龔 雪，錢文昊，蘇儉生

雙膦酸鹽(bisphosphonates, BPs)為無機(jī)焦磷酸鹽類似物，能夠特異性地與骨基質(zhì)中的羥磷灰石結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活性，發(fā)揮抑制骨吸收作用，是治療骨質(zhì)疏松癥、佩吉特骨病以及惡性腫瘤引起的骨轉(zhuǎn)移和高鈣血癥等疾病的一線藥物。它可通過延緩骨破壞提高骨密度，增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度以及降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，極大地改善患者的生活質(zhì)量。然而，近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期應(yīng)用雙膦酸鹽類藥物可引起頜骨壞死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw, BRONJ)，相關(guān)病例報(bào)道逐漸增多[1-4], 給雙膦酸鹽的臨床安全應(yīng)用提出了極大的挑戰(zhàn)。

流行病學(xué)資料顯示，BRONJ的發(fā)生在不同治療人群中存在較大差異。靜脈用藥患者BRONJ的累積發(fā)病率為0.8%～12.0%，口服用藥患者BRONJ發(fā)病率較低，為0.01%～0.04%，但當(dāng)加入牙槽創(chuàng)傷這一危險(xiǎn)因素后，發(fā)病率呈數(shù)量級(jí)的上升[5-7]。有回顧性文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，60%～70%的BRONJ患者具有拔牙等創(chuàng)傷史，拔牙被認(rèn)為是BRONJ發(fā)生最重要的危險(xiǎn)因素[8-9]，而伴有口腔炎性疾病在一定程度上又增加了罹患BRONJ的風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。BRONJ多發(fā)生于拔牙等口腔侵入性治療后，臨床表現(xiàn)為拔牙創(chuàng)經(jīng)久不愈，黏膜大面積潰爛，頜面部劇烈疼痛，骨面長(zhǎng)時(shí)間暴露壞死，這些癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但BRONJ的致病機(jī)制迄今不明，亦無確切有效的治療方法。

目前，BRONJ的治療多主張以保守治療為主，包括使用抗生素、外用灌洗劑、鎮(zhèn)痛藥等，但通常療效不佳[5,13]。手術(shù)治療應(yīng)用于保守治療無效以及病情嚴(yán)重、頜骨壞死面積較大的患者，但爭(zhēng)議較大[14-15]。雙膦酸鹽引起的骨組織改變是全身性的，很難確定清創(chuàng)的可行性骨邊緣，有時(shí)無法完全去除壞死骨組織，而施行手術(shù)可能導(dǎo)致毗鄰骨更多的暴露，增加壞死風(fēng)險(xiǎn)，使病情進(jìn)一步惡化[16]。高壓氧治療用于輔助治療BRONJ，可增加組織的氧儲(chǔ)量，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但此種治療方法效果通常不明顯[17-18]。除此之外，還有伴富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)治療、激光治療、臭氧治療等[19-20]，治療策略相似，但療效需進(jìn)一步研究。因此，探尋一種有效的BRONJ治療方法，顯得非常緊迫和必要。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化和組織修復(fù)潛能，是骨組織工程最為常用的種子細(xì)胞。目前關(guān)于BRONJ的干細(xì)胞治療策略多以預(yù)防為主[21-22]，少量的BRONJ治療研究也多采用系統(tǒng)性方式來移植BMSCs，全身免疫因素影響較大[23]，采用局部方式移植BMSCs較少，且多加入一些有機(jī)或無機(jī)骨誘導(dǎo)物質(zhì)[24-25]，不能特異性說明BMSCs對(duì)BRONJ的治療作用。

在前期工作中，我們成功構(gòu)建了BRONJ大鼠模型，模擬了人類發(fā)生BRONJ的基本臨床癥狀，包括軟組織缺損、炎癥反應(yīng)、暴露壞死骨形成以及不同程度的骨質(zhì)硬化等[26]。本實(shí)驗(yàn)將外周骨BMSCs與Bio-Oss骨粉在體外復(fù)合培養(yǎng)構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體，然后植入到BRONJ大鼠局部清創(chuàng)后的骨缺損處，評(píng)估外周骨BMSCs對(duì)BRONJ大鼠的治療效果，為探索BRONJ治療方法提供一個(gè)新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生和8～10周齡雌性SD大鼠，SPF級(jí)，由上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。該項(xiàng)目所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得相關(guān)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理許可證編號(hào)：滬徐牙防科倫審[2019]5號(hào)。

