吳華鑫，趙野，王浩宇，張鳳祥，鄒剛，閆永慶

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

鹽害是全球性的資源與生態(tài)問題，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最重要的逆境危害之一[1]。土壤中鹽分的增加會(huì)引起土壤理化性質(zhì)改變，間接導(dǎo)致植物受到傷害。植物在遭受鹽害之后，生長發(fā)育受到影響，嚴(yán)重時(shí)萎蔫死亡[2]。鹽脅迫的危害也表現(xiàn)在降低植物的發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢，推遲萌發(fā)時(shí)間，從而導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低；同時(shí)還影響植物對(duì)離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，降低對(duì)鉀(K)、氮(N)、磷(P)等營養(yǎng)素的吸收，而且植物在鹽脅迫下吸收的離子相對(duì)單一，體內(nèi)其他離子也會(huì)流失，從而導(dǎo)致營養(yǎng)失衡，使?jié)B透調(diào)節(jié)等多方面紊亂[3]。植物為了應(yīng)對(duì)鹽脅迫形成了多種復(fù)雜的抵御機(jī)制，如積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、離子區(qū)域化、形成大分子蛋白增加親水性等[4]，除此之外，維護(hù)膜系統(tǒng)的完整性、內(nèi)源激素和光合作用調(diào)節(jié)也能夠抵御和緩解鹽脅迫。

Ca2＋在植物為應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫而形成的各種調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，不僅是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的關(guān)鍵物質(zhì)，還是植物生長發(fā)育必不可少的大量營養(yǎng)元素，缺少Ca2＋可使植物幼葉枯黃，根系發(fā)育遲緩，甚至枯死[5]。Ca2＋的存在可使細(xì)胞內(nèi)維持膠體狀態(tài)，中和細(xì)胞內(nèi)代謝出的有機(jī)酸，維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿度在正常水平，從而保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Ca2＋濃度的降低或升高可以影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的生長[6]。Ca2＋作為第二信使，能夠根據(jù)不同的刺激信號(hào)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，通過作用于不同位置、不同時(shí)間進(jìn)行特異性調(diào)控[7]；而Ca2＋結(jié)合蛋白通過對(duì)鈣信號(hào)進(jìn)行分析，引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生抗逆反應(yīng)，并直接或間接參與植物防御反應(yīng)，調(diào)控下游蛋白，以響應(yīng)環(huán)境脅迫。大量研究表明，外源Ca2＋可以提高植物的抗逆性，如施加外源Ca2＋能有效減輕干旱對(duì)結(jié)縷草的傷害[8]，提高鹽脅迫下棉花的根冠比和有機(jī)物積累[9]，增加芒果的可溶性糖含量并降低在儲(chǔ)存期間的發(fā)病率[10]，提高鹽脅迫下草木樨葉片的氣孔指數(shù)及維持細(xì)胞正常形態(tài)和功能[11]；適當(dāng)濃度的外源Ca2＋可以提高水曲柳的光合作用電子傳遞效率、葉綠素含量、水分利用效率，從而緩解脅迫造成的傷害[12]。但外源Ca2＋的濃度并不是越高越好，當(dāng)濃度過高時(shí)富余的Ca2＋能與磷酸鹽在細(xì)胞內(nèi)形成沉淀，使得植物的光合作用降低，生長速率減慢[13]。

