陳安莉，沈浩元，陽仕雄，鄧春燕，胡超華，劉漢忠，王 舒，錢 芳

1.錦州醫(yī)科大學孝感市中心醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 孝感 432000；

2.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）甲狀腺乳腺外科，湖北 孝感 432000；

3.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）中心實驗室，湖北 孝感 432000；

4.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）兒科，湖北 孝感 432000；

5.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）病理科，湖北 孝感 432000

根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年全球癌癥統(tǒng)計，乳腺癌的發(fā)病率（11.7%）已經(jīng)超過肺癌（11.4%）而成為全球最常見的惡性腫瘤，同樣也是女性人群中主要的癌癥死因［1］。乳腺癌新輔助治療由于可增加降期、保乳、保腋窩的概率，同時還可篩選高危人群、獲得藥物敏感性的信息指導后續(xù)用藥，因此新輔助治療已成為早期乳腺癌的重要治療策略［2］。即使隨著新輔助治療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療的進展，部分早期乳腺癌患者的預后獲得了明顯改善，但復發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等一系列預后不良的因素成為了乳腺癌死亡率高的原因。因此，深入研究乳腺癌早期診斷方法，探尋更準確的新輔助治療的生物標志物用于乳腺癌早期診斷及后續(xù)治療藥物的選擇已成為目前亟待解決的問題。部分乳腺癌患者對新輔助治療并不敏感［3］，尋找在新輔助治療前可以預測新輔助治療效果的因素對于乳腺癌治療有著非常重要的意義。

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴隨著遺傳及表觀遺傳學的變化，近年來研究［4-6］表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遠處轉(zhuǎn)移及耐藥過程中充當重要角色，可以在基因組表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面發(fā)揮調(diào)控作用，H19是常見的腫瘤相關lncRNA，目前已證實lncRNA H19在乳腺癌組織及乳腺癌患者血漿中均有較高的表達［7-9］。LncRNA H19參與乳腺腫瘤形成的過程受到缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α、p53、E2F1 等因素調(diào)節(jié)，影響細胞周期進程，促進細胞增殖與轉(zhuǎn)移［10］?；趌ncRNA H19與乳腺癌新輔助治療具有一定相關性，本研究通過動態(tài)檢測乳腺癌患者新輔助治療前，新輔助治療2、4和6個周期，以及手術(shù)后外周血lncRNA H19的表達水平及變化情況，分析血漿lncRNA H19的動態(tài)變化對不同分子分型乳腺癌新輔助治療效果的預測及患者預后的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2020年1月—2021年12月武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）甲乳外科收治的45例行新輔助治療的乳腺癌患者為研究對象。年齡34～ 61歲，平均年齡（47.00±8.07）歲，均為女性患者，所納入的病例新輔助治療前均在彩色超聲下行空芯針穿刺活檢明確病理學類型，腫瘤負荷大小及臨床分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Cancer Committee，AJCC）第8版TNM分期，T2期有25例，T3～ T4期有20例。確診后治療方案根據(jù)患者的分子分型及TNM分期等狀態(tài)進行個體化選擇，包括蒽環(huán)類、紫杉類及鉑類藥物的方案聯(lián)合或序貫治療，人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性患者給予抗HER2治療。

1.2 納入及排除標準

納入標準：①初治女性乳腺癌患者，組織病理學檢查結(jié)果為乳腺癌；② 年齡20～ 70歲；③符合新輔助治療指征且至少完成6個周期新輔助治療；④ 具備完整的臨床信息；⑤ 既往未因乳腺癌接受過任何治療。排除標準：①合并嚴重臟器功能障礙；② 合并精神類疾??；③不符合新輔助治療適應證；④ 中途放棄新輔助治療者；⑤有遠處器官轉(zhuǎn)移者；⑥ 一般情況差，不能耐受治療及手術(shù)者。

1.3 標本收集

所有患者分別在新輔助治療前、新輔助治療2、4和6個周期及手術(shù)后以促凝管留取患者空腹血4 mL，2 000 r/min、離心半徑10 cm、離心15 min，吸取上層血清至1.5 mL無酶離心管中，使用前均保存于-80 ℃超低溫冰箱。本研究收集樣本均取得患者知情同意，并獲得武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）倫理委員會批準。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）測定乳腺癌外周血血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達

采用QIAzol Lysis Reagent提取血漿中的RNA（具體見試劑盒說明書）。利用 SYBR Green熒光染料試劑盒、Step One Plus?Q-PCR儀進行RTFQ-PCR（購自美國ABI公司）以檢測lncRNA表達水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，反應條件按照說明書進行。H1 9 上游引物為5'-GAGTCGGCACACTATGGCT-3'，下游引物為5'-GCTGGGTAGCACCATTTCTTTC-3'；GAPDH上游引物為5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3'，下游引物為5'-GCGCGGCGATATCATCATC-3'。2-ΔΔCt法計算lncRNA相對表達水平，其中ΔCt=CtLncRNA-CtGAPDH。