1.2 主要試劑和儀器

唑來膦酸、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松(Sigma，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、PBS(Hyclone，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；Bio-Oss骨粉(Geistlich，瑞士)；多聚甲醛、利多卡因、EDTA、二甲苯、乙醇、石蠟(上海國(guó)藥，中國(guó))；蘇木精-伊紅染色試劑盒(南京建成，中國(guó))；大鼠RANKL ELISA試劑盒、大鼠OPG ELISA試劑盒(武漢中美，中國(guó))；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(康為生物，中國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國(guó))；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；移液器(Eppendorf，德國(guó))；微電子計(jì)算機(jī)斷層掃描、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、石蠟展片機(jī)、石蠟烘片機(jī)(Leica，德國(guó))；離心機(jī)(Thermo，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周骨BMSCs的分離和培養(yǎng)[26]將新生SD大鼠斷頸處死后，置入75%乙醇中浸泡5 min。無菌條件下分離髂骨以及脛骨，剔除附著的肌肉等軟組織，反復(fù)PBS沖洗。然后用低糖DMEM完全培養(yǎng)液常規(guī)反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿。BMSCs細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后首次半量換液，之后每3 d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞支架復(fù)合體的體外構(gòu)建 取適量Bio-Oss骨粉置入96孔板中，均勻鋪開，厚度約2 mm，并用DMEM完全培養(yǎng)液預(yù)濕支架材料。將第3代大鼠外周骨BMSCs常規(guī)消化后以1×106個(gè)/mL的密度接種于支架鋪底的孔板中，使細(xì)胞液被材料飽和吸入，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，待細(xì)胞大量貼壁后，輕輕加入足量培養(yǎng)液至完全浸沒支架材料，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)以備用。

1.3.3 動(dòng)物模型構(gòu)建和手術(shù) SD大鼠48只，每周給予尾靜脈注射唑來膦酸(80 μg/kg)，用藥2周后，在全身麻醉加局部浸潤(rùn)麻醉下，牙齦分離器分離牙齦，微創(chuàng)拔除兩側(cè)上頜第一磨牙(圖1A)。之后繼續(xù)用藥至術(shù)后12周，構(gòu)建大鼠BRONJ模型[26]。將BRONJ大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組不做處理，其余3組在全麻下對(duì)BRONJ大鼠局部去骨清創(chuàng)(圖1B)，設(shè)立清創(chuàng)組,其他2組(細(xì)胞支架組、支架組)分別移植入細(xì)胞支架、單純支架(圖1C)，最后縫合創(chuàng)口。移植術(shù)后4周和8周，大鼠分批處死后，分離并收集頜骨組織。

A：藍(lán)色圓圈所示上頜第一磨牙拔牙窩，右上角圖所示拔除的上頜第一磨牙；B：藍(lán)色圓圈所示清創(chuàng)后的骨缺損創(chuàng)口；C：藍(lán)色圓圈所示細(xì)胞支架復(fù)合體植入

1.3.4 Micro-CT(micro computed tomography，Micro-CT)檢測(cè) 收集的骨組織樣本進(jìn)行Micro-CT檢測(cè)，分析各組骨缺損區(qū)新骨形成情況。將樣本置于標(biāo)本檢測(cè)槽上并牢固固定，注意保持牙體長(zhǎng)軸與掃描切面垂直，掃描參數(shù)設(shè)置為電壓45 kV，電流550 μA，分辨率10 μm，并利用Dateviewer Pro和CTvol Software軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 組織學(xué)分析 收集的骨組織樣本用4%多聚甲醛固定完全后沖水過夜，然后在室溫下用10% EDTA脫鈣，每3 d更換1次脫鈣液，至樣本變軟后沖水過夜，之后用脫水機(jī)梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，然后包埋機(jī)包埋。最后，用切片機(jī)以5 μm的厚度切片、展片、烘片，進(jìn)行HE染色。