西伯利亞白刺(Nitraria sibiricaPall.)為蒺蔾科白刺屬(NitrariaL.)落葉具刺小灌木，大多分布于我國青海、甘肅等地，具有較強(qiáng)的耐鹽能力，是治理土壤鹽化的優(yōu)良樹種。其果實(shí)含有豐富的維生素，可直接食用亦可做成果脯、飲料；葉片可作為飼料，也可用于生產(chǎn)降血壓和消炎的藥物，具有一定的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值。白刺根系發(fā)達(dá)，比地上部大4~22倍，其龐大的根系能夠固定土壤和水分，長期生長的白刺周圍土壤含鹽量顯著降低，因此常作為鹽堿地綠化先鋒樹種使用，在鹽堿地改良中發(fā)揮重要作用[14]。但目前有關(guān)外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺抗氧化酶活性以及內(nèi)源激素含量影響的研究報(bào)道尚少。因此，本試驗(yàn)研究了在300 mmol?L－1NaCl脅迫下澆灌15 mmol?L－1CaCl2對(duì)西伯利亞白刺抗氧化生理特性和內(nèi)源激素含量的影響，以探究外源Ca2＋緩解其鹽脅迫傷害、提高抗鹽性的機(jī)理，為應(yīng)用外源Ca2＋提高白刺對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性提供理論基礎(chǔ)，為今后鹽堿區(qū)篩選和應(yīng)用耐鹽園林植物提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為西伯利亞白刺實(shí)生苗，種子由吉林省白城市林業(yè)科學(xué)研究院提供。播前將西伯利亞白刺種子先溫水浸泡72 h，然后播于穴盤中，基質(zhì)為按1∶1∶1(體積比)混合的純凈河沙、園土、草炭土；置于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)連棟溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，自然光照，培養(yǎng)溫度在17~28℃之間；待幼苗長出5~6片真葉時(shí)，定植到10 cm×10 cm的塑料花盆中，養(yǎng)護(hù)條件不變，待其長勢良好，選取生長狀態(tài)一致的白刺苗，根部用清水浸泡并沖洗干凈后栽植到裝有純凈河沙的花盆中，用1/2Hoagland全營養(yǎng)液澆灌緩苗，2周后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)得知，300 mmol?L－1是西伯利亞白刺耐受NaCl脅迫的閾值濃度，鹽脅迫3 d時(shí)實(shí)生苗所受傷害較為明顯，而15 mmol?L－1CaCl2對(duì)鹽脅迫的緩解作用最佳。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)0、300 mmol?L－1NaCl和0、15 mmol?L－1CaCl2組合的4種處理:CK，空白對(duì)照，無NaCl、CaCl2處理；Ca2＋處 理，15 mmol?L－1CaCl2；NaCl處 理，300 mmol?L－1NaCl；NaCl＋Ca2＋處理，300 mmol?L－1NaCl＋15 mmol?L－1CaCl2。每盆種植3株西伯利亞白刺，每個(gè)處理10盆，共40盆。NaCl和CaCl2均按設(shè)計(jì)濃度對(duì)實(shí)生苗進(jìn)行澆灌，為防止實(shí)生苗產(chǎn)生鹽激反應(yīng)，鹽處理時(shí)從50 mmol?L－1NaCl開始澆灌，逐天增加50 mmol?L－1鹽濃度，待達(dá)到預(yù)設(shè)濃度后，繼續(xù)連續(xù)澆灌3 d，澆灌量大于基質(zhì)持水量，便于多余鹽分流出以保持鹽濃度的穩(wěn)定。處理結(jié)束一天后取樣，將白刺葉片清洗干凈后放入－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標(biāo)及方法

葉片相對(duì)含水量的測定參照高俊鳳[15]的方法；葉綠素含量的測定采用丙酮－乙醇混合法[15]；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法[15]；SOD活性的測定采用氮藍(lán)四唑顯色法[15]；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]；CAT活性的測定參考王學(xué)奎[16]的方法；內(nèi)源激素(IAA、ABA、GA)含量采用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與計(jì)算，利用GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)并繪圖，運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片相對(duì)含水量及葉綠素和MDA含量的影響

由表1可見，與CK相比，Ca2＋處理對(duì)西伯利亞白刺葉片的相對(duì)含水量無顯著影響，NaCl處理則顯著降低葉片相對(duì)含水量20%；較NaCl處理，NaCl＋Ca2＋處理的葉片相對(duì)含水量明顯增加，但仍低于CK，差異未達(dá)顯著水平?？傮w來看，鹽脅迫使西伯利亞白刺葉片的相對(duì)含水量顯著下降，而增施外源Ca2＋能緩解鹽脅迫傷害，使葉片相對(duì)含水量基本回升到正常水平。

正常生長狀態(tài)下施加外源Ca2＋能增加西伯利亞白刺的葉綠素含量，但增幅較小，與CK差異不顯著；NaCl處理下，葉綠素含量比CK下降了22%，差異顯著；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理使西伯利亞白刺的葉綠素含量顯著增加，但仍明顯低于CK(表1)。表明外源Ca2＋的施加有利于NaCl脅迫下西伯利亞白刺的葉綠素生成。

NaCl處理下西伯利亞白刺葉片中的MDA含量顯著高于其它處理，分別是CK、Ca2＋處理、NaCl＋Ca2＋處理的1.74、1.76、1.55倍；其余三處理間差異不顯著(表1)。說明NaCl脅迫下西伯利亞白刺的膜脂過氧化反應(yīng)劇烈，產(chǎn)生大量MDA，而外加Ca2＋能夠有效降低NaCl脅迫的傷害，使MDA產(chǎn)量控制在對(duì)照水平。

表1 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片 相對(duì)含水量、葉綠素和MDA含量的影響

