羅雪婷，鐘 瑜，林銳濤，歐濱獲

(中科檢測技術(shù)服務(wù)(廣州)股份有限公司，廣東 廣州 510000)

0 引言

辣木是一種原產(chǎn)于印度的喬木，其種子被稱為辣木籽。辣木籽富含優(yōu)質(zhì)油脂，經(jīng)提取所得的辣木籽油的油酸含量可達(dá)到70%[1]。近年來，大量研究顯示，辣木籽除了含有大量的油脂外，還含有大量其他營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、維生素等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、降血脂、降血糖、護(hù)肝等多種功效。另外，其還含有能夠使渾濁水在短時間內(nèi)澄清的活性蛋白，為水質(zhì)凈化提供了新思路[2-4]。本文將針對辣木籽活性成分進(jìn)行深入研究，并以腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為靶標(biāo)，采用體外細(xì)胞模型篩選，以誘生抗病毒細(xì)胞因子的天然小分子化合物，旨在為進(jìn)一步開發(fā)辣木籽的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

研究所用辣木籽均采自于云南昆明，樣本保存在天然小分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞購自于ATCC。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

1.2.1 研究試劑

表1 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

見表2。

表2 實(shí)際儀器

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 提取及分離

取干燥好的辣木籽3795 g，進(jìn)行粉碎后過80目篩，采用甲醇進(jìn)行回流提取3次，每次2 h。將濾液合并后，使用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，將濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀解壓回流，直至樣本無甲醇味后烘干，得到辣木籽粗提物[5]。取300g粗提后的辣木籽，再次使用甲醇溶解后裹80目硅膠，減壓旋干至粉末狀。利用硅膠柱層析，將不同極性成分分開，再依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等5種不同且極性遞增的溶劑來對樣本進(jìn)行洗脫，再進(jìn)行減壓回流濃縮處理，得到不同溶劑洗脫萃取物共計(jì)5種。這5種不同溶劑萃取物分別為石油醚萃取物Fr.A、氯仿萃取物Fr.B、乙酸乙酷萃取物Fr.C、丙酮萃取物Fr.D 和甲醇萃取物Fr.E。

1.3.2 分離純化

取甲醇萃取物Fr.E，將其采用D101大孔吸附樹脂(AB-8)柱進(jìn)行層析，再利用純水和甲醇對其再次進(jìn)行洗脫處理后，將洗脫液收集好。將洗脫液按照2L一個分流的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分流，共計(jì)得到20個分流，將其進(jìn)行編號，分別為Fr.1-20。取其中的Fr.3作為研究樣本，使用硅膠柱進(jìn)行層析，再使用氯仿-甲醇-水(從100∶0∶0至2∶1∶0.1)對樣本進(jìn)行梯度脫洗，再次得到24個流分，即Fr21-44。按照6∶4的比例配置乙醇和水的混合液，向其中加入Fr.39，采用葡聚糖凝膠色譜Sephadex LH-20柱對其進(jìn)行層析，采用配置好的乙醇水和無水乙醇洗脫，即得到化合物1。

將丙酮萃取物Fr.D同樣使用硅膠柱進(jìn)行層析，再用氯仿-甲醇-水(100∶0∶0-7∶3∶0.5)對其進(jìn)行梯度洗脫，繼而得到32分流，取其中的1個分流，利用硅膠色譜柱、Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行層析、洗脫后，再采用反相鍵合相色譜和高效液相技術(shù)進(jìn)行分類純化[6]，即可得到化合物2-11。

1.4 調(diào)控內(nèi)源TNF-α實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入適量的胎牛血清、2 mL/L-glutamine和抗生素，接入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)與單核巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在96孔板各個孔內(nèi)加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，對細(xì)胞進(jìn)行種植。當(dāng)細(xì)胞增殖并達(dá)到培養(yǎng)皿面積的70%-80%左右后，向各個孔內(nèi)加入辣木籽各組分提取物，給藥劑量按照梯度設(shè)計(jì)，分別為27.5 μg/mL、55 μg/mL、110 μg/mL與220 μg/mL，同時使用脂多糖(LPS，1 μg/mL)作為陽性對照組。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)及實(shí)時熒光定量PCR