1.3.6 骨組織NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB，RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)檢測(cè) 頜骨樣本離體后即刻置入液氮進(jìn)行低溫冷凍，然后用無菌研缽對(duì)冷凍的骨組織進(jìn)行充分研磨。之后用T-PER裂解液進(jìn)行組織裂解，離心后得到組織裂解液。然后采用ELISA對(duì)骨組織樣本中的RANKL、OPG蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)，并以測(cè)得的總蛋白實(shí)際濃度來對(duì)其含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上各個(gè)實(shí)驗(yàn)定量數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)。采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Micro-CT掃描分析

Micro-CT三維重建后各組樣本的矢狀切面圖如圖2。術(shù)后4周，細(xì)胞支架組缺損區(qū)的成骨修復(fù)效果最佳，新骨生成較多，已無明顯的缺損邊界，但清創(chuàng)區(qū)新骨形成表面高低不平。支架組缺損區(qū)的成骨修復(fù)效果居其次，新骨生成較少，中央可見較大凹陷。對(duì)照組缺損區(qū)的新骨形成表面高低不平，中央有淺碟狀凹陷，可見游離的死骨片。清創(chuàng)組成骨修復(fù)效果最差，新骨生成最少，凹坑狀骨缺損最深，表面骨質(zhì)高低不平。術(shù)后8周，細(xì)胞支架組新骨形成區(qū)域與周邊骨質(zhì)均勻連接，新骨表面光滑平整，骨改建已基本完成，成骨修復(fù)效果最佳。支架組成骨情況較4周時(shí)有明顯增加，新骨形成表面變得相對(duì)平滑，缺損區(qū)已無明顯的缺損邊界，局部骨表面有一些小的凹陷。對(duì)照組與4周時(shí)基本相似，缺損區(qū)表面仍高低不平，中央淺凹處可見大量的游離死骨片，骨壞死呈現(xiàn)加劇趨勢(shì)。清創(chuàng)組的成骨情況較4周時(shí)無明顯增加，表面仍高低不平，凹坑狀骨缺損范圍呈擴(kuò)大趨勢(shì)。

圖2 移植術(shù)后大鼠頜骨Micro-CT矢狀切面圖

各組樣本術(shù)區(qū)骨礦化密度分析結(jié)果如圖3。隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞支架組和支架組8周時(shí)的骨礦化密度均較4周時(shí)明顯增加。細(xì)胞支架組在所有組別中骨礦化修復(fù)速度最快，術(shù)后8周骨密度最高(P<0.05)，支架組骨礦化密度居其次，8周時(shí)較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。對(duì)照組和清創(chuàng)組4周和8周骨密度變化不大，其中清創(chuàng)組骨密度最低(P<0.05)，新骨形成最少。

*：與各自對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 組織學(xué)結(jié)果

HE染色結(jié)果如圖4～5。術(shù)后4周，細(xì)胞支架組和支架組均有明顯成骨現(xiàn)象。細(xì)胞支架組創(chuàng)口黏膜已基本愈合，在高倍鏡下，可見大量纖維組織充盈細(xì)胞支架復(fù)合體內(nèi)部，支架降解吸收明顯，有的區(qū)域已無明顯支架，殘存的支架周圍新生類骨質(zhì)樣物質(zhì)形成較多，結(jié)締組織中還可見少量多核巨細(xì)胞分布。支架組創(chuàng)口亦已基本愈合，上皮組織完全覆蓋創(chuàng)面，在高倍鏡下，可見支架材料部分降解吸收，支架周圍纖維組織包繞，有部分新生類骨質(zhì)樣物質(zhì)形成，降解的支架周圍纖維組織中亦可見少量多核巨細(xì)胞。對(duì)照組頜骨拔牙創(chuàng)仍未愈合，創(chuàng)區(qū)黏膜潰爛，骨面暴露，死骨形成，在高倍鏡下，病變骨質(zhì)骨細(xì)胞細(xì)胞核固縮或消失，出現(xiàn)許多空的骨陷窩，而骨小梁排列緊密、增生明顯，骨質(zhì)出現(xiàn)不同程度的硬化，且周圍伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為典型的BRONJ組織病理表現(xiàn)。清創(chuàng)組上皮未愈合，凹坑狀骨缺損最明顯，創(chuàng)區(qū)骨面大量暴露，死骨形成，在高倍鏡下，可見明顯的病變壞死骨質(zhì)，無明顯新骨形成。

