唐 婷 李福元 劉 艷 邱艷明

湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，湖南株洲 412000

燈盞花素為燈盞花的主要成分[1]，是一類具有良好抗心血管疾病類的黃酮化合物，具有增加血流量、改善微循環(huán)等作用[2-7]。據(jù)文獻(xiàn)記載燈盞花素口服制劑在體內(nèi)基本不吸收；靜脈注射后，在體內(nèi)半衰期短且不穩(wěn)定[8]，因其溶解性問(wèn)題嚴(yán)重影響了燈盞花素在心血管慢性疾病方面的應(yīng)用，故開發(fā)燈盞花素新制劑有非常廣闊的前景。已有多項(xiàng)研究表明，將藥物制備成固體分散體后能顯著提高藥物的溶解度并且增加藥物的穩(wěn)定性[9-13]，也可以將其作為中間品或原料藥制備成片劑、膠囊劑等，本研究將為后期制劑的制備奠定良好的基礎(chǔ)[14]。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試藥

燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品（Solarbio，批號(hào)：SS8310）；燈盞花素原料藥（陜西清雅生物科技有限公司，批號(hào)：20190625）；PEG4000（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190415）；PEG6000（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190326）、泊洛沙姆188（Solarbio，批號(hào)：551956）、氫氧化鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：20190115）；磷酸二氫鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：20180923）；甲醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司，批號(hào)：20190501）；胃蛋白酶（Solarbio，批號(hào)：20190211）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜法LC-20A（日本島津）；G1315 紫外檢測(cè)儀[圣賓儀器科技（上海）有限公司]；RCZ-8A型溶出儀（天津大學(xué)精密儀器廠）；電子分析天平（舜宇恒平儀器，精密度為萬(wàn)分之一）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）；FZG-1 真空干燥箱（湖南中美科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.761 9C+0.002（r2=0.999 6），提示燈盞花素在濃度為5～30 μg/ml時(shí)與A 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 累積溶出率的測(cè)定

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版第四部[15]溶出度測(cè)定方法（槳法）測(cè)定溶出度。轉(zhuǎn)速為80 r/min，分別在0、3、8、10、20、30、45 min 時(shí)取樣10 ml 后過(guò)微孔濾膜，取濾液作為供試品，在波長(zhǎng)196 nm 處測(cè)定吸光度值。

2.3 固體分散體的制備

2.3.1 熔融法制備固體分散體 精密稱定燈盞花素原料藥5.0 mg 及PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆188 各3.000 g，先將各載體加熱溶解，加入主藥，攪拌均勻后，置于冰浴中冷卻12 h，固化，置于干燥器中干燥3 d，粉碎，過(guò)80 目篩，備用[16-17]。

2.3.2 溶劑法制備固體分散體 精密稱定燈盞花素原料藥5.0 mg 及PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆188 各3.000 g，置于蒸發(fā)皿中，用適量的甲醇溶液溶解后，超聲10 min，混合均勻，在恒溫60℃的磁力攪拌30 min，然后置于70℃水浴鍋中加熱，攪拌，使甲醇揮發(fā)，將其置于干燥器中平衡3 d，粉碎，過(guò)80 目篩，既得燈盞花素固體分散體，置于干燥器中備用[18-19]。

2.3.3 研磨法制備固體分散體 精密稱定燈盞花素原料藥5.0 mg 及PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆188 各3.000 g，混合均勻，研磨40 min，過(guò)80 目篩，備用[20-22]。

2.4 固體分散體制備方法的優(yōu)選

精密稱定燈盞花素原料藥5.0 mg，PEG4000 3.000 g，采用“2.3”項(xiàng)下3 種方法，制備燈盞花素固體分散體，按照“2.2”項(xiàng)下操作方法測(cè)定固體分散體中溶出度，并且計(jì)算累積溶出率。由圖1 可知，相同的條件下，按照累積溶出率的大小進(jìn)行排名：熔融法>研磨法>溶劑法，由此可知熔融法制備燈盞花素固體分散體，其蓮心堿的累積溶出率最大，對(duì)燈盞花素的增溶作用最強(qiáng)。

圖1 固體分散體制備方法篩選

2.5 固體分散體載體材料的優(yōu)選

在相同條件下，精密稱定燈盞花素原料藥5.0 mg，PEG4000、PEG6000、泊洛沙姆188 各3.000 g，按照“2.3.1”項(xiàng)制備固體分散體，按照“2.2”項(xiàng)下操作方法測(cè)定固體分散體中溶出度，并且計(jì)算累積溶出率，篩選制備載體材料。由圖2 可知，相同的條件下，采用不同載體材料制備的固體分散體度累積溶出率的影響大小為：泊洛沙姆188>PEG4000>PEG6000>燈盞花素原料藥，由此可知泊洛沙姆188 的累積溶出率最大，對(duì)燈盞花素具有增溶效果故選擇泊洛沙姆188 為載體材料。

