梁笑傾 萬慧芳 劉卓琦 萬福生

宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的婦科惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率呈明顯上升和年輕化趨勢[1]。目前治療宮頸癌的主要有效方法是手術(shù)、放療及手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療，然對于復發(fā)轉(zhuǎn)移、晚期宮頸癌患者療效較差[2]。宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程極其復雜，具體機制仍不甚明確[3]。最近有研究顯示[4]一些藥物及抑癌基因?qū)θ藢m頸癌HeLa細胞可能通過調(diào)控代表上皮特征的E-cadherin、代表間質(zhì)特征的N-cadherin 及基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP2、MMP9)表達,進而逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生,發(fā)揮抑制宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

?；撬?Taurine,Tau)化學名為2-氨基乙磺酸，是一種內(nèi)源性細胞保護物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣平衡及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能[5]。近年發(fā)現(xiàn)[6-7]Tau可誘導宮頸癌等多種癌細胞凋亡，抑制結(jié)直腸癌與乳腺癌的生長及侵襲遷移，但Tau對宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響如何尚未見報道。本文利用宮頸癌Hela細胞探討了Tau對人宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制，旨在為宮頸癌的防治提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人宮頸癌細胞Hela細胞株購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。?；撬?SLBP8056V，Sigma公司)，胰蛋白酶、RPMI-1640 培養(yǎng)基、細胞裂解液均購自于Solarbio 公司，CCK8試劑(上海東仁化學科技有限公司)。GSK-3β單克隆抗體(Cat.Ab32391) ，pho-GSK-3β(Ser9)單克隆抗體(Cat.ab75814) ，E-cadherin單克隆抗體(Cat.Ab1416，Abcam公司)，N-cadherin多克隆抗體(Cat.Ab18203),Vimentin單克隆抗體(Cat.Ab92547),MMP2多克隆抗體(Cat.Ab37150),MMP7多克隆抗體(Cat.Ab5706),MMP9多克隆抗體(Cat.Ab38898),辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)北京中杉金橋公司。

1.2 CCK8檢測細胞增殖活性

用0.25%胰酶在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行消化及37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。實驗分組如下：空白對照組(Control，不含Tau)、Tau 20 mmol/L 組、Tau 40 mmol/L組、Tau 80 mmol/L組和Tau 160 mmol/L組。

取經(jīng)胰酶消化制成密度約3×104個/mL單細胞懸液，以100 μL每孔接種于96孔板中，共接種3塊96孔板(每組設3個復孔)。經(jīng)培養(yǎng)過夜后，棄去舊的培養(yǎng)基，換成含不同溶度Tau(0、20、40、80、160 mmol/L)的完全培養(yǎng)基，分別作用24 h、48 h、72 h。從第二天開始，每隔12 h取1塊96孔板，更換并加入100 μL新培養(yǎng)基(其中含有10 μL CCK8)，孵育3 h。在波長450 nm處測定其吸光度值。實驗重復3次。

1.3 Transwell小室檢測細胞遷移能力

將生長良好的人宮頸癌Hela細胞用不含血清的培養(yǎng)基饑餓處理12 h，然后用含0.25% EDTA的胰酶消化，并用完全培養(yǎng)基終止消化，無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL。在Transwell小室的上室內(nèi)加入200 μL上述細胞懸液，24孔板中的下室加入600 μL含不同濃度Tau的10%血清的培養(yǎng)基，小室置于24孔板中，處理48 h。然后用棉簽擦去上室細胞，PBS清洗3次后用4%細胞組織固定液固定細胞20 min，晾干后用1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌3次。小室干燥后在倒置顯微鏡下觀察并使用圖像采集系統(tǒng)選取上、中、下、左、右5個視野于100倍鏡下進行觀察并拍照，計數(shù)并求其平均穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.4 Transwell小室檢測宮頸癌Hela細胞侵襲能力

先將Matrigel膠分別與不含血清的H-DMEM和RPMI-1640基礎培養(yǎng)基按1∶8的比例混合均勻(在冰上進行)。取該混合物60 μL鋪于已預冷的小室中，將小室置于24孔板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜凝固成膠狀。然后接種細胞于小室中，接種于小室的細胞數(shù)為2×105個/孔，其余步驟與Transwell小室遷移實驗一致，計算細胞侵襲能力。實驗重復了3次。

