崔明秦，張東華，閆曉慧，洪英娣，馬煥成 ，伍建榕,*，劉 麗*

（1. 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室/西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護學(xué)院，昆明650224；2. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室/西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明650224）

油茶Camellia oleifera，隸屬于山茶目山茶科Theaceae山茶屬Camellia，為常綠小喬木或灌木，是中國特有的木本油料樹種，具有較高的經(jīng)濟和生態(tài)價值[1]。根據(jù)林業(yè)部門的統(tǒng)計截止2020年我國油茶種植面積約達7175萬畝，油茶籽產(chǎn)量314萬噸，茶油產(chǎn)量約72.1噸。油茶炭疽病是油茶栽培過程中最常見的真菌性病害，在各大油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[2]。在不同栽培地區(qū)該病的主要致病菌各不相同，主要包括炭疽菌屬下的果生炭疽Colletotrichum fructicola、山茶炭疽C. camelliae、膠孢炭疽C. gloeosporioides、暹羅炭疽C.siamense等[3]。病菌以分生孢子借助雨水傳播，可進行多次再侵染[4]，并依次危害油茶葉片、枝條及果實，造成油茶大面積落葉、落果、落花和枯枝，導(dǎo)致油茶減產(chǎn)20%～30%，給油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴重的經(jīng)濟損失[5]。

植物內(nèi)生菌是指生活史中一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細胞間隙的一類微生物，主要包括內(nèi)生真菌、細菌和放線菌。內(nèi)生菌在與宿主共生的過程中，可通過為宿主植物提供所需的部分營養(yǎng)物質(zhì)和激素來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[6]，亦可合成和分泌部分抗菌素和酶等活性物質(zhì)進而提高植物對環(huán)境的適應(yīng)能力[7]。相對于宿主，植物微生物群落的快速進化大大加強了這種適應(yīng)性[8]。同時內(nèi)生菌還廣泛參與宿主次生代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化，對宿主植物的種群結(jié)構(gòu)、生存、進化和健康狀態(tài)產(chǎn)生重大影響[9,10]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物受到病原侵染后，會招募有益微生物為植物提供保護[11]。如基于系統(tǒng)發(fā)育芯片法研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥受霜霉菌Hyaloperonospora arabidopsidis侵染后會誘導(dǎo)根際土壤中特定細菌的富集，從而形成可抑病的土壤[12]。甜菜受立枯病菌Rhizoctonia solani侵染后會富集幾種根系內(nèi)生細菌并激活一些生物合成基因簇，從而抑制疾病[13]。相比于備受關(guān)注的植物根部，作為植物全功能體一部分的“葉圍”在植物抗逆過程中的作用同樣不容忽視。

葉片是植物獲取營養(yǎng)和能量代謝的重要場所，其內(nèi)生微生物在植物抗病蟲和抗逆等方面發(fā)揮著重要的作用[14]。Chen等[15]以擬南芥自發(fā)壞死突變體為材料驗證了葉片內(nèi)生細菌的穩(wěn)態(tài)與植物健康息息相關(guān)，提出內(nèi)生細菌群落的失衡是植物葉片表現(xiàn)出類似病害表型的原因。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)水稻白葉枯抗病品種的葉片中拮抗白葉枯病菌的內(nèi)生細菌豐度更高?？梢姡参锶~片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)與植物病害的抗、感性密切相關(guān)。因此，了解植物受到病原浸染后，植物內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)的變化，對病害防治至關(guān)重要。本研究基于高通量測序技術(shù)解析油茶炭疽病侵染后對油茶葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性的影響，并對葉片內(nèi)生細菌群落功能進行預(yù)測。以期揭示油茶葉片內(nèi)生微生物群落對炭疽病的應(yīng)答規(guī)律，為進一步探討油茶炭疽病的生防策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