利用NCBI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，選取具有高特異性和較低Tm值的引物序列，TNF-α正向引物設(shè)計(jì)為5’-ATGGCTTCCCTCTCATCTGT-3’；反向引物為5’-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3’。

在提取RNA時，先將懸浮細(xì)胞重懸，貼壁細(xì)胞采用0.25%胰蛋白酶消化，然后置入4 ℃PBS緩沖液內(nèi)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新EP管內(nèi)離心5 min，棄去PBS緩沖液，再次在管內(nèi)加入500 μL的Trizol重懸細(xì)胞，靜置于冰面上10 min后，采用Trizol法裂解細(xì)胞，并將細(xì)胞RNA提取純化。將純化的RNA組作為模板，采用cDNA合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以實(shí)時熒光定量PCR預(yù)混體系(探針法)進(jìn)行定量分析，采用美國伯樂PCR系統(tǒng)，以GAPDH作為樣本內(nèi)參，正向引物采用5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物采用5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。

1.4.3 一氧化氮濃度及抗病毒細(xì)胞因子測定

采用Griess試劑對脂多糖以及樣本細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的亞硝酸鹽濃度進(jìn)行檢測，抗病毒因子TNF-α含量測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，配合相關(guān)試劑盒按照說明書操作[7]；使用酶標(biāo)儀對樣本吸光度進(jìn)行測定，測定條件設(shè)定為450 nm。

1.4.4 細(xì)胞因子蛋白分泌水平測定

按照27.5 μg/mL、55 μg/mL、110 μg/mL與220 μg/mL的濃度梯度，給予RAW264.7細(xì)胞辣木籽提取物藥物刺激，以1 μg/mL脂多糖為對照組，在給藥刺激24 h后，收集樣本上清液，采用流式多因子檢測試劑盒對上清液中的IL-2、IL-6、IL-12以及TNF-α等細(xì)胞因子蛋白分泌水平進(jìn)行測定[8]。

1.4.5 相關(guān)蛋白檢測

采用蛋白免疫印跡對相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測[9]，在提取蛋白時，先將細(xì)胞濃度調(diào)整至105cell/mL，再置入6孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后將其培養(yǎng)基移除，再分別向孔內(nèi)加入藥物，培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞。將收集到的細(xì)胞采用預(yù)冷過的PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心處理，取上清液備用。在對細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行測定時，采用BCA法[10]，測定完畢后再次使用細(xì)胞裂解液將各個孔內(nèi)的蛋白濃度調(diào)整到相同，再加入適量的SBS上樣緩沖液進(jìn)行變性處理。對于處理好的蛋白樣本上樣電泳，將其蛋白進(jìn)行分類處理，將分離得到的蛋白轉(zhuǎn)模到PVDF膜上，剪切出相應(yīng)蛋白。經(jīng)洗膜—封閉—洗膜—一抗孵育—洗膜—二抗孵育—洗膜處理后，采用化學(xué)發(fā)光免疫條帶檢測試劑盒，顯色特異蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和分離

稱取3795 g辣木籽，并對其進(jìn)行提取，共計(jì)提取到辣木籽粗提物313.4 g，再次將粗提物進(jìn)行提取和分離，以不同洗脫劑洗脫處理后，得到5種萃取物，其質(zhì)量分布為石油醚萃取物Fr.A88.8 g、氯仿萃取物Fr.B7.5 g、乙酸乙酯萃取物Fr.C4.4 g、丙酮萃取物Fr.D9.8 g以及甲醇萃取物Fr.E175.8 g。

2.2 成分結(jié)構(gòu)鑒定

對研究所得的化合物1-11進(jìn)行分析，化合物分子式見表3。其中化合物2和化合物5為新發(fā)現(xiàn)的化合物單體。

表3 化合物1-11分子式

2.3 提取物活性篩選

將辣木籽提取物(1，2，5，6)利用RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，對細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)4個化合物濃度低于220 ug/mL時不具有細(xì)胞毒性。在測試亞硝酸鹽濃度時，發(fā)現(xiàn)這4種化合物都能夠刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生亞硝酸鹽。與空白組細(xì)胞相比，4組化合物(220 ug/mL)在給藥后，樣本NO濃度均明顯上調(diào)(P<0.05)，但濃度要低于脂多糖(LPS)刺激組(P<0.05)。對比4組化合物刺激效果可見，化合物1給藥刺激產(chǎn)生的亞硝酸鹽濃度最高(見表4)，表明在這4種辣木籽提取物中，化合物1的激活效應(yīng)最佳。