1.5 用Western blot檢測宮頸癌細胞中蛋白水平

收集經(jīng)Tau處理48 h的宮頸癌細胞，在冰上用 RIPA 細胞裂解液進行裂解，12000 r/min離心(4 ℃)10 min，取上清液。采用 PierceBCA ProteinAssayKit試劑盒檢測蛋白濃度，按20 μg蛋白上樣量將蛋白樣品與上樣緩沖液(5×) 按 4∶1 的體積比例混合，沸水中煮5 min使蛋白變性。冷卻后，經(jīng)10%SDS-PAGE并半干電泳轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入PTEN、AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、 β-catenin等一抗抗體，4 ℃ 孵育過夜。次日在室溫下加入二抗再孵育2 h，以ECL化學發(fā)光法顯色，X線膠片曝光成像，掃描儀掃描蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，組間進行單因素方差(one-way ANOVA)，假若方差齊性，則使用LSD (L)法進行兩兩比較，若方差不齊性時，使用Dunnett,s (T3)法分析，以P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 Tau對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用

用不同濃度Tau(0、20、40、80和160 mmol/L)分別處理宮頸癌Hela細胞不同時間段(24 h、48 h和72 h),利用CCK8檢測Tau在不同濃度和時間對Hela細胞增殖的影響。結(jié)果如下圖所示(圖1)。結(jié)果顯示，濃度為20～160 mmol/L的Tau分別作用細胞24 h、48 h和72 h后，對Hela細胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，且呈一定的量效關(guān)系和時效關(guān)系。

圖1 Tau對人宮頸癌Hela細胞增殖的影響

2.2 Tau對宮頸癌Hela細胞侵襲和遷移的影響

利用Transwell小室觀察不同濃度Tau對Hela細胞侵襲與遷移的影響，以證實Tau處理濃度及時間效應關(guān)系。結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，經(jīng)Tau處理細胞48 h后，Hela細胞的遷移和侵襲能力，隨著Tau濃度的升高，穿膜細胞的數(shù)量逐漸減少，表明Hela細胞的遷移和侵襲能力明顯逐漸下降。

圖2 Tau對人宮頸癌Hele細胞的侵襲和遷移的影響

2.3 Tau對宮頸癌Hela細胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白和MMPS蛋白表達的影響

采用Western blot檢測Hela細胞中EMT相關(guān)標志蛋白的表達變化及MMPS蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)Tau處理細胞48 h后，隨著Tau濃度的增加，Hela細胞中代表上皮特征的E-Cadherin蛋白表達呈顯著上調(diào)；相反代表間質(zhì)特征的N-Cadherin和Vimen-tin則出現(xiàn)表達下降(圖3)，此結(jié)果表明Tau可以阻礙EMT的發(fā)生發(fā)展進程。同樣，細胞中MMP2、MMP7、MMP9的蛋白表達也隨著Tau濃度的增加有明顯逐漸降低(圖4)，表明Tau可抑制Hela細胞中MMP2、MMP7、MMP9的表達，且呈劑量依賴性。

圖3 Tau對人宮頸癌細胞中EMT相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 Tau對人宮頸癌Hele細胞中 MMPs蛋白表達的影響

2.4 Tau對宮頸癌Hele細胞中AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影響

通過免疫印跡分析細胞中PTEN、GSK-3β、AKT和β-catenin 的蛋白水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，經(jīng)Tau處理48 h后，Hele細胞中PTEN、GSK-3β蛋白水平隨著Tau濃度的增高而逐漸升高，且p-AKT水平也逐漸增高；相反，AKT和β-catenin表達則隨著Tau濃度的增大而逐漸減弱，p-GSK-3β水平也逐漸下降。這些結(jié)果表明，Tau可促進PTEN、GSK-3β的表達，并通過調(diào)控 AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路，調(diào)控宮頸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

