周振杰，王冬梅，歐陽松應(yīng),2

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350117)

2019年末爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎，COVID-19)對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，截至2022年6月12日，全球新冠肺炎患者數(shù)量已超過5.4億人，累計死亡人數(shù)已超過633萬人.隨著新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)變異株(例如Alpha、Beta和Delta等)，特別是Omicron新型變異毒株的出現(xiàn)，全球新冠新增確診病例數(shù)量經(jīng)歷了多次起伏，一直未能得到完全控制[1].防止SARS-CoV-2傳播的最重要對策是及早識別、隔離和監(jiān)測患者.現(xiàn)階段我國采用“抗原+核酸”組合檢測，抗原檢測用于居家自測和更快速的初篩，但其靈敏度低并會出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險；核酸檢測即實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測限低、特異性強(qiáng)，但其依賴于先進(jìn)設(shè)備分析和專業(yè)人員操作，擴(kuò)增耗時長，限制了其現(xiàn)場即時診斷(point-of-care testing，POCT)的能力.新興的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)具有替代常規(guī)qPCR的潛力，已經(jīng)以各種形式應(yīng)用于SARS-CoV-2檢測，最低檢測限可達(dá)1～10 copies/反應(yīng)，比傳統(tǒng)的RT-PCR方法靈敏度高約100倍[2]，由于LAMP容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生錯誤的結(jié)果[3]，研究人員根據(jù)實(shí)際檢測SARS-CoV-2需求對該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，主要集中在增強(qiáng)特異性、提高反應(yīng)速率、簡化樣本處理、實(shí)現(xiàn)多重擴(kuò)增以及應(yīng)用于現(xiàn)場檢測平臺等方面[4].本文回顧了近年應(yīng)用于檢測SARS-CoV-2的LAMP技術(shù)，同時總結(jié)了新型LAMP檢測技術(shù)在簡單化、快速化、特異化和產(chǎn)物檢測等方面取得的進(jìn)展.

1 LAMP的基本原理及檢測流程

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增是Notomi等[5]在2000年首次提出的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)通過設(shè)計2對引物(內(nèi)引物FIP與BIP，外引物F3與B3)特異性識別靶序列6個不同區(qū)域，同時設(shè)計1對環(huán)引物(LF與LB)增加反應(yīng)速度(引物結(jié)構(gòu)見圖1)，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在60～65 ℃恒溫條件下反應(yīng)15～60 min可特異、快速、高效完成核酸擴(kuò)增.LAMP反應(yīng)成功的關(guān)鍵是引物設(shè)計，需要注意的是內(nèi)引物(FIP和BIP)會自行折疊，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；大量的引物(通常為6條)可能形成引物二聚體，這些交互作用容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[6].現(xiàn)在LAMP引物設(shè)計通常采用在線程序Primer Explore(http：∥primerexplorer.jp/)，導(dǎo)入靶基因自動生成引物，之后LAMP引物通過一系列因素進(jìn)行優(yōu)化，例如Tm值、引物末端的穩(wěn)定性、G+C含量和引物之間的距離等.

圖1 LAMP引物結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 LAMP primer structure[7]

LAMP檢測較其他核酸診斷方法的最大優(yōu)勢在于操作流程簡單，對儀器設(shè)備和人員要求低.LAMP檢測步驟(見圖2)包括：(1)標(biāo)本采集：核酸檢測流程的第一步，標(biāo)本放入樣本保存管中，其保存液具有滅活病毒的作用；(2)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)：標(biāo)本在嚴(yán)密包裝下護(hù)送到實(shí)驗(yàn)室；(3)提取核酸：專業(yè)技術(shù)人員提取病毒樣本的核酸；(4)配制試劑、加樣：將反應(yīng)液、酶、引物和模板按照規(guī)定的量制備；(5)LAMP擴(kuò)增：置于水浴鍋或恒溫設(shè)備中進(jìn)行反應(yīng)，在1 h內(nèi)即可完成擴(kuò)增；(6)結(jié)果輸出：檢測人員對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，排除假陰性和假陽性可能，及時對異常結(jié)果樣本進(jìn)行復(fù)核.結(jié)果判讀方法多種多樣，包括電泳法、比色法、側(cè)流層析法、實(shí)時監(jiān)測、微流控技術(shù)和電化學(xué)傳感器等技術(shù).

