孫淑欣，劉慧聰，馮雪鋒，張志芳，賈海麗

（商丘學院，河南商丘 476000）

設施栽培是綜合應用工程裝備、生物及環(huán)境技術，創(chuàng)造適宜的蔬菜生長環(huán)境，實現(xiàn)蔬菜高效生產(chǎn)的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式。黃瓜（L.）因其產(chǎn)量高，經(jīng)濟利益高，市場需求高，在我國蔬菜產(chǎn)業(yè)中占有重要地位，也是我國設施栽培的主要蔬菜作物之一。由于生產(chǎn)條件限制、種植習慣以及經(jīng)濟利益因素，設施栽培種植面積逐年增加。

設施栽培蔬菜比傳統(tǒng)種植產(chǎn)量高、質量好、上市早，但其也存在諸多不足，設施栽培黃瓜易出現(xiàn)病蟲害，有明顯連作障礙現(xiàn)象。連作障礙形成的主要原因是土壤微生物群落結構和功能類群發(fā)生變化，導致土壤微生態(tài)系統(tǒng)失衡。土壤微生物在土壤中扮演著重要角色，對土壤養(yǎng)分的吸收轉化及作物生長發(fā)育具有顯著影響。研究表明，連作使屬水平上真菌和細菌群落結構發(fā)生變化，根際土壤微生物群落多樣性降低，有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加。連作也會使土壤發(fā)生酸化，鹽分積累，并且隨著連作年限的增加，土壤酸化和鹽漬化會加重，同時連作易引起作物營養(yǎng)元素缺乏、化感及自毒作用。微生物是評價土壤肥力的一種關鍵指標，也是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，研究土壤微生物群落結構變化有助于明確設施栽培中連作障礙發(fā)生機制，能夠更好的種植作物，以獲得更高產(chǎn)量，同時也在一定程度上提升作物的品質。

因此，本研究以設施栽培黃瓜不同連作年限的根際土壤為研究對象，通過形態(tài)學鑒定研究黃瓜不同連作年限對根際土壤真菌多樣性及群落結構組成的影響，以此初步探索黃瓜連作障礙的形成機制，以期為后期緩解設施黃瓜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采集于2021 年3 月，采集地點為河南省洛陽市洛龍區(qū)李樓鎮(zhèn)董村，在設施栽培黃瓜連作5 年、12 年以及未栽培過蔬菜的溫室外土壤采用“五點取樣法”進行土樣的采集。取距離地面4～10 cm 的土壤，最后混合土樣，去除雜草后，立即放入干冰中速凍，帶回實驗室放入-80℃冰箱中保存，用于微生物多樣性的研究，不同土樣分別做上標記，并詳細記錄樣品采集的日期、地點及相關信息。

1.2 土壤真菌分離

采用稀釋平板法，孟加拉紅培養(yǎng)基進行土壤真菌分離。稱取1 g 土壤置于9 mL 無菌水中，充分震蕩混勻，用移液槍吸取1 mL的懸浮液置于另一9 mL的無菌水中，充分震蕩混勻，再從此懸浮液中吸取1 mL懸浮液置于新的9 mL的無菌水中，同樣震蕩搖勻，同樣的方法稀釋至10，選用10、10、10、10四個梯度，每個梯度涂布10 個平板，標明日期、土樣及濃度，然后用移液槍分別從相應的土壤稀釋液中吸取200 μL，用涂布器涂布均勻，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，然后對真菌菌落進行計數(shù)，之后轉移到PDA 培養(yǎng)基上進行純化。

1.3 土壤真菌純化與鑒定

涂布5 d 后觀察菌落生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色以及長出時間不同，用挑針挑取菌落邊緣菌絲在新PDA 培養(yǎng)基25℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，純化后3～5 天對純化的菌落進行形態(tài)特征觀察，并做相應記錄。然后通過顯微鏡，觀察純化菌菌絲結構和孢子形態(tài)特征，根據(jù)真菌形態(tài)分類學原理，參照相關資料對分離的真菌進行形態(tài)學鑒定，初步確定各分離菌的種屬地位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

真菌培養(yǎng)5 d 后開始統(tǒng)計并記錄菌落數(shù)，并分別對三種土樣中分離出來的土壤真菌菌落數(shù)量進行分析比較，分離率計算公式如下：

