水平，群體的平均觀測(cè)雜合度高于平均期望雜合度，具有較高的遺傳多樣性，但家系內(nèi)親緣系數(shù)要高于群體親緣系數(shù)，在選配時(shí)應(yīng)盡量避免同一血統(tǒng)公豬與同一家系母豬交配。本研究從分子層面揭示了棗莊黑蓋豬的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，可為后續(xù)的種群保種及選育利用工作提供基礎(chǔ)。