骨組織(B)、壞死骨(NB)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(IF)、結(jié)締組織(CT)、上皮(E);黑色箭頭所示移植術(shù)后未降解支架；標(biāo)尺：200 μm

術(shù)后8周，細(xì)胞支架組和支架組上皮組織正常愈合覆蓋創(chuàng)面，黏膜下骨組織已無明顯的缺損邊界，骨組織完整連續(xù)，上皮、上皮下結(jié)締組織和骨組織之間界限分明。在高倍鏡下，這兩組創(chuàng)區(qū)已無明顯的支架材料，骨改建已基本完成，亦未見骨細(xì)胞細(xì)胞核缺失的壞死骨質(zhì)。其中，細(xì)胞支架組成熟的板層骨連接成片，骨小梁形態(tài)規(guī)則、排列緊密，密度較支架組高，而支架組改建后的骨組織中可見較多長(zhǎng)裂隙，骨小梁結(jié)構(gòu)稍紊亂無序。對(duì)照組部分樣本上皮組織雖覆蓋創(chuàng)面，但在高倍鏡下，骨壞死卻呈現(xiàn)加劇趨勢(shì)，空骨陷窩明顯增多，死骨面積明顯增大，壞死骨周圍炎癥浸潤(rùn)亦更為嚴(yán)重。清創(chuàng)組上皮未能完全愈合，但軟組織缺損較4周時(shí)有所減少，新骨形成則較4周時(shí)基本無增加，凹坑狀骨缺損仍很明顯，可見游離的死骨片。

骨組織(B)、壞死骨(NB)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(IF)、結(jié)締組織(CT)、上皮(E);黑色箭頭所示移植術(shù)后未降解支架；藍(lán)色箭頭所示骨組織無序的新骨結(jié)構(gòu)，可見長(zhǎng)裂隙；標(biāo)尺：50 μm

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)

RANKL和OPG表達(dá)結(jié)果如圖6。術(shù)后4周，細(xì)胞支架組、支架組和清創(chuàng)組RANKL表達(dá)均較對(duì)照組下降(P<0.05)。術(shù)后8周，清創(chuàng)組RANKL表達(dá)較對(duì)照組上升(P<0.05)，而細(xì)胞支架組、支架組RANKL表達(dá)則較對(duì)照組下降(P<0.05)。術(shù)后4周，細(xì)胞支架組OPG表達(dá)最高(P<0.05)，支架組和清創(chuàng)組則較對(duì)照組下降(P<0.05)。術(shù)后8周，支架組和清創(chuàng)組OPG表達(dá)較對(duì)照組下降(P<0.05)。

A：RANKL的表達(dá)；B：OPG的表達(dá)；C：RANKL/OPG比值；*：與各自對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

術(shù)后4周和8周，細(xì)胞支架組、支架組和清創(chuàng)組RANKL/OPG比值依次增高，細(xì)胞支架組和支架組較對(duì)照組下降(P<0.05)，清創(chuàng)組較對(duì)照組明顯上升(P<0.05)。

3 討 論

BMSCs具有多向分化和組織修復(fù)潛能，是目前骨組織工程研究最多且最為常用的種子細(xì)胞，BMSCs相關(guān)的骨組織工程技術(shù)，為BRONJ治療提供了新方向。目前關(guān)于BRONJ的干細(xì)胞治療的研究，多采用系統(tǒng)性方式來移植外周骨BMSCs，全身免疫因素影響較大[23]，采用局部方式移植較少，且多加入血纖蛋白、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate, β-TCP)、脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix, DBM)等一些有機(jī)或無機(jī)骨誘導(dǎo)物質(zhì)[24-25]，不能特異性說明BMSCs對(duì)BRONJ的治療作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)趯?duì)BRONJ模型大鼠局部清創(chuàng)后，將細(xì)胞支架復(fù)合體植入局部骨缺損處，還同時(shí)設(shè)立支架組和清創(chuàng)組來排除全身因素和骨誘導(dǎo)物質(zhì)的影響。