圖2 LAMP檢測流程圖Fig.2 LAMP detection flowchart

2 LAMP檢測SARS-CoV-2靶基因的方式

2.1 單基因LAMP

SARS-CoV-2基因組全長大約30 Kb，兩端為非編碼區(qū)域，中間是非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū).非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列保守包括5’端開放閱讀框(open reading frame，ORF)ORF1a/b，占全基因組的67%，主要編碼16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，Nsp)，而結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)依次編碼刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)[8-9].N基因是LAMP 檢測SARS-CoV-2最常用的靶基因，N蛋白的序列高度保守，在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用.Dong等[10]對19組RT-LAMP引物進(jìn)行比較評價，這些引物組在SARS-CoV-2的基因組中的分布包括2組與Nsp3結(jié)合、5組與RdRp結(jié)合、2組與E基因結(jié)合、6組與N基因結(jié)合，這些區(qū)域高度保守，另外4組引物分別位于Nsp1、Nsp3和S基因的基因組區(qū)域.而基于N基因的RT-LAMP方法擴(kuò)增速度最快，并且比基于其他基因的檢測更靈敏，最低檢測限可達(dá)1 copies/反應(yīng).

2.2 多重LAMP

多重環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(multiplex LAMP，mLAMP)可實(shí)現(xiàn)同時檢測多重基因的需求.SARS-CoV-2感染的早期臨床特征類似于常見呼吸道病毒的感染，如流感病毒和軍團(tuán)菌[11]，但SARS-CoV-2的死亡率更高，并且進(jìn)化的單堿基突變株比野生型SARS-CoV-2更具傳染性和致死性，除此之外多重病毒合并感染的幾率也很高[12]，因此，多重檢測和突變基因分型對于評估病毒的傳播性和致病性變得越來越重要[3].Kundrod等[13]針對N、E和ORF1a基因設(shè)計了3組獨(dú)特的引物集識別SARS-CoV-2基因組的不同區(qū)域，降低了病毒突變對擴(kuò)增的影響.研究表明與單引物組相比，RT-LAMP使用3個引物組可以提高靈敏度，加快擴(kuò)增速度，在50 copies模板濃度上有顯著差異.基于CRISPR的LAMP檢測需要多種CRISPR-Cas相關(guān)酶進(jìn)行切割，而Ye等[3]開發(fā)了一體式Ago切割的RT-LAMP檢測系統(tǒng)(MULAN)，該系統(tǒng)設(shè)計和檢測更簡單；Manzanas等[14]開發(fā)的2-Plex VLEAD設(shè)備集成了球型閥門輸送試劑、裂解病毒并在紙墊上濃縮和純化、采集的RNA直接RT-LAMP擴(kuò)增，然后進(jìn)行比色分析，該設(shè)備成本低、使用簡單，這兩種方法都適用于檢測SARS-CoV-2的不同變種、流感病毒亞型(A型和B型)或其他類型的病毒.

3 LAMP檢測SARS-CoV-2的應(yīng)用

3.1 電泳LAMP

由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是不同數(shù)量的頸環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度的DNA混合物，通過瓊脂糖凝膠電泳法可見特異的梯狀條帶.該方法操作繁瑣且容易產(chǎn)生氣溶膠污染，多用于驗(yàn)證LAMP.

3.2 可視化LAMP

3.2.1 比色法LAMP

比色法LAMP(colorimetric LAMP ，cLAMP)是指反應(yīng)前在體系中加入染料，通過觀察LAMP反應(yīng)前后顏色變化差異實(shí)現(xiàn)快速判讀反應(yīng)結(jié)果，適用于POCT.在檢測低拷貝數(shù)樣本時，RT-LAMP中瓊脂糖凝膠法顯示陽性，但比色法沒有顏色變化，可能由于擴(kuò)增子的形成少，這表明比色法診斷靈敏性較低[6].改進(jìn)方法：(1)采樣時期的選擇：低病毒拷貝數(shù)下的檢測率取決于采樣時間和擴(kuò)增時間，在早期感染期間病毒載量很低，直到出現(xiàn)癥狀的第五天，病毒載量就相對較高，此時比色LAMP對新冠肺炎的診斷是有效的[15]；(2)增加擴(kuò)增時間：當(dāng)延長LAMP反應(yīng)時間至50～60 min時，病毒載量較低的樣品也可被明顯區(qū)分開；(3)比色法定量：Aoki等[6]利用分光光度儀分析酚紅-LAMP檢測SARS-CoV-2的結(jié)果，陽性反應(yīng)中粉紅色的強(qiáng)度降低、黃色的吸光度增加，從而通過ΔDO值(粉紅色吸光度減去黃色吸光度即434～560 nm)進(jìn)行客觀的顏色測定；Yoo等[16]基于平板電腦自動圖像捕獲和編寫測試算法，引入了DEF(決定性、有效性和模糊性)對HNB-LAMP的顏色變化進(jìn)行分析，量化比色增加可視化的靈敏度.(4)使用新型混合染料：利用顏色之間的互補(bǔ)作用，使變色范圍變窄，從而使終點(diǎn)時顏色變化敏銳[17].Jaroenram等[18]將二甲酚橙(XO)與孔雀石綠(MG)結(jié)合成復(fù)合染料稱為薰衣草綠(LG)，帶來了一種新的RT-LAMP比色系統(tǒng)對SARS-CoV-2進(jìn)行檢測，紫色

