張宇慧，馬鑫旺，夏志蘭，黃民鳳，蘇榮榮

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展服務(wù)中心，湖南 長沙 410006；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙410128；3.貴州黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院，貴州 興義 562400）

姬松茸（Agaricus blazeiMurill）又名巴西蘑菇，是一種起源于巴西的可食用蘑菇。其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，在抗腫瘤活性、抗凋亡作用和防治心血管疾病等方面發(fā)揮著重要的作用。有研究指出，姬松茸菌絲體對(duì)重金屬鎘的富集能力較強(qiáng)，子實(shí)體中鎘含量較高，易超過食用標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致姬松茸相關(guān)產(chǎn)品出現(xiàn)食品安全問題。因此，探究姬松茸鎘脅迫相關(guān)的生理及分子響應(yīng)機(jī)制，為姬松茸重金屬脅迫相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)，對(duì)解決實(shí)際生產(chǎn)問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，已有研究人員對(duì)不同生長發(fā)育時(shí)期的巴西菇和雙孢蘑菇等真菌子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并針對(duì)子實(shí)體褐變這一現(xiàn)象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，但對(duì)于真菌菌絲在鎘脅迫下的生理及分子響應(yīng)機(jī)制相關(guān)報(bào)導(dǎo)較少，為了進(jìn)一步了解姬松茸富集重金屬的機(jī)理，筆者以前期篩選出的鎘高、低富集菌株為材料，分別對(duì)其進(jìn)行鎘脅迫處理，通過Illumina 高通量測序技術(shù)分析不同菌株菌絲樣品的差異表達(dá)基因，以明確姬松茸菌絲富集重金屬的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試姬松茸菌株為J4、J11，其中J4 菌株子實(shí)體的鎘含量較低，J11 菌株子實(shí)體的鎘含量較高[1]。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 值自然。（2）液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，玉米粉2%，酵母膏0.75%，豆餅粉2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 值自然。（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，玉米粉2%，酵母膏0.75%，豆餅粉2%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH 值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化在母種試管中挑取黃豆大小的菌絲塊接種于裝有20 mL 固體培養(yǎng)基的平皿中，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，待菌絲長滿整個(gè)平皿后用9 mm 打孔器取同一圈內(nèi)的菌絲接種于裝有100 mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，靜置24 h 后于25℃恒溫、140 r/min 的搖床中培養(yǎng)12 d。

1.2.2 鎘脅迫處理在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 mL的鎘溶液（CdCl2母液1 g/L），同時(shí)設(shè)置不添加鎘處理的對(duì)照，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。接種量為10%，250 mL 的三角瓶裝液量共100 mL（即鎘脅迫濃度為2 mg/L），置于28℃恒溫、140 r/min 的搖床中培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)結(jié)束后過濾發(fā)酵液并收集菌絲，于-80℃冰箱中保存待用。

1.2.3 總RNA 的提取及檢測選用天根 DP441 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒按照產(chǎn)品操作步驟提取姬松茸菌絲的RNA，2 個(gè)品種2 種處理（鎘脅迫與對(duì)照）共4 個(gè)樣品，每個(gè)樣品作3 次生物學(xué)重復(fù)，共獲得12 個(gè)樣品的總RNA。使用Agilent 2100 分光光度計(jì)檢測RNA 的濃度及OD260/280、OD260/230比值，進(jìn)一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的降解程度及污染情況。隨后進(jìn)行RNA 文庫構(gòu)建，庫檢合格后，將樣品委托至北京百邁克生物科技有限公司，采用Illumina HiSeq 進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析及qRT-PCR 驗(yàn)證

1.3.1 測序數(shù)據(jù)分析高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過CASAVA 堿基識(shí)別后，轉(zhuǎn)化為原始測序序列，對(duì)原始數(shù)據(jù)過濾，得到clean reads，對(duì)其進(jìn)行序列組裝，構(gòu)建Unigene 庫。利用BLAST[2]軟件將Unigene 序列與NR[3]、Swiss-Prot[4]、GO[5]、COG[6]、KOG[7]、eggNOG4.5[8]、KEGG[9]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，使用KOBAS2.0[10]得到Unigene 在KEGG 中 的KEGG Orthology 結(jié) 果，預(yù) 測完Unigene 的氨基酸序列之后使用HMMER[10]軟件與Pfam[11]數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得Unigene 的注釋信息。采用DESeq 進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，獲得2 個(gè)條件之間的差異表達(dá)基因集，以FDR（False Discovery Rate）作為degs 篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，在篩選過程中，挑選FDR ＜0.05 且FC（Fold Change）≥2 的差異基因構(gòu)建火山圖、GO 分類圖、COG 分類圖、KEGG 富集圖，推斷各差異基因的分布情況，并進(jìn)行分析。