樣品于2021年9月采自云南省德宏傣族景頗族自治州油茶栽培基地。該地區(qū)為南亞熱帶季風(fēng)氣候類型，雨量充沛，干冷同季，雨熱同期；年溫差小，有霜日少，無霜期長。年平均氣溫 18.4 ℃～20.3 ℃，年溫差 11.8 ℃～12.8 ℃。油茶品種為云南本地品種（白花油茶）。試驗選擇在同一地塊分別采集炭疽病發(fā)病葉片和健康植株的健康葉片2組樣本，已有試驗證明該栽培區(qū)油茶炭疽病原主要為C. fructicola和C.siamense[17]。其中發(fā)病組命名為C組，未病組命名為H組，每組6個重復(fù)樣本，共12個樣本。采集后裝入密封袋中，帶回實驗室進行表面消毒。表面消毒流程為75%乙醇1 min，無菌水沖洗1次，用5%（有效氯）次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3次。收集最后一次沖洗的無菌水并涂布于NA培養(yǎng)基，作為對照驗證表面消毒效果。

1.2 總DNA提取

將表面消毒的葉片無菌剪為約1 cm×0.5 cm小塊。采用E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA公司），提取葉片總基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并用Qubit3.0定量檢測DNA樣本濃度。

1.3 序列擴增及測序

將提取的總 DNA 作為模板，以 341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′），805R（5′-GACTACHVGGGTA TCTAATCC-3′）為引物對16SV3-V4區(qū)域進行擴增。PCR擴增體系為（200 μL）。

第一輪PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃。第二輪擴增：95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，5 個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃。

反應(yīng)產(chǎn)物通過 2%瓊脂凝膠電泳檢測。為了得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，使用 Qubit3.0熒光定量儀進行濃度測定。PCR擴增及測序工作由生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

原始數(shù)據(jù)通過cutadapt 1.18去除引物接頭序列，使用PEAR 0.9.8和PRINSEQ 0.20.4進行過濾優(yōu)化和序列拼接得到有效序列。有效序列用Usearch 11.0.667基于97%的相似水平下對序列進行OTU聚類并進行生物信息統(tǒng)計分析（葉綠體、線粒體序列通過生工生物工程股份有限公司自寫Python腳本進行剔除）。利用RDP classifier 2.12對比RDP數(shù)據(jù)進行物種注釋和分類?；贠TU豐度信息，利用mothur 1.43.0做rarefaction分析，計算多樣性指數(shù)（ACE、Chao1、shannon、Simpson）。并通過IBM SPSS Statistic 25.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。利用R 3.6.0制作曲線圖、PCA圖、物種相對豐度圖。使用phyloseq 1.30.0根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生進化樹得到樣品間距離矩陣進行主成分分析（基于Bray-Curtis距離算法）。使用STAMP 2.1.3進行差異分析，采用Welch's t-test檢驗。使用BugBase 0.1.0分析微生物組樣品表型，對微生物群落進行表型分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析

對12個樣本內(nèi)生菌進行測序，共獲得高質(zhì)量質(zhì)控序列1255996條，平均長度407.25 bp，序列在97%的相似度水平下進行聚類共獲得 649個OTU。

通過稀釋曲線可以看出，隨著測序深度的增加，各部位樣本的稀釋曲線斜率趨于平緩（圖1），說明本次測序數(shù)據(jù)量足夠。

圖1 油茶葉片內(nèi)生細菌測序稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curve of endophytic bacteria sequencing in Camellia oleifera leaves

2.2 油茶病健葉片內(nèi)生菌Alpha多樣性分析

表1可以看出云南油茶葉片所有樣本的覆蓋度均在98%以上，表明測序數(shù)據(jù)可以真實反應(yīng)病、健葉片樣本內(nèi)生細菌菌群多樣性；其中，感病組內(nèi)生細菌Chao1、ACE指數(shù)顯著高于健康組（P＜0.05），Simpson和Shannon指數(shù)病、健葉片間無顯著差異（P＞0.05）。說明炭疽菌侵染后顯著提高了油茶葉片內(nèi)生細菌的豐度，但對多樣性無顯著影響。

表1 油茶葉片內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indices of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves

2.3 云南油茶病健葉片內(nèi)生菌Beta多樣性分析

為了揭示樣本的組間差異，基于Bray-Curtis距離進行了PCA分析（圖2）。結(jié)果表明，PC1和PC2的樣本差異貢獻率分別為39.72%和14.16%。組內(nèi)相似程度大于組間，說明炭疽菌侵染后使油茶葉片內(nèi)生細菌群落構(gòu)成趨于相近。

圖2 云南油茶葉片內(nèi)生細菌OTU水平上PCA分析Fig. 2 PCA analysis of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves at OTU level

2.4 云南油茶病健葉片內(nèi)生菌群落組成

以97%相似水平對樣本序列進行OTU聚類分析，云南油茶病健葉片內(nèi)生細菌群落可分類到18個門，40個綱，63個目，100個科，130個屬。

門水平上，病、健油茶葉片內(nèi)生細菌均檢測出18個門，無特有門。其中，相對豐度大于1%的共7個門（圖3），分別為變形菌門Proteobacteria（27.71%，22.64%）、Bacteroidets 擬桿菌門（12.05%，11.25%）、Verrucomicrobia疣微菌門（4.59%，4.29%）、Acidobacteria 酸桿菌門（3.32%，3.24%）、Actinobacteria 放線菌門（2.25%，2.19%）、Planctomycetes 浮霉菌門（2.03%，1.79%）、Chloroflexi 綠彎菌門（1.34%，1.15%）。病、健葉片內(nèi)生細菌均為變形菌門豐度最高，其次是擬桿菌門。

圖3 門水平下的云南油茶葉片內(nèi)生細菌群落組成Fig. 3 Community composition of endophytic bacteria inCamellia oleifera leaves at phylum level

屬水平下的群落組成分析表明，炭疽病侵染后，病、健組內(nèi)生細菌前20優(yōu)勢屬相同（表2），但相對豐度具有一定差異。病組中相對豐度＞1%的屬為Methylobacterium、Panacagrimonas、Pontibacter、Gp7。健組中相對豐度＞1%的屬為Pontibacter、Panacagrimonas、Gp7。病組最優(yōu)屬為Methylobacterium，健組最優(yōu)屬為Pontibacter。

表2 油茶葉片內(nèi)生細菌屬水平相對豐度（前20屬）Table 2 Relative abundance of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves at genus level (top 20)

組特有屬為Belnapia0.03%、Achromobacter0.02%、Pantoea0.02%、Flavobacterium0.01%、Spirosoma0.01%。健組特有屬為Legionella0.01%、Rhizorhabdus0.01%、Romboutsia0.01%。云南油茶病、健葉片內(nèi)生菌還存在大量未鑒定及不可歸類的屬，相對豐度分別達到76.99%、79.99%，這表明云南油茶病健葉片中可能存在大量的新屬種。

2.5 組間差異顯著微生物分析

為了進一步尋找組間差異顯著性物種，對云南油茶病、健葉片內(nèi)生細菌進行了STAMP分析。結(jié)果如圖4所示。在目分類水平（圖4A)上，病組中有3個目的豐度顯著高于健組。分別為Rhizobiales（C 4.17%，H 1.51%）、Rhodospirillales（C 1.90%，H 1.38%）和Clostridiales（C 0.16%，H 0.11%）目。

圖4 基于STAMP分析的組間差異目（A）、科（B)、屬（C）Fig. 4 Analysis of differences between groups based on STAMP at order (A)、family (B)、genus (C) level

在屬分類水平（圖4C）上，病組中共 6個屬的豐度顯著高于健組，依次為 Alphaproteobacteria 門Rhizobiales目下1未鑒定屬（C 1.29%，H 0.71%），Alphaproteobacteria 門Rhodospirillales 目Acetobacteraceae科下1未鑒定屬（C 1.34%，H 0.87%），F(xiàn)irmicutes 門Eubacteriales目 Clostridiaceae科下1未鑒定屬（C 0.10%，H 0.04%），Actinobacteria門Acidimicrobiales 目Aciditerrimonas屬（C 0.02%，H 0.01%）和1未鑒定屬（C 0.05%，H 0.02%）、Proteobacteria門Burkholderiales目Achromobacter屬（C 0.02%，H 0%）（P＜0.05)。

