黃 鑫，鄭麗寧，顧學虎，許煊煒，張 浩*，王迎春

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，長春 130118；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人參鹿茸監(jiān)督檢驗測試中心，長春 130118；3. 吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學院，白城 137000）

番茄灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的一種真菌性病害?；颐共【虏∧芰^強，一旦侵入番茄組織就會迅速讓植株產(chǎn)生病狀并能夠快速產(chǎn)生新的分生孢子進行多次侵染[1]。低溫、高濕有利于該病害的發(fā)生[2]，在春冬季節(jié)易發(fā)生、甚至暴發(fā)，可導致果實減產(chǎn) 20%～30%，病害發(fā)生嚴重時可減產(chǎn) 50%～60%[3]。該病害在番茄產(chǎn)后貯存和運輸過程中依然可以發(fā)生，一旦條件適宜，番茄灰霉病菌就會大量繁殖導致果實腐爛，進而造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]。

目前，噴施化學農(nóng)藥是防治番茄灰霉病的主要方法[5]，但長期大量使用殺菌劑會產(chǎn)生一系列問題，如危害人類健康、破壞生態(tài)環(huán)境、使灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性等。紀明山等[6]報道從遼寧省田間采集的番茄灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率已經(jīng)達到84.84%，對嘧霉胺的抗性頻率已高達100%；馮寶珍等[7]報道山西運城地區(qū)的番茄灰霉病對啶酰菌胺的抗性頻率已經(jīng)達到77.14%。篩選高效、低毒防治藥劑和防治方法成為目前生產(chǎn)中防治番茄灰霉病急需解決的問題[8]。生防菌具有低毒、高效等特點，目前已經(jīng)被廣泛研究，但因其受環(huán)境影響較大，防治效果不穩(wěn)定，使得其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用受到限制[9]；部分殺菌劑對真菌的抑制作用強，對細菌幾乎無抑制作用，因而采用生防細菌與殺菌劑復配可能是一種有效防治番茄灰霉病的措施[10]。前人研究表明部分化學殺菌劑與生防菌聯(lián)合使用可在降低農(nóng)藥使用量的同時提高防效，如王兵[11]報道以25%氰烯菌酯與綠色木霉LZT-3聯(lián)合使用防治水稻惡苗病、以25%嘧菌酯與長枝木霉CZT-2聯(lián)合使用防治紋枯病、以 50%醚菌酯與枯草芽胞桿菌 ZKC-1聯(lián)合使用防治胡麻斑病和稻瘟病有明顯的增效效果，其抑菌率分別可達94.96%、86.82%和95.00%；陳美云[12]將枯草芽胞桿菌LV與99%噁霉靈聯(lián)合使用對生姜莖基腐病的防病效果可達到77.32%，同時具有一定的促生作用；張萌等[13]使用熒光假單胞菌YG-1與啶酰菌胺聯(lián)合使用防治番茄灰霉病，可減少一半施藥量且防效可達 71.31%，較啶酰菌胺單劑提高了 22.45%；Ji等[14]將氟醚菌酰胺與甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌TA-1聯(lián)合使用，使田間番茄灰霉病發(fā)病率降低20%左右。生防菌和化學殺菌劑復配在一定程度上解決了用藥量過多導致病原菌抗藥性急劇增長和生防菌見效慢的問題。

生防菌D25是從番茄根際土壤中分離得到的菌株，屬于泛菌屬，對番茄灰霉病有較強防治作用[15]。為了減少化學殺菌劑用量，同時提高生防菌的防治效果，本研究從12種殺菌劑中篩選出與生防菌D25具有較好生物相容性的殺菌劑，明確了復配的最適配比及其防病效果，為番茄灰霉病的科學防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和泛菌Pantoea jilinensisD25，由吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥生測實驗室分離保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1000 mL。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化鈉 10.0 g、瓊脂15.0～20.0 g、蒸餾水1000 mL。