2.2 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性的變化 如圖1所示，與CK相比，NaCl脅迫顯著提高SOD活性，提高了67%；Ca2＋和NaCl＋Ca2＋處理的SOD活性進(jìn)一步升高，兩者間差異不顯著，但顯著高于CK和NaCl處理；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的SOD活性顯著提高0.3倍。表明，施加外源Ca2＋能提高鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中的SOD活性，加速對(duì)超氧陰離子的歧化反應(yīng)，從而提高其耐鹽能力。

圖1 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中SOD活性的影響

2.2.2 POD活性的變化 如圖2所示，Ca2＋和NaCl處理的POD活性與CK相比無顯著變化，但顯著低于NaCl＋Ca2＋處理；NaCl＋Ca2＋處理比NaCl處理的POD活性增加了14%。表明NaCl脅迫下施加外源Ca2＋能有效增強(qiáng)西伯利亞白刺葉片內(nèi)POD的活性，提高清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的能力，使光呼吸作用穩(wěn)定進(jìn)行，增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的耐受能力。

圖2 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺POD活性的影響

2.2.3 CAT活性的變化 如圖3所示，與CK相比，NaCl、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋處理的CAT活性均顯著增高，分別是CK的1.50、1.90、1.87倍；NaCl＋Ca2＋處理的CAT活性比NaCl處理升高25%?？梢娛┘油庠碈a2＋能提高鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片內(nèi)CAT的活性，從而提高其分解過氧化氫的能力，減弱鹽脅迫造成的氧化傷害，提高植株的耐鹽能力。

圖3 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞 白刺CAT活性的影響

2.3 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片內(nèi)源激素含量的影響

2.3.1 ABA含量的變化 ABA是一種應(yīng)急脅迫激素，能夠在不同逆境下調(diào)節(jié)植物的適應(yīng)性。從圖4可以看出，Ca2＋處理的ABA含量與CK基本一致；NaCl處理顯著提高ABA含量，是對(duì)照組的1.65倍；NaCl＋Ca2＋處理的ABA含量顯著高于CK，但顯著低于NaCl處理20%。一般來說，ABA含量的增加與植物抗逆性的增強(qiáng)呈正相關(guān)，因此，施加外源Ca2＋能減弱NaCl脅迫對(duì)西伯利亞白刺的傷害，使其更能適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

圖4 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞 白刺ABA含量的影響

2.3.2 IAA含量的變化 由圖5可知，NaCl處理的IAA含量顯著低于CK、Ca2＋、NaCl＋Ca2＋處理，后三者間無明顯差異。與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的IAA含量顯著增加19%?？梢?，施加外源Ca2＋可使鹽脅迫下西伯利亞白刺葉片中的IAA含量恢復(fù)到正常水平。

圖5 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞 白刺IAA含量的影響

2.3.3 GA含量的變化 由圖6可見，各處理下西伯利亞白刺的GA含量變化基本與IAA一致，也表現(xiàn)為與CK相比，NaCl處理顯著降低GA含量(降幅為20%)，而Ca2＋和NaCl＋Ca2＋處理對(duì)其無明顯影響；與NaCl處理相比，NaCl＋Ca2＋處理的GA含量顯著升高24%。表明施加外源Ca2＋能將NaCl脅迫下西伯利亞白刺葉片內(nèi)GA含量恢復(fù)到正常水平。

圖6 外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下西伯利亞 白刺GA含量的影響

3 討論與結(jié)論

植物一切生理功能都與水有著極為密切的關(guān)系，葉片相對(duì)含水量是植物內(nèi)部保水能力的最直接表現(xiàn)，關(guān)系著其生理功能能否正常進(jìn)行[17]。本研究結(jié)果表明，在300 mmol?L－1NaCl脅迫下，西伯利亞白刺葉片的相對(duì)含水量顯著降低，與在蒙古黃芪幼苗上的研究結(jié)論一致[18]，說明土壤中含鹽較高時(shí)，吸水困難，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生失水現(xiàn)象[19，20]。葉綠素含量的多少能在一定程度上反映植株同化物質(zhì)能力的強(qiáng)弱[21]。本研究中，西伯利亞白刺在鹽脅下葉片葉綠素含量降低，說明植物遭受逆境脅迫時(shí)，葉綠體會(huì)被傷害，可能從葉綠素合成速度減緩而分解速率加快、相關(guān)合成酶活性減弱而分解酶活性增強(qiáng)兩種途徑減少葉綠素含量[22，23]。施加15 mmol?L－1外源Ca2＋后，西伯利亞白刺葉片的相對(duì)含水量、葉綠素含量明顯升高，說明Ca2＋可能通過調(diào)節(jié)氣孔大小和光合作用來增加植物體內(nèi)水分和葉綠素含量，從而提高植物抗性，這與Medvedev[24]的研究結(jié)論一致。