表1 SARS-CoV-2檢測的LAMP比色指示劑Tab.1 LAMP colorimetric indicator for SARS-CoV-2 detection

3.2.2 LFD法

橫向流動試紙條檢測(lateral flow dipstick，LFD)包括LAMP擴(kuò)增和橫向側(cè)流試紙條分析2個步驟，由于內(nèi)引物與環(huán)引物被標(biāo)記上生物素與地高辛，擴(kuò)增反應(yīng)形成雙標(biāo)記產(chǎn)物，然后產(chǎn)物通過橫向?qū)游雠c結(jié)合墊上偶聯(lián)地高辛抗體的金磁微粒、檢測線上生物素抗體及質(zhì)控線上的其他抗體結(jié)合，從而顯示出特定顏色[8]，通過不同的修飾物(FITC、Texas Red、熒光素、DIG等)標(biāo)記不同靶標(biāo)引物就可以實(shí)現(xiàn)雙重[26]、三重[27]靶點(diǎn)的檢測.Waller等[27]將mRT-LAMP-LFIA利用移液機(jī)器人和位置傳感器來確保精度和重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)完全自動化，能在15 min內(nèi)檢測到SARS-CoV-2三個不同的基因靶點(diǎn)(ORF1ab、E和N)，檢測限低至3 copies/反應(yīng).橫向流動LAMP檢測具有判讀方便、設(shè)備簡單等特點(diǎn)，但其在反應(yīng)后需要開蓋進(jìn)行雜交，這一步驟可能會引起污染造成假陽性.

3.3 實(shí)時LAMP

3.3.1 實(shí)時濁度法

利用實(shí)時濁度儀對LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀進(jìn)行濁度監(jiān)測，LAMP實(shí)時濁度監(jiān)測比傳統(tǒng)的RT-PCR實(shí)時熒光監(jiān)測更簡單[28].Chen等[29]通過實(shí)時濁度監(jiān)測來確定SARS-CoV-2 RdRp和N基因的RT-LAMP最佳擴(kuò)增溫度，測試了60～67 °C的反應(yīng)溫度，間隔1 °C得出對應(yīng)的擴(kuò)增曲線，濁度>0.1是陽性.Kitagawa等[30]通過LA-200濁度計對RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時檢測，以10倍連續(xù)稀釋的SARS-CoV-2 RNA為模板，在35 min內(nèi)的檢測下限為10 copies·μL-1.

3.3.2 熒光定量法

基于SYBR Green I、SYTO系列等熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合的實(shí)時熒光，趙大重[31]通過SYBR Green I熒光染料進(jìn)行SARS-CoV-2檢測的LAMP體系優(yōu)化，選擇擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)、出峰時間最早、最終達(dá)到的熒光信號值大為最優(yōu)體系，并觀察熔解曲線中空白對照沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增.Oscorbin等[32]以MS2噬菌體為內(nèi)參照，通過熒光插層染料LAMP擴(kuò)增結(jié)合熔融曲線分析進(jìn)行實(shí)時檢測SARS-CoV-2，與實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果的符合率為97.6%，最低檢測限為20 copies/反應(yīng).基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的實(shí)時熒光，Dong等[33]使用HFman-LAMP，熒光探針與LF或LB具有相同序列并分別在3′端和5′端標(biāo)記熒光團(tuán)和猝滅劑，由于探針被高保真DNA聚合酶切割，釋放出的熒光信號呈指數(shù)增加.因此可以簡單地通過熒光強(qiáng)度來實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)，還可以針對SARS-CoV-2的ORF、E基因以及人類看家基因β-肌動蛋白在不同序列的HFman探針上使用不同的熒光基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)多重檢測.對于探針法還有研究者引入校對酶和熒光探針的LAMP(RT-Proofman-LAMP)[34]提高擴(kuò)增效率；開發(fā)了環(huán)探針LAMP(oLAMP)[35]提高靈敏度.