1.3.2 qRT-PCR 驗(yàn)證同1.2.3 方法提取樣品總RNA，選用來自天根生化（北京）科技有限公司的FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑（KR118）試劑盒將樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板，將模板稀釋為1 ng，保存于-20℃冰箱中備用。選取10 個(gè)與鎘脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 來驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。基因信息及引物如表1所示。選用Ab28S作為內(nèi)參[12]，按照2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 引物

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下姬松茸菌株差異表達(dá)基因的數(shù)量

完成12 個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，原始數(shù)據(jù)過濾（除去帶有接頭的，低質(zhì)量的reads）后，得到clean reads，其中Q20 均在98%以上，Q30 均高于94%。測序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估合格。對(duì) Unigene 進(jìn)行功能注釋，包括與NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO 數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，共獲得26 776 條Unigene 的注釋結(jié)果。

為了探究姬松茸菌絲在鎘脅迫下轉(zhuǎn)錄水平的變化，以FDR ＜0.05，|FoldChange|≥2 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)2 個(gè)姬松茸品種菌絲進(jìn)行差異基因的篩選。鎘低富集品種的姬松茸菌絲J4-CK 與J4-Cd 中共檢測到623個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因244 個(gè)，下調(diào)基因379 個(gè)。鎘高富集品種J11-CK 與J11-Cd 中共檢測到1 386 個(gè)差異表達(dá)基因，其中580 條基因表達(dá)為上調(diào)，806 條表達(dá)為下調(diào)基因。J4-CK VS J4-Cd 與J11-CK VS J11-Cd 差異表達(dá)基因中共有的為264 個(gè)，J4-CK VS J4-Cd 特有的差異表達(dá)基因?yàn)?59 個(gè)，J11-CK VS J11-Cd 特有的差異表達(dá)基因?yàn)? 122 個(gè)（圖1A）。J4-CK、J4-Cd、J11-CK、J11-Cd 這4 個(gè)樣品通過測序組裝分別得到7 762、14 117、8 843、8 007 個(gè)Unigene。4個(gè)樣品共有表達(dá)基因?yàn)? 420 個(gè)，J4-CK VS J4-Cd 共有7 563 個(gè)Unigene，J11-CK VS J11-Cd 共有7 887 個(gè)Unigene（圖1B）。

圖1 鎘脅迫下鎘高、低富集姬松茸菌株差異表達(dá)基因的韋恩圖

2.2 鎘脅迫下姬松茸菌株差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

GO（gene ontology）是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。根據(jù)GO 功能注釋，從生物過程、細(xì)胞組成和分子功能3 個(gè)部分分析鎘高、低富集姬松茸品種的菌絲鎘富集情況。在J4-CK VS J4-Cd（圖2A）所有的差異表達(dá)基因中，共有343 個(gè)基因有GO 功能注釋；生物過程、分子功能和細(xì)胞組成分別有12、12、9 個(gè)注釋條目；其中，差異基因在生物學(xué)過程中主要注釋在代謝過程、信號(hào)生物過程等條目中；細(xì)胞組分中注釋的差異基因主要富集在細(xì)胞及細(xì)胞膜成分、細(xì)胞及細(xì)胞成分等條目中；分子功能注釋得到的差異基因主要富集在催化活性及結(jié)合等條目中。在J11-CK VS J11-Cd（圖2B）所有的差異表達(dá)基因中，共有809 個(gè)基因有GO功能注釋；生物過程、分子功能和細(xì)胞組成分別有14、14、10 個(gè)注釋條目；注釋最多的條目分別是代謝過程、信號(hào)生物過程、細(xì)胞及細(xì)胞成分、催化活性及結(jié)合等。

生物過程中的代謝過程、單有機(jī)體過程、細(xì)胞過程，細(xì)胞組成中的膜、膜部分、細(xì)胞、細(xì)胞部分，分子功能中的催化活性、蛋白結(jié)合等均是J4 與J11 這2個(gè)品種差異表達(dá)基因GO 富集注釋最多的種類。然而，J11 菌株的 GO 功能注釋中有6 個(gè)條目是J4 菌株GO功能注釋中所沒有的，這6 個(gè)條目分別是生物過程中的發(fā)育過程、生長，細(xì)胞組成中的病毒、病毒體部分，分子功能中的分子傳感器活性、蛋白標(biāo)記。