真菌分離率（%）=某一分離真菌的菌落數(shù)/所有分離真菌的菌落數(shù)×100

采用多樣性指數(shù)（'）、豐富度指數(shù)（）、均勻度指數(shù)（）和Jaccard 相似性指數(shù)（）對土壤真菌群落結構特征進行分析。

＝/其中，為第種物種個體數(shù)，為總個體數(shù)，為每個樣品中的物種總數(shù)。

其中a，b 表示兩種生境類型中的真菌的屬數(shù)或種數(shù)；c 表示兩種生境中共有的真菌屬數(shù)或種數(shù)。

根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理：當為0.00～0.25 時，為極不相似；當為0.25～0.50 時，為中等不相似；當為0.50～0.75 時，為中等相似；當為0.75～1.00 時，為極相似。

2 結果和分析

2.1 不同連作年限土壤真菌群落結構組成

通過對設施栽培黃瓜連作5 年、12 年以及未栽培過蔬菜的溫室外土壤進行采集，經(jīng)分離、純化，大田土樣共分離出了75 株菌株，黃瓜連作5 年的土樣分離出96 株菌株，黃瓜連作12 年的土樣分離出236 株菌株。經(jīng)形態(tài)學鑒定，3 種土樣在屬水平上共包含12 屬31 種（如圖1 至圖12），其它139 株不產(chǎn)生子實體結構，統(tǒng)一歸為不產(chǎn)孢類群真菌。其中大田土樣分離和鑒定出10 屬17 個種，已鑒定屬包括根霉屬、毛殼菌屬、串珠菌屬、青霉屬、曲霉屬、殼色多隔孢屬、毛霉屬、地霉屬、輪枝孢屬和鏈格孢屬；設施黃瓜連作5 年的土樣初步鑒定出8 屬15 個種，已鑒定屬包括曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、地霉屬、輪枝孢屬、腐霉屬和鏈格孢屬；設施黃瓜連作12 年的土樣經(jīng)鑒定初步得出5 屬16 種，包括曲霉屬、青霉屬、串珠菌屬、毛霉屬和鐮孢屬。

圖1 青霉屬分生孢子及分生孢子梗

圖2 曲霉屬分生孢子及分生孢子梗

圖3 根霉屬菌落形態(tài)、假根及孢囊孢子

圖4 串珠菌屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖5 鏈格孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖6 毛殼菌子囊殼及子囊孢子

圖7 腐霉屬菌落形態(tài)及孢子囊、菌絲

圖8 殼色多隔孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖9 鐮孢屬菌落形態(tài)及分生孢子

圖10 地霉屬菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子

圖11 枝孢屬菌落形態(tài)及孢子

圖12 毛霉屬孢囊梗、菌絲及孢子囊

由表1 可看出，經(jīng)過分離和初步形態(tài)學鑒定，在分離獲得的大田土壤真菌類群中，地霉屬、毛殼菌屬、青霉屬和無孢類群為優(yōu)勢種群，地霉屬真菌數(shù)量最多，占大田土壤真菌總菌株數(shù)的40.00%，青霉屬和毛殼菌屬數(shù)量相差不大，其分離率分別為12.00%和13.33%；輪枝孢屬、毛霉屬和鏈格孢屬為亞優(yōu)勢種群，其余的為弱勢種群。

表1 不同連作年限土壤真菌群落結構組成

與大田土壤真菌相比，設施黃瓜連作5 年的土壤中曲霉屬和根霉屬的種類和數(shù)量均有增加，總的真菌種類有所減少。其中曲霉屬和無孢類群真菌為優(yōu)勢種群，分別占黃瓜連作5 年土壤總菌株數(shù)的43.75%和20.83%；根霉屬和輪枝孢屬為亞優(yōu)勢種群，其分離率分別為11.46%和13.54%；青霉屬、鏈格孢屬、腐霉屬、地霉屬和毛霉屬真菌為弱勢種群，其分離率分別為4.17%、3.13%、1.04%、1.04%和1.04%。

設施黃瓜連作12 年的土樣中曲霉屬和無孢類群真菌為優(yōu)勢種群，占黃瓜連作12 年土壤真菌總菌數(shù)的分離率分別為41.53%和46.61%；青霉屬真菌為亞優(yōu)勢種群，其分離率為8.47%，其余各屬為弱勢種群。