3.3.3 BART和實(shí)時測序

Iijima等[28]建立了一種新型RT-LAMP-BART檢測SARS-CoV-2(野生型和4種變異型)，BART的原理是通過螢火蟲熒光素酶產(chǎn)生的生物發(fā)光，連續(xù)監(jiān)測核酸擴(kuò)增的副產(chǎn)物(PPi)轉(zhuǎn)化為ATP的過程.該檢測顯示了一個光輸出峰值，即在最初幾分鐘內(nèi)光輸出下降后，如果光信號顯著增加，則認(rèn)為樣本是陽性，隨后光輸出下降.雖然RT-LAMP-BART不如傳統(tǒng)的實(shí)時RT-PCR靈敏度高，但它產(chǎn)生結(jié)果的速度更快.Ptasinska等[36]將LAMP和納米孔測序(LamPORE)耦合進(jìn)行快速實(shí)時測序分析SARS-CoV-2或其他病原體.實(shí)時監(jiān)測比其他方法靈敏度高，但不適合現(xiàn)場即時檢測.

3.4 微流控LAMP

微流控芯片微小可控、功能齊全，能夠簡化操作過程、加快分析速度，還可避免常規(guī)方法中樣品轉(zhuǎn)移所帶來的污染和損失，LAMP與微流控技術(shù)結(jié)合的核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)最有潛力被應(yīng)用在POCT上[37].目前博奧晶芯生物科技有限公司的全集成碟式芯片法(LAMP恒溫擴(kuò)增)新冠核酸試劑盒已獲批，對于最新毒株也可以做到不脫靶不漏檢，35 min內(nèi)檢測靈敏度可達(dá)150 copies·mL-1.Nguyen等[38]開發(fā)了一個完全集成的離心式微流控平臺可以一次對10個樣品進(jìn)行qLAMP擴(kuò)增分析，并設(shè)計了3個反應(yīng)室來靶向SARS-CoV-2的ORF1 ab、N和S基因，減少了假陽性和假陰性的錯誤結(jié)果，提高了準(zhǔn)確性.Yang等[39]利用靈敏的RT-LAMP來增強(qiáng)信號，然后通過特異的人絨毛膜促性腺激素(HCG)連接的足趾介導(dǎo)的鏈交換(TM)探針(HCGP)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到便攜式商業(yè)妊娠試驗(yàn)試紙(PTS)，整個檢測集成到一個四通道、手掌大小的微流控裝置，并成功應(yīng)用于SARS-CoV-2的M、N基因的檢測，其最低檢測濃度為0.5 copies·μL-1.

3.5 與其他技術(shù)聯(lián)合的LAMP檢測

Nguyen等[40]制作了一種將LAMP與聚多巴胺相結(jié)合的可滑動紙質(zhì)裝置可在25 min內(nèi)檢測到SARS-CoV-2，在DNA擴(kuò)增子存在時阻礙了聚多巴胺變成聚集態(tài)，而在沒有擴(kuò)增時促進(jìn)了聚多巴胺的聚集.紙張的多孔性使得陽性樣品中分散的聚多巴胺能夠在毛細(xì)管流動，而陰性樣品中聚集態(tài)的聚多巴胺由于聚集體較大而留在紙條的底部.Day等[41]開發(fā)了一種乳化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(eLAMP)平臺診斷SARS-CoV-2，LAMP反應(yīng)的分隔導(dǎo)致乳狀液特性變化更快，從而降低檢測時間.在這些液滴中，LAMP反應(yīng)產(chǎn)生擴(kuò)增子吸附到水-油界面使界面張力降低，導(dǎo)致乳狀液直徑變小，從而利用分光光度計和光纖光纜通過角度相關(guān)的光散射強(qiáng)度(基于Mie散射理論)來監(jiān)控反應(yīng)乳化劑直徑的變化.Alvarez等[42]使用基于Arduino的pH微電極輔助的便攜式LAMP擴(kuò)增系統(tǒng)，對于未提取的病毒載量中等或低的唾液樣本，擴(kuò)增3 min即可準(zhǔn)確可靠地診斷SARS-CoV-2，擴(kuò)增過程中固有的H3O+離子的釋放通過電勢的差異或pH變化來實(shí)時監(jiān)測.但是這種診斷系統(tǒng)的性能依賴于相對昂貴的商用pH微電極，而且玻璃或膜的pH微電極可能是樣品中殘留DNA 的污染源(來自之前的陽性擴(kuò)增)，因此還需要建立能夠在完成擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)后有效地將電極上殘存核酸去除的方案.Song等[43]研究了一種嵌套等溫擴(kuò)增(Penn-RAMP)包括重組酶等溫擴(kuò)增(RT-RPA)作為其第一階段，LAMP作為其第二階段，與單步擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)同時檢測CT<32的SARS-CoV-2進(jìn)行比較，Penn-RAMP的靈敏度是RT-LAMP的10倍.