供試番茄品種：京丹綠寶石2號，由吉林農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供。

供試殺菌劑見表1。

表1 供試殺菌劑Table 1 The tested fungicides

1.2 試驗方法

1.2.1 不同殺菌劑對番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定 采用含毒介質(zhì)法[16]，測定 12種殺菌劑對番茄灰霉病菌的抑制率。向冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基中加入配制好的不同濃度梯度的藥液（表2），混合均勻后倒板，對照組平板使用無菌水制備。將直徑為5.0 mm的番茄灰霉病菌餅接種在制備好的含藥PDA平板中央，每個濃度重復3次，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d后測量真菌菌落直徑，計算抑菌率[17,18]。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

表2 殺菌劑的濃度梯度Table 2 The concentration gradient of fungicide

1.2.2 泛菌D25與殺菌劑相容性測定 對番茄灰霉病菌毒力較高的殺菌劑，測定其與泛菌D25的相容性。采用混和平板法測定微生物殺菌劑與泛菌D25的相容性[19]。具體方法如下：向已冷卻至50℃左右的90 mL PDA培養(yǎng)基中加入10 mL OD600=1.48的泛菌D25菌懸液，混和均勻后倒板，然后分別吸取配置好的10 μL枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌菌液點在平板中央，28 ℃黑暗條件下進行培養(yǎng)，48 h后觀察有無抑菌圈出現(xiàn)。采用平板計數(shù)法測定泛菌D25與化學殺菌劑的相容性。在LB平板中加入化學殺菌劑，使其終濃度為50、100、150、200、250 mg/L；將1 mL OD600=1.48的泛菌D25菌液進行10倍系列稀釋6次，取100 μL稀釋后的菌懸液均勻涂布于LB平板上，以無菌水為對照，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，48 h后測定泛菌D25的菌落數(shù)，計算每毫升菌液D25的存活量，每組重復3次。采用DPS軟件統(tǒng)計分析生物相容性。

1.2.3 泛菌D25與殺菌劑復配比例篩選 根據(jù)12種殺菌劑的室內(nèi)毒力測定結(jié)果以及泛菌D25與殺菌劑間的相容性試驗結(jié)果，選擇對番茄灰霉病菌毒力最高且對泛菌 D25菌體生長影響最小的嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25進行復配，為能夠清晰地看出復配劑對番茄灰霉病菌的影響，嘧環(huán)·咯菌腈的濃度以EC50=0.043 mg/L進行配制，泛菌D25濃度同樣選擇對番茄灰霉病菌抑制率在50%左右的濃度（7.0×104CFU/mL）。按照嘧環(huán)·咯菌腈與D25的體積比V:V=10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10進行復配比例的篩選。根據(jù)張萌等[13]方法計算毒性比率。

1.2.4 盆栽試驗 將直徑為5.0 mm的番茄灰霉病菌菌餅接種在制備好的PDA培養(yǎng)基中央，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d后，向培養(yǎng)皿中加入10 mL 0.5%的吐溫80，靜置2 min，然后將其菌絲和孢子刮下，用4層紗布過濾，獲得孢子懸液，采用血細胞儀計數(shù)法將濃度調(diào)至5×106孢子/mL，備用[20]。