Micro-CT和組織學(xué)分析是目前骨組織工程體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最為常用的檢測(cè)方法。Micro-CT掃描是一種非侵入、超高分辨的3D顯微成像技術(shù)，可以在不破壞組織樣本的情況下清楚分辨其內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，其分辨率可達(dá)到微米級(jí)別。本實(shí)驗(yàn)Micro-CT和組織學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞支架組的成骨修復(fù)效果最佳，促進(jìn)了BRONJ大鼠清創(chuàng)后的黏膜愈合和骨缺損修復(fù)，對(duì)BRONJ大鼠具有較好的治療效果。支架組修復(fù)效果居其次，具有一定的成骨修復(fù)效果，說明Bio-Oss材料本身具有一定的成骨誘導(dǎo)作用。清創(chuàng)組成骨修復(fù)效果最差，新骨生成少，凹坑狀骨缺損明顯，且缺損范圍呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)。說明對(duì)BRONJ大鼠進(jìn)行局部清創(chuàng)手術(shù)，不僅沒能起到封閉創(chuàng)口、促進(jìn)愈合的作用，反而引起骨缺損范圍擴(kuò)大，致病情進(jìn)一步惡化。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果相一致[16]。因此，實(shí)施外科清創(chuàng)手術(shù)以及骨移植修復(fù)重建操作應(yīng)相當(dāng)謹(jǐn)慎，診斷性手術(shù)或擴(kuò)大性治療手術(shù)亦應(yīng)盡量避免。

組織學(xué)結(jié)果顯示，支架組新生骨組織中可見較多裂隙，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，而細(xì)胞支架組板層骨改建正常，新生骨組織連接成片，骨小梁結(jié)構(gòu)規(guī)則，排列緊密。骨組織中的唑來膦酸可抑制骨痂組織向板層骨改建過程中成骨細(xì)胞的終末分化[27]，使得新生的骨組織結(jié)構(gòu)紊亂，板層骨中存有較多裂隙。有文獻(xiàn)報(bào)道[28]，頜骨中出現(xiàn)的微裂隙與BRONJ發(fā)生有著重要關(guān)系，提示我們，支架組中的骨裂隙可能增加BRONJ復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，細(xì)胞支架組的成骨修復(fù)效果較支架組更佳，不僅促進(jìn)了BRONJ大鼠清創(chuàng)后骨缺損修復(fù)，且改建后的骨組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，與正常骨組織無明顯差異。

RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨吸收與骨生成動(dòng)態(tài)平衡，保證正常的骨改建中起著重要作用。正常的骨重建和骨量的穩(wěn)定依賴于RANKL和OPG平衡。RANKL/OPG比例上升時(shí)，破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性將增加，骨吸收增強(qiáng)；RANKL/OPG比例下降時(shí)，破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性將降低，骨吸收抑制。術(shù)后4周和8周，細(xì)胞支架組、支架組和清創(chuàng)組RANKL/OPG比值依次增高，細(xì)胞支架組和支架組較對(duì)照組減少，清創(chuàng)組較對(duì)照組明顯增高。說明細(xì)胞支架組和支架組該信號(hào)通路都受到一定程度的下調(diào)，其中，細(xì)胞支架組較支架組更為明顯。當(dāng)細(xì)胞支架復(fù)合體植入BRONJ大鼠清創(chuàng)后骨缺損處后，頜骨中局部微環(huán)境得到一定程度改善，RANKL/OPG比值的下調(diào)，可能抑制破骨細(xì)胞的分化和功能，進(jìn)而抑制骨吸收。而支架組RANKL/OPG比值的下調(diào)較細(xì)胞支架組幅度小，骨吸收減少?zèng)]有細(xì)胞支架組明顯，因而對(duì)骨缺損修復(fù)效果沒有細(xì)胞支架效果好。清創(chuàng)組RANKL/OPG比值顯著上調(diào)，破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的顯著增加促使骨吸收加劇，造成骨質(zhì)嚴(yán)重破壞。這與本實(shí)驗(yàn)中Micro-CT和組織學(xué)結(jié)果一致，骨缺損創(chuàng)口不僅未能愈合，且骨缺損范圍呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)。

4 結(jié) 論

外周骨來源BMSCs對(duì)BRONJ具有一定的治療效果，促進(jìn)BRONJ大鼠清創(chuàng)后的骨缺損修復(fù)。RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路可能在BRONJ病程發(fā)展中起重要作用。