2.2 不同連作年限土壤真菌群落多樣性分析

連作年限不同的黃瓜根際土壤真菌種群的多樣性水平存在差異，如表2 所示。隨著連作年限的增加，土壤真菌屬水平種類逐漸減少，菌株數(shù)逐漸增加，某些真菌種群積累；同樣，隨著連作年限的增加，土壤真菌群落的多樣性指數(shù)（′）、均勻度指數(shù)（）和豐富度指數(shù)（）均逐漸降低，大田土壤多樣性指數(shù)最高，其數(shù)值為1.85，均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)也是最高，其值分別為0.77、2.32。

表2 不同連作年限土壤真菌群落多樣性

2.3 不同連作年限土壤真菌相似性分析

經(jīng)過土壤真菌的分離鑒定，大田土壤真菌與設施黃瓜連作5 年的土壤真菌有3 種菌相同；大田土壤真菌與設施黃瓜連作12 年的土壤有2 種真菌相同；設施黃瓜連作5 年的土壤真菌與設施黃瓜連作12 年的土壤有2 種真菌相同。由Jaccard 相似性指數(shù)公式可得不同連作年限土壤的真菌群落相似性系數(shù)（表3）。

表3 不同連作年限土壤的真菌群落相似性系數(shù)

通過比較不同土壤真菌的發(fā)現(xiàn)大田和設施黃瓜連作5 年、設施黃瓜連作5 年和設施黃瓜連作12 年的相似性指數(shù)均在0.25～0.50，根據(jù)Jaccard 相似性系數(shù)原理，這兩種為中等不相似；而大田和設施黃瓜連作12 年的相似性指數(shù)在0～0.25，其為極不相似?？梢钥闯鰞烧咧g連作年限越長，土壤真菌差別越大相似性越低。

3 結論與討論

設施連作栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其是專業(yè)化生產(chǎn)比較明顯的地區(qū)或生產(chǎn)單位廣泛應用的一種種植方式。長時間的連作會使土壤水分大量的消耗；營養(yǎng)物質的不均衡消耗；連作也會使植物體內積累有毒物質，產(chǎn)生自毒作用；連作會導致作物病蟲草害加重；連作同樣會導致土壤供肥能力的降低，以及導致土壤理化性質的改變。

土壤微生物結構穩(wěn)定性和功能多樣性對維持土壤系統(tǒng)健康有極其重要的作用，而土壤微生物結構和活性的穩(wěn)定性取決于微生物多樣性。本研究通過對設施黃瓜不同連作年限土樣的分離鑒定，研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，真菌種類多樣性逐漸降低，但是真菌總數(shù)量逐漸增加，這與連作對菠蘿、植煙土壤微生物群落結構的影響結果相似。隨著連作年限的增加，土壤中優(yōu)勢種群發(fā)生變化，曲霉屬真菌逐漸成為優(yōu)勢種群，根霉屬、鐮孢屬、輪枝孢屬、鏈格孢屬等病原菌數(shù)量逐漸增加，這與鄭立偉等人研究結果一致。鐮刀菌能夠引起莖基腐病和枯萎病等病害，鏈格孢屬真菌是引起植物葉枯病的主要病原菌等，對作物生產(chǎn)造成嚴重的損失。

綜上所述，設施黃瓜長期連作的土壤中真菌種群產(chǎn)生了顯著的影響。隨著連作年限的增加，土壤中優(yōu)勢種群發(fā)生變化，病原微生物數(shù)目增加，逐漸成為優(yōu)勢種群，但土壤中真菌種類越來越少，多樣性降低；連作年限間隔期越長，兩種土壤之間的相似性越低；隨著連作年限的增加，土壤真菌群落的多樣性指數(shù)（′）逐漸降低，病原菌均勻度指數(shù)（）和豐富度指數(shù)（）逐漸增加，這與Liu Hang等研究結果基本一致。連作使病原菌種群數(shù)目富集，但有益真菌種群數(shù)目減少，連導致真菌種群平衡被破壞，植物根際微生態(tài)平衡被破壞，不利于作物的生長。

本研究通過對大田和設施黃瓜連作土壤真菌的分離鑒定，初步分析出了設施黃瓜連作對土壤真菌多樣性的影響，對于指導設施黃瓜栽培地土壤多樣性的生產(chǎn)和科學防治土傳病害具有重要作用。