病組 Actinobacteria門Geodermatophilus（C 0.01%，H 0.02%）、Proteobacteria門Sulfurimonas（C 0.05%，H 0.09%）、Pusillimonas（C 0.01%，H 0.03%）共3個屬的豐度顯著低于健組（P＜0.05)。

2.6 云南油茶微生物表型和細菌功能潛力預(yù)測

基于16S rRNA的高通量測序結(jié)果，采用Bugbase數(shù)據(jù)庫對云南油茶葉片內(nèi)生細菌表型進行預(yù)測分析，病、健兩組共檢測到9種微生物表型（圖5）。炭疽病菌侵染后，云南油茶葉片內(nèi)生細菌菌群的生物膜形成、氧化脅迫耐受能力增強；革蘭氏陽性菌、好氧、厭氧、兼性厭氧菌相對豐度增加，但革蘭氏陰性菌相對豐度降低。進一步分析表明，生物膜形成、氧化脅迫耐受能力的增強主要是變形菌門下內(nèi)生細菌相對豐度的增加。革蘭氏陽性菌主要是放線菌門相對豐度增加，同時還特定增加了綠彎菌門的相對豐度。好氧微生物中，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、疣微菌門相對豐度增加。厭氧微生物中酸桿菌門、擬桿菌門、綠菌門、浮霉菌門相對豐度增加。革蘭氏陰性菌主要是變形菌門的相對豐度下降。

圖5 基于Bugbase的油茶葉內(nèi)生細菌表型預(yù)測Fig. 5 Phenotypic prediction of endophytic bacteria in Camellia oleifera leaves based on Bugbase

3 討論

內(nèi)生細菌與植物體建立和諧關(guān)系，有助于植物的生防、促生和抗逆等。本研究采用高通量測序技術(shù)對云南油茶炭疽病病、健葉片內(nèi)生細菌群落進行研究。結(jié)果表明，云南油茶葉片受炭疽菌侵染后，內(nèi)生細菌菌群多樣性相對穩(wěn)定，但菌群的豐度、OTUs數(shù)目顯著高于健康葉片。肖蓉等[18]比較分析了患炭疽病與健康草莓根際土壤微生物群落，發(fā)現(xiàn)患病土壤細菌的OTUs數(shù)目及多樣性指數(shù)均降低。樊俊等[19]研究發(fā)現(xiàn)煙草患青枯病后根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性高于健康煙草根際土壤?？梢姴煌牟≡秩静煌募闹髦参飳χ参镂⑸锶郝涞亩鄻有院拓S富度的影響不具有一致性，這其中的具體規(guī)律和原因還有賴于對更多試驗數(shù)據(jù)的歸納與總結(jié)。

云南油茶炭疽病菌侵染后改變了葉片內(nèi)生細菌群落組成。在門水平上，病、健葉片最優(yōu)內(nèi)生菌門均為變形菌門，其次為擬桿菌門、疣微菌門、酸桿菌門、放線菌門。其中變形菌門是目前多數(shù)植物內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌門[20,21]。其他幾個門雖是病、健葉片共有，但均為感炭疽病葉片中的相對豐度較高。向立剛等[22]研究發(fā)現(xiàn)感青枯病的煙株根際土壤中疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度也增加，且疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度與發(fā)病率呈正相關(guān)。另有證據(jù)表明酸桿菌門與疣微菌門成員之間有協(xié)同作用[23]。放線菌門是能產(chǎn)生抗生素及拮抗物質(zhì)等多種代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性菌，其功能已在不同類型土壤[24]、海洋、沉積物[25]等環(huán)境中分離獲得的菌株上得以驗證。因此，油茶葉片感染炭疽病后，這幾個細菌門相對豐度增加可能對油茶葉片抵抗炭疽病的入侵有益。