番茄種子用0.5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，然后用無菌水沖洗干凈，置于兩層濕濾紙間，于28 ℃培養(yǎng)4 d，發(fā)芽后播種至9 cm×10 cm花盆中，每盆裝有0.8 Kg滅菌土（V蛭石:V土壤=1:5）。所有花盆放置在25 ℃～30 ℃、光照14 h/d、相對濕度70%左右的溫室中，定期澆水，待番茄幼苗長至6葉期進行防病試驗。分別設置一組治療處理和一組預防處理，探究殺菌劑與泛菌 D25復配后的效果。在治療處理中，先將20 mL濃度為5×106孢子/mL的番茄灰霉病孢子懸液均勻噴施在番茄幼苗葉片上直至徑流；48 h后，分別噴施10 mL嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25菌液的復配劑（體積比5:5）、10 mL嘧環(huán)·咯菌腈和10 mL泛菌D25，各處理中嘧環(huán)·咯菌腈濃度為0.043 mg/L，D25菌液濃度為7×104CFU/mL。預防處理組則先將復配劑、嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25單劑分別噴施在番茄幼苗葉片上，48 h后噴施濃度為 5×106孢子/mL的番茄灰霉病孢子懸液，各藥劑濃度及用量同治療組，對照組用清水進行處理。每個處理選取9盆番茄，每盆中3株番茄苗，共設3次重復。接種5～7 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，病害分級標準參照GB/T 17980.28-2000。0級：無病斑；1級：單葉片有病斑3個；3級：單葉片有病斑4～6個；5級：單葉片有病斑7～10個；7級：單葉片有病斑11～20個，部分密集成片；9級：單葉片有病斑密集占葉面積四分之一以上。采用DPS軟件統(tǒng)計分析防治效果。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 12種殺菌劑對番茄灰霉病的毒力分析

12種殺菌劑的室內(nèi)毒力見表3。其中枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌兩種微生物菌劑表現(xiàn)出較高的抑菌活性，EC50值分別為4.564×10-5與0.021 mg/L；嘧環(huán)·咯菌腈、啶酰·咯菌腈和啶菌噁唑·咯菌腈3種化學殺菌劑有較高的抑菌活性，EC50值分別為0.043、0.081和0.093 mg/L，均小于0.1 mg/L。而香芹酚和苦參·蛇床素兩種植物源殺菌劑的抑菌活性較低，其EC50值分別為12.469和19.220 mg/L。所以選擇枯草芽胞桿菌、哈茨木霉菌、嘧環(huán)·咯菌腈、啶酰·咯菌腈和啶菌噁唑·咯菌腈與泛菌D25進行生物相容性的測定。

表3 十二種殺菌劑對番茄灰霉病毒力測定結(jié)果Table 3 Toxicity of twelve fungicides to B. cinerea

2.2 泛菌D25與殺菌劑的相容性分析

微生物殺菌劑與泛菌D25相容性測定結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌和哈茨木霉菌對泛菌D25的生長有抑制作用，生物相容性不佳?；瘜W殺菌劑與D25相容性測定結(jié)果表明，在濃度為50 mg/L的異菌脲·腐霉利和啶酰·咯菌腈的平板上，D25的活菌量分別為1.14×109和1.22×109CFU/mL，顯著低于對照組活菌量（P＜0.05）；但在濃度為50 mg/L的嘧環(huán)·咯菌腈的平板上，泛菌D25的活菌量為1.67×109CFU/mL，與對照無顯著差異（表4），表明嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25具有較好的生物相容性。

表4 三種殺菌劑對泛菌D25菌體生長的影響Table 4 Effects of three fungicides on the growth of P. jilinensis D25

2.3 不同比例的嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25復配對番茄灰霉病菌的抑制作用

嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25不同比例復配對番茄灰霉病菌的抑制效果見表5。結(jié)果表明當嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25體積比為9:1、8:2、2:8和1:9時，毒性比率在0.8858～0.9567之間，均小于1，表現(xiàn)為拮抗作用，而7:3、6:4、5:5、4:6、3:7五個比例的毒性比率在1.2224～1.3943之間，均大于1，表現(xiàn)為增效作用，其中比例5:5的毒性比率最大可達1.3943，說明在此比例下嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25的協(xié)同作用最強，防治效果最好。

表5 嘧環(huán)·咯菌腈與泛菌D25復配對番茄灰霉病的抑制作用Table 5 Inhibition of the cyprodinil·fludioxonil and P. jilinensis D25 complex on B. cinerea growth