對(duì)J4-CK VS J4-Cd 與J11-CK VS J11-Cd 共 有 的差異基因進(jìn)行表達(dá)GO 分類（圖2C）發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)過程中代謝過程與單有機(jī)體過程注釋的比較多，在細(xì)胞組成中膜與膜部分注釋的比較多，分子功能中注釋最多的前2 個(gè)條目分別為催化活性與結(jié)合。楊淑芳[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬銅處理下，小麥根尖細(xì)胞壁細(xì)胞膜受到破壞，細(xì)胞膜的膜層呈游離狀態(tài)，推測細(xì)胞膜與重金屬脅迫有關(guān)。

圖2 鎘脅迫下鎘高、低富集姬松茸菌株差異表達(dá)基因GO 分類圖

2.3 鎘脅迫下姬松茸菌株差異表達(dá)基因的COG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析

通過K-均值聚類分析，將姬松茸J4-CK VS J4-Cd 菌絲的623 條差異表達(dá)基因到COG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖3A 所示，分為19 大類，其中排前3位的COG 分別為：次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，一般功能預(yù)測，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化。排第4 位的是防御機(jī)制。

將J11-CK VS J11-Cd 的1 386 條差異表達(dá)基因進(jìn)行COG 分類注釋，結(jié)果如圖3B 所示，發(fā)現(xiàn)次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，一般功能預(yù)測，糖類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝占比排前4 位；胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和泡內(nèi)運(yùn)輸占比最少。其中，上調(diào)占比最多的注釋條目是蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)、分子伴侶，下調(diào)占比最多的注釋是次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解。

將J4-CK VS J4-Cd 與J11-CK VS J11-Cd 共 有 的264 條差異基因比對(duì)到COG 數(shù)據(jù)庫，結(jié)果如圖3C 所示，共分為17 大類。其中，次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，防御機(jī)制，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化占比排名前3 位。

圖3 鎘脅迫下鎘高、低富集姬松茸菌株差異表達(dá)基因COG 的分類圖

從以上結(jié)果可知，鎘脅迫引起了姬松茸菌絲的次生代謝生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)、分子伴侶等相關(guān)基因的差異表達(dá)。

2.4 鎘脅迫姬松茸菌株差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

生物體內(nèi)，KEGG 的Pathway 富集通路可以具體到差異表達(dá)基因參與的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑代謝通路。通過富集因子（Enrichment factor）可以分析差異基因代謝通路的富集程度。富集因子即差異表達(dá)基因中注釋到某通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。富集因子越大，說明差異表達(dá)基因在該通路中的富集程度越高。此外，多重假設(shè)檢驗(yàn)校正q 值越小，表明差異表達(dá)基因顯示的顯著差異性更

加可信。

鎘脅迫下姬松茸菌絲體內(nèi)富鎘特性十分復(fù)雜，對(duì)J4-CK VS J4-Cd、J11-CK VS J11-Cd 以及二者共有的差異表達(dá)基因的上下調(diào)差異基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果如圖4 所示。從圖4A 中發(fā)現(xiàn)，J4-CK VS J4-Cd上調(diào)差異基因富集在類固醇生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、泛醌和其他萜烯類醌生物合成等通路；下調(diào)基因富集在氰基氨基酸代謝、甲烷代謝、碳代謝、淀粉和蔗糖代謝、組氨酸代謝、氧化磷酸化途徑等通路。從圖4B 中發(fā)現(xiàn)，J11-CK VS J11-Cd 上調(diào)基因主要富集在抗生素的生物合成、類固醇的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、萜類化合物的生物合成、氨基酸的生物合成、酮體的合成與降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、硫代謝等通路；下調(diào)基因主要富集在谷胱甘肽代謝、甲烷代謝、酪氨酸代謝、磷酸肌醇代謝、不飽和脂肪酸生物合成途徑、糖酵解和糖質(zhì)新生、抗壞血酸和醛酸代謝、碳代謝、MAPK 信號(hào)通路等通路。

圖4 差異基因KEGG 散點(diǎn)富集圖

與J4-CK VS J4-Cd 相比，J11-CK VS J11-Cd 特有的上調(diào)差異表達(dá)通路為抗生素的生物合成，特有的下調(diào)差異表達(dá)通路為谷胱代謝、酪氨酸代謝、磷酸肌醇代謝等通路。而與J11-CK VS J11-Cd 相比，J4-CK VS J4-Cd 特有的上調(diào)差異表達(dá)代謝途徑為泛醌和其他萜烯類醌生物合成，特有的下調(diào)差異表達(dá)代謝途徑為氧化磷酸化代謝途徑。