CRISPR系統(tǒng)特異性識別序列將減少等溫擴(kuò)增步驟中副產(chǎn)物造成的假陽性結(jié)果，從而提高特異性[44].Cas12蛋白也被廣泛用于基于CRISPR/Cas的SARS-CoV-2核酸檢測.在識別特定的靶核酸后，Cas12或Cas13核酸酶的非特異性反式切割活性被激活，從而切割報告探針，因此這些方法大多使用熒光探針，需要特殊的儀器來監(jiān)測熒光信號[45]；還有研究應(yīng)用耐熱的Cas12b與RT-LAMP結(jié)合一體式檢測SARS-CoV-2[46].基于Cas12的方法依賴于側(cè)向流動分析[47]、離心機(jī)的使用[48]或磁力下拉操作[49]等，這些方法對于高通量檢測是困難的.Cas13由于其敏感性在檢測RNA病原體方面比Cas12更具優(yōu)勢[44].Mahas等[50]使用RT-LAMP偶聯(lián)mCas13(一種新的Cas13變體)系統(tǒng)檢測SARS-CoV-2，使用手持、廉價的熒光顯像儀輸出熒光信號，這是一種適用于POC和簡單讀數(shù)的常規(guī)診斷，但也不適合高通量篩查.納米金(AuNP)因其較強(qiáng)的摩爾吸光系數(shù)而被用于可視分析， Zhang等[24]建立了一種Cas12a輔助結(jié)合AuNP目測的RT-LAMP擴(kuò)增方法(CLAP)，從肉眼可以觀察到紅色變成紫色，基于這兩種方法操作簡單，有望在POCT中得到應(yīng)用.

4 LAMP檢測SARS-CoV-2的改進(jìn)

4.1 樣品處理簡單化與快速化

現(xiàn)階段應(yīng)用于SARS-CoV-2核酸檢測的核酸提取方法包括離心吸附法、磁珠法、試劑盒提取，這些方法需要專門的昂貴設(shè)備和試劑，并且非常耗時[51].而超速提取和免提取核酸的設(shè)計可以大大縮短SARS-CoV-2核酸提取的時間，提高LAMP檢測效率[52].目前快速提取SARS-CoV-2核酸的方法不斷改進(jìn)：He等[53]探索了一種基于硅羥基MBS快速提取SARS-CoV-2 RNA的方法，實(shí)現(xiàn)核酸的自動提取，MBS結(jié)合RNA分子的能力很強(qiáng)，當(dāng)被MBS捕獲后，RNA與MBS一起直接用于下游的RT-LAMP反應(yīng)；由于唾液可自行收集并保護(hù)了采集人員，Amaral等[54]建立了一種RT-LAMP直接從唾液樣本中檢測SARS-CoV-2，但是靈敏度較低.，研究人員對唾液進(jìn)行不同的處理，結(jié)合某些化學(xué)物質(zhì)和蛋白酶K可以改善唾液樣本中SARS-CoV-2的檢測.