表4 提取物刺激細(xì)胞24 h效果分析

2.4 化合物1對RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

鑒于辣木籽提取物中化合物1的激活效應(yīng)最佳，故而以化合物1來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用熒光定量PCR法，對化合物1刺激后的細(xì)胞抗病毒因子mRNA進(jìn)行活性篩選，檢測細(xì)胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ與TNF-α等。通過檢測發(fā)現(xiàn)，在被化合物1刺激后，細(xì)胞TNF-αmRNA含量明顯升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性(見表5)，表明RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的過程可受到化合物1的調(diào)控，且這個調(diào)控效果與給藥劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。由此可見，化合物1能夠從基因mRNA以及蛋白水平方面刺激細(xì)胞分泌TNF-α。

表5 化合物1對RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

2.5 化合物1對TNF-α蛋白表達(dá)的影響

為了明確化合物1是通過何種機(jī)制來刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α蛋白，本次研究選取了不同信號通路對其作用機(jī)制進(jìn)行檢測，通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)可見，化合物1在27.5 μg/mL-220 μg/mL濃度范圍內(nèi)，能夠激活P38蛋白和磷酸化JNK蛋白，并利用MAPK信號級放大作用，將辣木籽的刺激信號傳遞到細(xì)胞核相應(yīng)的靶基因?qū)?yīng)位置上，刺激細(xì)胞增殖、分裂(見圖1)。通過對NF-κB信號通路分析發(fā)現(xiàn)，只有給藥濃度升高至220 μg/mL時，化合物1才能夠激活細(xì)胞的P65蛋白磷酸化，同時出現(xiàn)IKBα蛋白解聚現(xiàn)象，IKBα通過泛素途徑逐漸被降解，而被磷酸化的P65則攜帶著上游信號進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部，然后錨定在細(xì)胞核蛋白某個特定的序列上，啟動多種蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯。

圖1 化合物1對TNF-α相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 結(jié)論及展望

本次研究以辣木籽作為研究對象，對其化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，研究共計(jì)從辣木籽提取物中鑒定出11個化合物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這11個化合物，化合物1、化合物2、化合物5和化合物6均能夠刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，激活巨噬細(xì)胞的抗病毒作用。在這4個化合物中，以化合物1的活性最佳。進(jìn)一步對化合物1進(jìn)行研究可見，其能夠明顯上調(diào)抗病毒因子TNF-α的mRNA表達(dá)水平，并通過流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)?；衔?的給藥劑量越大，抗病毒因子TNF-α的信號反應(yīng)越強(qiáng)，表明化合物1對TNF-α的刺激效果與給藥劑量有關(guān)。在信號通路調(diào)控機(jī)制研究過程中可見，化合物1對巨噬細(xì)胞的IKBα蛋白具有刺激作用，同時還能夠上調(diào)p-p65蛋白的表達(dá)，并通過激活NF-κB信號通路來刺激抗病毒因子TNF-α的釋放。

自我國引入辣木，并對其進(jìn)行商業(yè)種植以來，各界學(xué)者對其化學(xué)成分、生物活性以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等方面的研究從未停止，且在各自領(lǐng)域取得了一定的研究成果[11-12]。辣木籽作為辣木樹的種子，目前已被證實(shí)具有較高的醫(yī)用價(jià)值[13]。本次研究僅對辣木籽化學(xué)成分和其對TNF-α的調(diào)控作用進(jìn)行分析，但對其其他成分和生物活性未深入研究，對其是否具有多重作用機(jī)制也未進(jìn)行探索。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信未來對辣木籽的研究將更加深入，期待后續(xù)研究為辣木籽的開發(fā)提供更多理論依據(jù)。