圖5 AKT/GSK-3β/β-Catenin通路相關(guān)蛋白表達的變化

3 討論

宮頸癌易于深浸宮頸間質(zhì)、血管淋巴間隙，較早出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，這也是宮頸癌預后較差的原因。宮頸癌的發(fā)生及其侵襲轉(zhuǎn)移是由一系列基因調(diào)控、多種機制共同作用的動態(tài)生物學過程，多種癌基因和抑癌基因通過參與癌細胞自噬及凋亡途徑而發(fā)揮促進或抑制腫瘤生長的效應，如PI3K、AKT、Bax、BcL-2等[8]。Tau對宮頸癌Hela細胞侵襲轉(zhuǎn)移與PI3K/AKT/GSK-3β/β-Catenin通路的影響如何尚未見報道。有研究表明，宮頸癌患者體內(nèi)有Akt基因突變[9]，宮頸癌的致癌基因與p53相互作用可調(diào)控宮頸癌細胞中的PI3K/Akt信號通路[10]。PI3K位于Ras信號通路的下游，PI3K/Akt/GSK-3β是最重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，在調(diào)節(jié)細胞增殖、存活和侵襲中起主要作用。PI3K不僅是癌細胞形成的主因之一，還導致癌細胞的大量繁殖。PI3K激活AKT、GSK-3等下游分子，將多種生長因子及細胞因子的信號傳遞到細胞內(nèi)，從而對細胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運起重要的調(diào)節(jié)作用。故PI3K/Akt信號通路的激活是實體瘤細胞生長和生存的主要決定因素[11]。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是AKT/GSK-3β信號通路調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)鍵分子，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。最近許多研究認為GSK-3β可作為多種不同類型癌癥的一個潛在的治療靶點[13]，在控制癌細胞侵襲和遷移方面發(fā)揮重要作用。PTEN(腫瘤抑制因子)是PI3K/Akt信號通路的重要負調(diào)節(jié)因子。PTEN通過降低AKT的磷酸化水平，從而阻斷PI3K/Akt信號通路激活，使PI3K/Akt蛋白水平降低，促進癌細胞凋亡。故PTEN增多，抑制PI3K/Akt信號通路，進而抑制細胞的增殖、存活。本研究中發(fā)現(xiàn)Hele細胞中隨著Tau濃度增加，PTEN 蛋白水平升高，AKT降低，GSK-3β濃度升高，細胞增殖抑制。

橙皮素可通過調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路干預宮頸癌EMT過程和抑制宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[14]。有研究發(fā)現(xiàn)Tau可協(xié)同順鉑發(fā)揮抑制宮頸癌生長[15]，與其他化療藥物合用，對腫瘤治療具有增效減毒作用[16]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)?；撬峥赏ㄟ^上調(diào)人哺乳動物不育系20樣激酶1(MST1)蛋白表達誘導宮頸癌細胞凋亡[6,17]，但Tau對宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療效果如何尚未完全清楚。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的激活是癌細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，典型特征是上皮分子標志物(E-Cadherin)的丟失和間質(zhì)細胞標志物(Vim-enin/N-Cadherin)的表達上調(diào)，即E-Cadherin與上皮癌的進展、局部浸潤和轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。本文以宮頸癌Hela細胞為對象，通過Transwell小室和Western blot方法，探討了Tau對宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的影響及其可能機制。結(jié)果顯示，Tau能顯著性降低宮頸癌Hela細胞的遷移和侵襲能力，且呈劑量依賴性；同時，Tau能顯著性降低Hela細胞中代表間質(zhì)細胞特征的N-Cadherin和Vimentin的表達，提高代表上皮細胞特征的E-Cadherin的表達。此結(jié)果提示Tau不僅有抑制宮頸癌Hela細胞遷移和侵襲的作用，還可能具有阻止或逆轉(zhuǎn)Hela細胞的EMT作用，類似報道是Tau對乳腺癌細胞EMT有較好的抑制作用[7]。

腫瘤的浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，還與血管快速生長密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是血管快速生長影響因素之一。本研究中發(fā)現(xiàn)，MMP濃度隨Tau濃度的增大而降低，細胞凋亡增加。表明Tau抑制腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移，可通過抑制MMP濃度，且呈劑量負相關(guān)。

Wnt/β-Catenin信號通路中的β-Catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，在細胞連接處與代表上皮細胞特征的E-Cadherixn相互作用，參與黏合帶形成。過多的游離β-Catenin進入細胞核，引起腫瘤發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)，試驗組隨著Tau濃度增加，β-Catenin濃度減少，細胞凋亡增多。

本文實驗結(jié)果顯示，Tau能劑量依賴性地提高Hele細胞中GSK-3β、PTEN蛋白水平，并使AKT蛋白磷酸化水平增強，AKT水平降低；另一方面，β-catenin表達則隨著Tau濃度的增大而逐漸減弱。結(jié)果表明Tau促進宮頸癌Hela細胞凋亡，抑制EMT轉(zhuǎn)化，并通過調(diào)控PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路，最終達到抑制宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。