Mautner等[55]在90 °C加熱拭子樣品5 min后，直接用于RT-LAMP檢測；Ganguli等[56]將拭子移到病毒傳輸介質(zhì)(VTM)，95 ℃熱裂解1 min，直接取一定體積VTM進(jìn)行RT-LAMP分析，該方法30 min內(nèi)可檢出50 copies·μL-1.Jones等[57]將20 μL樣品與2×LAMP裂解緩沖液混合：2%Triton X-100調(diào)節(jié)至pH=8.0，2 mol·L-1Tris-HCl和80 U·mL-1蛋白酶K，在室溫下孵育15 min后滅活蛋白酶K，取樣品裂解液2 μL直接用作熒光RT-LAMP反應(yīng)的模板[3].用于SARS-CoV-2裂解緩沖液還有其他配方，對比熱裂解病毒，該法可有效地破壞病毒以釋放RNA，同時使未純化樣本中存在的核酸酶失活，但裂解緩沖液處理樣品會稀釋樣品而導(dǎo)致LAMP檢測靈敏度降低[56].Kundrod等[13]優(yōu)化裂解病毒方法，通過TCEP/EDTA裂解緩沖液處理和熱裂解病毒相結(jié)合，并得出結(jié)論：增加緩沖液濃度會使裂解效率顯著提高，5×濃度達(dá)到最完全的裂解，并且加入200 mmol·L-1鹽酸胍會導(dǎo)致更完全的核糖核酸酶失活.對于鼻咽、鼻拭子洗脫液和唾液樣本都具有臨床意義，三重檢測方法的最低檢測限可達(dá)20～23 copies/反應(yīng).

鼻咽拭子樣本采集過程令人不適，操作需要專業(yè)人員，并容易感染測試人員；唾液檢測具有操作簡單、侵入性小和感染風(fēng)險低等優(yōu)點(diǎn)，但是唾液的粘性以及蛋白水解酶的存在使得唾液樣本的直接應(yīng)用具有一定困難.Duan等[58]為了檢測人體呼氣中的SARS-CoV-2 RNA，研制了一種在樣本采集現(xiàn)場將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA的手持呼氣測定儀Bubbler，可以直接對呼氣中的氣霧化顆粒進(jìn)行采樣.Daniels等[59]研制了一種收集呼氣冷凝液(EBC)的口罩，對EBC口罩樣本進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果與鼻咽拭子樣一致.患者呼出的EBC可能是診斷SARS-CoV-2的一種重要的替代樣本類型.雖然呼氣中的病毒RNA更豐富，但病毒載量比鼻咽拭子中的病毒載量低幾個數(shù)量級，因此還是受到一定限制，目前還沒有應(yīng)用于LAMP擴(kuò)增，仍需要進(jìn)一步研究[58].

4.2 檢測智能化與潮流化

將智能手機(jī)、平板電腦轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床POC診斷工具已被許多檢測模式所證明，Heithoff等[60]調(diào)查了一種基于智能手機(jī)的實(shí)時LAMP(SMART-LAMP)的技術(shù)測試，以了解它是否具備POC檢測的速度、靈敏度、低成本、可擴(kuò)展性和可訪問性的組合屬性.Papadakis等[61]報道了一種便攜式的實(shí)時定量比色LAMP(qcLAMP)裝置，比色法檢測依賴于肉眼對顏色變化的評估很難辨別，利用智能手機(jī)相機(jī)結(jié)合算法或輻射成像獲得更準(zhǔn)確和定量比色檢測SARS-CoV-2的結(jié)果.Rohaim等[62]為了進(jìn)一步提高分析性能并消除操作員分析結(jié)果的主觀性，設(shè)計了一種新型手持式智能診斷儀，配備了自動圖像采集和處理算法，并通過人工智能(AI)管道對整理的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，這種先進(jìn)的人工智能算法實(shí)現(xiàn)的LAMP(AI-LAMP)針對SARS-CoV-2的RdRp基因顯示了很高的分析靈敏度和特異性.將物聯(lián)網(wǎng)、機(jī)器學(xué)習(xí)工具和大數(shù)據(jù)分析等應(yīng)用于新冠肺炎診斷，可以快速準(zhǔn)確地得出結(jié)果[63].

5 總結(jié)與展望

快速檢測戰(zhàn)略是防治和管理未來潛在流行病的關(guān)鍵[64].快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP擴(kuò)增檢測平臺具有廣闊的應(yīng)用前景.例如，微流控芯片技術(shù)把樣品前處理、LAMP擴(kuò)增、檢測集成于芯片中，將生物傳感器的超高靈敏度與人工智能和物聯(lián)網(wǎng)的進(jìn)步相結(jié)合的LAMP檢測方法有助于更好地控制潛在的疾病傳播[64]，實(shí)現(xiàn)了樣品到檢測結(jié)果的可視化監(jiān)測.因此，未來LAMP 的應(yīng)用研究主要往集成式、便攜式、操作簡便、高通量、低成本、易判讀、人工智能的方向發(fā)展，為病毒檢測的快速化、現(xiàn)場化、可視化提供更多的手段.