2.4 盆栽試驗結(jié)果

將0.043 mg/L的嘧環(huán)·咯菌腈與7×104CFU/mL泛菌D25按體積比5:5復配，進行盆栽試驗，測定其預防和治療效果。結(jié)果（表6）表明，預防處理組中，泛菌D25和嘧環(huán)·咯菌腈單劑對番茄灰霉病的防治效果分別為43.00%和53.03%，而復配劑可使病情指數(shù)降低至12.82，防治效果可達72.29%；治療處理組中，泛菌D25和嘧環(huán)·咯菌腈單劑的防治效果略低，分別為40.34%和46.17%，復配劑可使病情指數(shù)降低至17.78，防治效果可達61.57%。上述結(jié)果說明，嘧環(huán)·咯菌腈和泛菌D25復配劑對番茄灰霉病菌的抑制效果最強，復配劑對番茄灰霉病的預防和治療效果無明顯差異。

表6 復配劑對番茄灰霉病的盆栽防治效果Table 6 Efficacy of cyprodinil·fludioxonil and D25 complex on the control of tomato gray mold in pot experiment

3 討論

化學藥劑和生物藥劑復配防治植物病害已經(jīng)在實際生產(chǎn)中得到應用，如紀兆林等[21]連續(xù)3年使用咪鮮胺單劑防治桃枝枯病，發(fā)現(xiàn)藥后35 d防效從55.22%下降至15.74%，而與地衣芽胞桿菌W10復配使用的防治效果能夠穩(wěn)定在30%以上；陳長卿等[22]利用甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌NJ13分別與嘧菌環(huán)胺和苯醚甲環(huán)唑復配對田間人參黑斑病菌的防治效果可達80.39%和89.33%；谷春艷等[23]利用芽胞桿菌WH1G與氟啶胺復配防治草莓灰霉病的田間防效可達69.79%。近年多項研究發(fā)現(xiàn)遼寧、山西等地的灰霉病菌對生產(chǎn)中常用殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性[6,7]，因此減少化學殺菌劑用藥量、提高防效成為生產(chǎn)中亟需解決的問題，但該方面研究非常匱乏。本研究在前期獲得新的生防菌D25[15]基礎上，研究了該菌與常用殺菌劑的復配毒力和溫室防效，明確了復配制劑比例，為番茄灰霉病的防治提供了新的藥劑。

明確殺菌劑的毒力以及殺菌劑與生防菌的相容性是篩選復配制劑的重要指標。本研究測定的2種微生物殺菌劑對番茄灰霉病菌的EC50值最低，殺菌作用強，但是兩種微生物殺菌劑在PDA培養(yǎng)基中抑制泛菌 D25的生長，可能與兩種微生物殺菌劑產(chǎn)生的抗菌代謝物同時具有殺真菌和殺細菌作用[24]有關，因而不適合與泛菌 D25混和使用。植物源殺菌劑具有環(huán)境友好、對非靶標生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，但試驗中使用的香芹酚和苦參·蛇床素的EC50值較高，對番茄灰霉病菌的抑制作用不強，需要使用高劑量才有可能達到較為可觀的防治效果。由于植物源殺菌劑通常以天然植物提取物、稀有植物和高毒植物為材料[25]，產(chǎn)量有限[26]，因而也不適合與泛菌D25聯(lián)合使用。8種化學殺菌劑中，嘧環(huán)·咯菌腈的EC50值最低，并與泛菌D25有較好的生物相容性，室內(nèi)毒力和盆栽試驗結(jié)果表明嘧環(huán)·咯菌腈的用藥量在減少50%情況下，復配制劑的防效顯著高于兩種單劑，具有很大應用潛力，但仍需在田間進行藥效評價。

化學殺菌劑是防治番茄灰霉病的主要藥劑，但藥劑的選擇作用容易導致番茄灰霉病菌產(chǎn)生抗藥性，并逐漸成為田間流行的優(yōu)勢群體，從而使常用的殺菌劑防效下降甚至完全失效[27,28]。為能夠?qū)崿F(xiàn)番茄灰霉病的綠色防治，需要不斷推出科學的防治方案。生防菌 D25與殺菌劑嘧環(huán)·咯菌腈復配制劑的獲得，對番茄灰霉病的有效防控具有重要意義，有望降低殺菌劑用量和成本，達到農(nóng)藥減施增效的目的。