鹽脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，MDA作為指示生物膜和酶損傷程度的重要指標(biāo)，能夠反映植物的抗氧化水平。本研究中，300 mmol?L－1NaCl處理后西伯利亞白刺葉片中的MDA含量顯著增加，說明膜系統(tǒng)受到明顯傷害，這與劉會(huì)超等[25]在五葉地錦上的研究結(jié)果一致。植物抗氧化系統(tǒng)中的SOD、POD、CAT三種酶，在免除植物氧化損傷和清除體內(nèi)活性氧中發(fā)揮著重要作用。本研究中SOD、CAT活性在300 mmol?L－1NaCl脅迫下增加，分別比CK增加67%和50%，而POD活性無明顯變化，這與范海霞等[26]在菊花上的研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)槲鞑麃啺状虨檩^典型的鹽生植物，本身有著較強(qiáng)的耐鹽能力，所以POD活性變化不是很明顯。施加15 mmol?L－1外源Ca2＋后，西伯利亞白刺葉片中的SOD、POD、CAT活性均有所提高，分別是NaCl脅迫下的1.30、1.14、1.25倍。

綜上，Ca2＋除了能使植物膜結(jié)合蛋白保持穩(wěn)定外，也在緩解鹽脅迫中起著重要作用。正常情況下細(xì)胞內(nèi)外的Ca2＋會(huì)維持在一個(gè)穩(wěn)定平衡的狀態(tài)，但當(dāng)受到外界非生物脅迫時(shí)，胞外Ca2＋會(huì)內(nèi)流，使胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，若內(nèi)流持續(xù)時(shí)間較短則內(nèi)流完成后會(huì)再次恢復(fù)到平衡狀態(tài)，這是Ca2＋行使信號(hào)作用的基礎(chǔ)[27]。而外源Ca2＋的增加相當(dāng)于增加了信號(hào)的強(qiáng)度，可以引發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)，通過增加抗氧化酶活性加速清除胞內(nèi)的活性氧，降低活性氧的積累，減弱膜脂過氧化的程度[28，29]，以維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。

植物遭受鹽害時(shí)也會(huì)通過改變體內(nèi)激素含量調(diào)控不同的代謝活動(dòng)，以使自身能維持正常的生命活動(dòng)。本研究中，西伯利亞白刺在300 mmol?L－1NaCl脅迫下，體內(nèi)ABA含量顯著增加，IAA、GA含量顯著下降，這與羅玉婕等[30]在海棠上的研究結(jié)果一致。ABA可以調(diào)節(jié)氣孔的開合度和蒸騰速率，受到鹽脅迫時(shí)，ABA大量積累，可使氣孔變小、蒸騰速率降低，從而減少體內(nèi)水分流失[31]；在分子層面，它還可以通過誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化酶基因、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因和抗鹽基因表達(dá)來增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，降低滲透勢，從而減輕鹽脅迫的傷害[32，33]。本研究中，與ABA在鹽脅迫下含量增加不同，IAA、GA兩種促進(jìn)型激素在鹽脅迫下含量減少，可能原因是Na＋和H＋通過Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使得細(xì)胞內(nèi)Na＋向外排出，H＋在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量增加，IAA合成場所所需的正常pH環(huán)境受到干擾，使IAA含量下降[34]；GA能減小氣孔阻力，提高蒸騰速率，受離子毒害作用更加明顯，在鹽脅迫環(huán)境下含量下降。施加外源Ca2＋后，ABA含量下降了20%，IAA和GA含量則分別增加了19%和24%，這與李青云等[35]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)镃a2＋參與了激素對(duì)生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，抑制了ABA的增長，促進(jìn)了IAA、GA的生成。Li等[36]的研究表明ABA在誘導(dǎo)鈣依賴蛋白酶(CDPK)的產(chǎn)生和對(duì)一些相關(guān)酶及基因的調(diào)控全部依賴于Ca2＋。

綜上所述，300 mmol?L－1NaCl脅迫對(duì)西伯利亞白刺的相對(duì)含水量、葉綠素和MDA含量、抗氧化酶活性、內(nèi)源激素含量產(chǎn)生明顯影響，施加15 mmol?L－1外源Ca2＋可通過改變抗氧化酶活性和內(nèi)源激素含量來減弱鹽脅迫的傷害。但有關(guān)西伯利亞白刺耐鹽機(jī)制的研究尚不完善，激素與Ca2＋的關(guān)系也需要進(jìn)一步探明，今后可從調(diào)控Ca2＋的相關(guān)基因、Ca2＋的受體蛋白、Na＋的受體蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)基因等方面進(jìn)一步探索。