圖2 固體分散體載體材料的優(yōu)選

2.6 藥物-載體材料比例考察

以泊洛沙姆188 為載體，按照“2.3.1”項(xiàng)制備燈盞花素固體分散體，藥物與載體比例為5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9 制備固體分散體，按照“2.2”項(xiàng)下操作方法測(cè)定固體分散體中溶出度，并且計(jì)算累積溶出率。由圖3 可知，以泊洛沙姆188 為載體，藥物與載體的比例為1∶5 時(shí)，對(duì)燈盞花素的累積溶出影響最大，增容效果也最明顯。

圖3 藥物-載體材料比例篩選結(jié)果

2.7 固體分散體的最佳制備工藝的優(yōu)選

根據(jù)以上單因素考察結(jié)果，固體分散體的最佳制備載體材料為泊洛沙姆188，制備方法為熔融法。以固體分散體中燈盞花素的累積溶出率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[17,23]，篩選最佳制備工藝。由表1～3 可知，因素A 對(duì)燈盞花素的溶出率有顯著影響（P <0.05）；最佳制備工藝為A2B2C3，即燈盞花素與泊洛沙姆188 的比例為1∶5，采用70℃溫度將載體材料溶解，20℃溫度冷卻即可，可以降低生產(chǎn)成本。

表1 因素水平表

表2 固體分散體正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表3 累積溶出率方差分析結(jié)果

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述最佳優(yōu)化條件，制備燈盞花素固體分散體后，測(cè)量其溶出度及燈盞花素累積溶出率，平行3 次。由圖4 可知，三批燈盞花素45 min 的累積溶出率分別為86.62%、86.78%、87.21%，平均值為86.84%，表明優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。

圖4 三批燈盞花素固體分散體累積溶出率

2.9 載藥量的測(cè)定

2.9.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，于50 ml 的容量瓶中加入甲醇溶液定容，配成濃度為0.1 mg/ml。

2.9.2 固體分散體及原料藥樣品的處理 精密稱定適量的燈盞花素固體分散體5.000 g 和原料藥（含藥量保持一致）5.0 mg，加甲醇溶液定容到50 ml，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾。

2.9.3 色譜條件 色譜柱為Athena C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水（60∶40）；流速為0.5 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為196 nm[23]。色譜圖見圖5。

圖5 高效液相色譜圖

2.9.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別從對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml 置于10 ml 容量瓶中，定容得到對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定。以燈盞花素的峰面積Y 對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度X 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=52.31X-14.21，r=0.999 7，表明其在5～30 g/ml 線性關(guān)系良好。

2.9.5 精密度實(shí)驗(yàn) 分別量取上述低、中、高濃度的對(duì)照品溶液，按照“2.9.3”色譜條件下于1 d 內(nèi)進(jìn)樣5 次，測(cè)定燈盞花素日間精密度，再連續(xù)進(jìn)樣3 d，測(cè)定其日間精密度。結(jié)果顯示，各對(duì)照品溶液的日內(nèi)精密度的RSD 為0.32%，日間精密度的RSD 為0.29%，結(jié)果表明精密度良好。

2.9.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批燈盞花素固體分散體樣品6 份，制成供試品后，按照“2.9.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣20 μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到RSD 為0.56%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.9.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.9.2”項(xiàng)下的燈盞花素固體分散體供試品溶液，按照“2.9.3”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、36、72 h 取樣進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得燈盞花素固體分散體的峰面積RSD 為0.61%，表明供試品溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知濃度的燈盞花素固體分散體，加入已知濃度的對(duì)照品，按照“2.9.3”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算實(shí)際質(zhì)量濃度，同時(shí)計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。計(jì)算平均回收率為97.95%，RSD 為0.98%，表明該方法測(cè)定燈盞花素的含量回收率高，準(zhǔn)確性好。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9.9 固體分散體中燈盞花素含量的計(jì)算 按照“2.9.3”項(xiàng)下條件測(cè)定固體分散體燈盞花素的含量，平行測(cè)定三批產(chǎn)品，結(jié)果顯示三批固體分散體的載藥量為（1.95±0.10）mg/g。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，燈盞花素固體分散體的最佳制備載體為泊洛沙姆188，最佳制備工藝為熔融法，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝為藥物與載體材料的比例為1∶5，熔融溫度為70℃，冷卻溫度為20℃。采用最佳工藝制備的三批產(chǎn)品其重現(xiàn)性較好，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)量的載藥量為（1.95±0.10）mg/g。

燈盞花素在水中的溶解度比較低，采用泊洛沙姆188 將其制備成固體分散體后能提高其在體外的溶解度及溶出度，其原因可能是燈盞花素與泊洛沙姆188 結(jié)合以后，藥物在其載體中的存在形式發(fā)生了較大的改變有關(guān)，藥物以晶體或者無(wú)定型的狀態(tài)存在有關(guān)。本研究將為其制備成其他劑型提供參考價(jià)值。