1.5 新輔助治療后療效評價

①依據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）1.1版本進行療效評估：完全緩解（complete response，CR）為所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標志物正常，至少維持4周；部分緩解（partial response，PR）為靶病灶最大徑之和較少≥30%，至少維持4周；疾病進展（progressive disease，PD）為靶病灶最大徑之和增加≥20%或者出現(xiàn)新病灶；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）為靶病灶最大徑之和縮小未達PR，或者增大未達 PD。② 在本研究中，病理學完全緩解（pathological-complete-response，pCR）被定義為乳腺及腋窩淋巴結(jié)內(nèi)無浸潤性癌成分。病理學不完全緩解（non-pathologicalcomplete-response，non-pCR）定義為由于部分腫瘤反應，任何陽性淋巴結(jié)或浸潤性癌殘留在乳腺中。

1.6 觀察指標

①乳腺癌患者外周血血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達水平；② 乳腺癌患者新輔助治療前，治療2、4及6個周期，以及手術(shù)后外周血血漿中l(wèi)ncRNA H19表達量的動態(tài)變化；③新輔助治療的療效與新輔助治療前及2個周期后血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達水平的關系；④ 不同分子分型乳腺癌患者新輔助治療前血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達量的差異；⑤ 乳腺癌患者血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達水平與腫瘤負荷及殘余腫瘤負荷、淋巴結(jié)狀態(tài)及TNM分期的關系；⑥ 血漿中l(wèi)ncRNA H19評估新輔助療效的價值。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0和Graphpad prism 9.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）評估lncRNA H19在新輔助治療過程中的動態(tài)變化；多因素采用多因素方差分析（Two-way ANOVA）進行檢驗；計量資料用表示，組間比較采用樣本t檢驗。根據(jù)lncRNA H19的表達水平及新輔助治療是否有效繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征

納入患者均為女性，年齡34～ 67歲，平均49.9歲。絕經(jīng)前25例，絕經(jīng)后20例。臨床分期中，T2期19例，T3-4期26例；N0期15例，N1期25例，N2期5例；TNM 分期中，ⅡA期6例，ⅡB期17例，ⅢA期17例，ⅢB期5例。分子分型中，激素受體陽性型（luminal型）、HER2陽性型和TNBC各15例（表1）。

2.2 不同時期乳腺癌患者lncRNA H19表達量的變化

入組的乳腺癌患者新輔助治療前后的各個時間段血漿lncRNA H19的表達水平均有差異，分析血漿H19的表達水平在新輔助治療過程中的動態(tài)變化時，結(jié)果顯示絕大多數(shù)乳腺癌患者在新輔助治療第2個周期后血漿H19水平有明顯下降，且新輔助治療2及4個周期后、手術(shù)前及手術(shù)后的表達較新輔助治療前均有顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中45例乳腺癌患者中在新輔助治療第2個周期后有29例患者較新輔助治療前下降，而16例患者反而有上升的趨勢。同時，本研究也顯示新輔助治療可降低大多數(shù)乳腺癌患者血漿H19的表達（圖1）。

2.3 乳腺癌患者不同情況下與血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達量的關系

本研究結(jié)果顯示，腫瘤負荷大的乳腺癌患者血漿lncRNA H19的表達水平較腫瘤負荷小者稍高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；同樣對比新輔助治療后殘余腫瘤負荷與血漿H19的表達可見，腫瘤殘余大小≤2 cm的患者血漿H19表達量顯著高于＞2 cm患者，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。術(shù)后殘余腫瘤大小與新輔助治療前血漿中H19相對表達量呈負相關，淋巴結(jié)狀態(tài)N0和N1患者血漿H19表達量均顯著高于N2患者，這可能都預示著血漿H19表達高的患者更能獲益。從TNM分期中可見ⅡA期與ⅡB期（P＜0.001）、ⅡB期與ⅢA期（P=0.048）及ⅢA期與ⅢB期（P＜0.001）差異均有統(tǒng)計學意義（圖2）。

2.4 不同分子分型乳腺癌患者血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達量的差異

對比不同分子分型乳腺癌患者血漿中l(wèi)ncRNA H19表達水平的動態(tài)變化時，發(fā)現(xiàn)HER2+和激素受體陽性（luminal型）乳腺癌患者在新輔助治療后lncRNA H19表達均有下降的趨勢，而TNBC大多數(shù)患者在新輔助治療第2個周期后不降反升；此外，本研究發(fā)現(xiàn)新輔助治療前HER2+乳腺癌患者血漿H19表達量顯著高于TNBC（P=0.003），較激素受體陽性乳腺癌有數(shù)值上提高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。對不同分子分型患者在新輔助治療前H19水平進行兩兩比較時發(fā)現(xiàn)，TNBC患者顯著低于luminal型（P=0.037）。在新輔助治療2個周期后有16例患者的血漿H19水平較治療前有所升高，其中12例為TNBC，4例為HER2+型，對比3種分子分型在新輔助治療2個周期后H19的變化情況，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖 3、4）。