從圖4C 中可以看到，差異表達(dá)基因主要富集在類固醇生物合成、抗生素的生物合成、碳代謝、谷胱甘肽代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、甲烷代謝、淀粉和蔗糖的代謝等通路。其中類固醇生物合成、抗生素的生物合成途徑上調(diào)，甲烷代謝、淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、谷胱甘肽、乙醛酸和二羧酸等代謝途徑下調(diào)。

2.5 qRT-PCR 熒光定量驗(yàn)證

將熒光定量的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果2-△△CT用log2（FC）做標(biāo)準(zhǔn)化處理與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致化。從圖5 可以看出，雖然10 個(gè)基因熒光定量的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果有一定的誤差，但是總體趨勢(shì)是一致的，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是可靠的。

圖5 差異基因表達(dá)量qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

真菌的鎘富集機(jī)制是一個(gè)比較復(fù)雜的過程。研究結(jié)果顯示，姬松茸菌株在2 mg/L 的鎘脅迫下，2 個(gè)姬松茸菌株響應(yīng)鎘富集的機(jī)制存在較大差異，與J4-CK VS J4-Cd 相比，J11-CK VS J11-Cd 差異基因顯著表達(dá)的代謝通路更多。通過J4-CK VS J4-Cd 與J11-CK VS J11-Cd 共有差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)：鎘脅迫抑制姬松茸菌株的甲烷代謝、淀粉和蔗糖代謝等途徑，卻促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工及內(nèi)固醇生物合成途徑，可能通過改變菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)菌絲對(duì)鎘脅迫的耐受力。J11-CK VS J11-Cd的半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑中的基因表達(dá)均上調(diào)。半胱氨酸是谷氨酸合成前體氨基酸之一，谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的含有γ-酰胺鍵和巰基的三肽，在螯合酶的催化下形成螯合肽（PC），螯合肽與重金屬離子結(jié)合形成無毒的化合物，從而可以清除鎘脅迫下菌絲體內(nèi)的活性氧自由基，保證菌絲的正?；盍ΑＲ虼?，半胱氨酸在菌株對(duì)抗鎘脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。在J11-CK VS J11-Cd 中，抗生素的生物合成途徑差異基因富集較多，表明抗生素與次級(jí)代謝產(chǎn)物可能在體內(nèi)起到保護(hù)細(xì)胞機(jī)體免受重金屬毒害的作用。該推測與劉俊敏[14]研究雙孢蘑菇鎘耐性的結(jié)果一致。谷胱甘肽代謝通路是真菌以及植物自身適應(yīng)鎘脅迫的重要防御機(jī)制，這在雙孢蘑菇[14]、酵母[15]、南極酵母[16]、水稻[17]、菜心[18]、紅麻[19]中都有報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)在J11-CK VS J11-Cd 的KEGG 富集中谷胱甘肽代謝途徑下調(diào)，可能是由于一部分谷胱甘肽與重金屬鎘離子形成PC-Cd 低分子量復(fù)合物，從而影響了其下游代謝[20]。

研究以前期篩選出的鎘高、低富集姬松茸菌株（J11、J4）為材料進(jìn)行2 mg/L 的鎘脅迫處理，以未添加外源鎘作對(duì)照，采用Illumina 高通量測序技術(shù)對(duì)其菌絲樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，J4-CK VS J4-Cd 鎘脅迫響應(yīng)的代謝途徑有類固醇生物合成、谷胱甘肽代謝、抗生素的生物合成、碳代謝等；J11-CK VS J11-Cd 響應(yīng)的代謝途徑有類固醇生物合成、抗生素的生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、硫代謝等；采用qRT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)10 個(gè)鎘脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行基因表達(dá)水平的驗(yàn)證，包括谷胱甘肽代謝、細(xì)胞色素P450、硫氨酸合成酶、多酚氧化酶、甲烷代謝、氮代謝等，得到的基因表達(dá)水平變化的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序得出的差異基因變化趨勢(shì)基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是可靠的。該研究對(duì)姬松茸菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，下一步可以對(duì)姬松茸子實(shí)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，以期發(fā)掘姬松茸子實(shí)體的耐鎘及富鎘的關(guān)鍵基因。將姬松茸子實(shí)體的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)構(gòu)與菌絲體的轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果進(jìn)行整合與比對(duì)，進(jìn)一步完善姬松茸不同生育時(shí)期對(duì)重金屬鎘的調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。