目水平上，被炭疽菌侵染的油茶感病葉片中根瘤菌目、紅螺菌目的相對豐度顯著高于健康組。根瘤菌目下許多科屬都有固氮作用，如克雷伯氏菌屬Klebsiella[26]、根瘤菌屬Rhizobium[27]等。這些可以聯(lián)合固氮的植物內(nèi)生菌不僅具有一定的促生作用，而且可以直接或間接地提高宿主植物的抗病性。在膜生物反應(yīng)器（MBRs）中，生物膜的形成主要與根瘤菌目和紅螺菌目有關(guān)[28]。

屬水平上，甲基桿菌屬Methylobacterium是感病葉片上的最優(yōu)勢屬，且相對豐度高于健康葉片。劉曉菲等[29]研究發(fā)現(xiàn)，黃龍病入侵柑橘，隨罹病程度的加深，甲基桿菌屬的相對豐度也增加。甲基桿菌屬是兼有甲基營養(yǎng)和甲烷營養(yǎng)特性的革蘭氏陰性桿菌，具有固氮能力，可促進植物生長，還可通過分泌植物激素（細胞分裂素、生長素）與植物相互作用。此外，感病葉片中豐度顯著高于健康葉片的Aciditerrimonas屬多具有拮抗、產(chǎn)生抗生素及抑制土傳病害[30]等功能。Achromobacter屬可產(chǎn)生鐵載體并抑制番茄枯萎病[31]。葉片感病后的特有屬Spirosoma是擬桿菌門下的屬，該屬下的許多種表現(xiàn)出對紫外線等輻射的抗性，這是葉際微生物適生的一個重要屬性[32]?？梢?，云南油茶被炭疽菌侵染后，激發(fā)了油茶葉片中內(nèi)生細菌的防御。增強了一些具有潛在抗病性的內(nèi)生菌的豐度。此外，本研究中油茶葉未歸類到屬的內(nèi)生細菌相對豐度高達79%，可見油茶內(nèi)生細菌還有很大的開發(fā)新屬種的潛力。由于部分內(nèi)生菌具有宿主專一性，尚有很多植物存在大量的未知內(nèi)生菌。如玫瑰的內(nèi)生細菌以未歸類屬為最優(yōu)勢菌屬，相對豐度占33%[33]，蔥屬植物未歸類內(nèi)生細菌的豐度占比高達70%[34]。植物內(nèi)生菌未知屬種的豐度一方面取決于該宿主內(nèi)生菌研究的深度和廣度，另一方面也受制于現(xiàn)有的已知物種數(shù)據(jù)庫。

Bugbase主要進行細菌的表型預(yù)測，通過表型情況來解析微生物群落生態(tài)功能。本研究通過 Bugbase功能預(yù)測得知，在感病葉片中生物膜形成、移動元件、氧化脅迫耐受功能豐度增加。Mousa等[35]研究發(fā)現(xiàn)，小麥種子內(nèi)生菌也會因鐮刀菌的侵入形成生物膜介導(dǎo)的微菌落，以此形成物理屏障，阻止病原菌的入侵。此外，感病葉片中革蘭氏陽性菌豐度增加，目前許多代表性的生防細菌都是革蘭氏陽性菌[36]，并有證據(jù)表明植物內(nèi)生革蘭氏陽性菌在植物抗病、營養(yǎng)互作等有利于植物健康生長的生物活性方面具有重要的作用[37]。Bugbase表型分析是基于OTU數(shù)據(jù)的預(yù)測分析，本研究中存在大量未分類的屬種，因此會出現(xiàn)表型預(yù)測比較片面或有些樣品的部分表型沒有預(yù)測到等情況。進一步的宏基因組測序?qū)⒖梢越o出相對準確的內(nèi)生細菌的功能分析。此外，對微生物群落功能的全面準確的預(yù)測，還有賴于已有參考數(shù)據(jù)庫的不斷完善。