2.5 乳腺癌患者血漿中LncRNA H19的表達量與新輔助治療效果的相關性

乳腺癌患者新輔助治療后，pCR為20例（44.4%），non-pCR為25例（55.6%）。在觀察血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達量與新輔助治療的預后關系時，pCR組的H19表達隨著新輔助治療的進行均有明顯下降的趨勢（P＜0.05），而nonpCR組的H19表達水平在新輔助治療后又升高，且隨著新輔助治療的進行H19表達水平波動起伏不定，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。pCR組在新輔助治療前血漿中l(wèi)ncRNA H19的相對表達量顯著高于non-pCR組（P=0.001）；此外，達到CR組患者新輔助治療前H19水平高于PR組（P=0.079）和SD組（P=0.187，圖4）。

2.6 血漿中l(wèi)ncRNA H19評估新輔助療效價值的評估

根據(jù)乳腺癌患者血漿lncRNA H19表達水平繪制ROC曲線，確定約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1），用于確定截斷值。ROC曲線分析結(jié)果顯示，在區(qū)分新輔助治療是否達到pCR，H19的曲線下面積（area under the curve，AUC）為 0.70，靈敏度為100%，特異度為50%（圖5）。

3 討 論

新輔助治療已經(jīng)成為早期乳腺癌及局部晚期乳腺癌最佳治療模式，以及大多數(shù)Ⅱ、Ⅲ期TNBC與HER2陽性乳腺癌的優(yōu)選治療模式。研究表明新輔助治療后達到pCR的患者可比未達到pCR者獲得更長的生存期，提前觀察到腫瘤細胞對治療藥物的敏感性，可能使患者避免無效的藥物治療，有利于后續(xù)的手術(shù)治療及減少術(shù)后的復發(fā)［11］。然而，部分患者在接受新輔助治療后預后不佳，甚至失去了局部治療的機會，因此，尋找可以預測新輔助治療效果的生物標志物可以有效地提高乳腺癌患者的預后及生存率。

人類基因組中經(jīng)轉(zhuǎn)錄而成的RNA中僅有2%具有編碼蛋白質(zhì)功能，而不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［12］。LncRNA 是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200 nt的RNA分子，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥過程中充當重要角色，并在許多惡性腫瘤中表現(xiàn)出較高的組織特異性［10，13］。研究［14-15］表明，許多l(xiāng)ncRNA的表達譜與乳腺癌的不良預后、治療及靶向治療耐藥、生存率和疾病復發(fā)相關。LncRNA在乳腺癌中的表達水平有望用于預測新輔助治療效果，也有望作為乳腺癌的生物標志物，可能有助于早期乳腺癌的診斷和提高疾病治療效果。

LncRNA H19通過多種機制參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，包括編碼miR-675、參與競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡、與Myc相互作用等［16］。一項分析結(jié)果表明，lncRNA H19在癌癥檢測和診斷方面具有相對中等的準確性［7］。

Zhang等［9］的研究顯示相對于健康人群，乳腺癌患者外周血中的lncRNA H19表達水平更高（P＜0.05），且經(jīng)手術(shù)治療后外周血中H19水平呈顯著下降的趨勢（P=0.001），這與本研究證實的手術(shù)后H19表達量較新輔助治療前顯著下降的結(jié)果相一致。此外，有研究［8］分析了行新輔助治療乳腺癌患者3種lncRNA（lncRNAs H19、MALAT1和GAS5）在血漿中的表達水平對新輔助治療的影響，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)H19與乳腺癌新輔助治療效果相關，進一步支持本研究，且在該研究顯示在新輔助治療4個周期后血漿H19表達水平較新輔助治療前呈下降的趨勢，這與本研究結(jié)果一致，達到pCR的患者新輔助治療前H19水平低于non-pCR患者（P=0.040），不同分子分型H19表達水平差異無統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現(xiàn)，HER2+乳腺癌患者血漿H19表達量高于激素受體陽性乳腺癌和TNBC（P=0.020），且達到pCR的患者新輔助治療前H19水平顯著高于non-pCR患者（P＜0.05），這與上述研究結(jié)果有差異，可能因為本研究發(fā)現(xiàn)HER2+型乳腺癌患者血漿H19表達量顯著較高。后續(xù)我們將擴大樣本量繼續(xù)探索lncRNA H19在不同分子分型乳腺癌患者新輔助治療中的動態(tài)變化及其與臨床病理學特征的關系。

本研究發(fā)現(xiàn)，血漿中l(wèi)ncRNA H19表達水平與新輔助治療腫瘤負荷無顯著相關性，而與術(shù)后殘余腫瘤負荷相關（P＜0.05），這可能也提示血漿H19水平高的患者與更好的預后有關。

HER2+乳腺癌患者血漿H19表達量顯著高于其他亞型，血漿中的lncRNA H19表達量與新輔助治療有顯著相關性，且下降更明顯的患者更容易達到pCR，可作為預測不同分子亞型新輔助治療效果的潛在預測因子。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。