王化敦，張 鵬*，馬鴻翔

（1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室，江蘇南京 210014；2 揚州大學農(nóng)學院 / 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物基因組學與分子育種重點實驗室，江蘇揚州 225009）

氮(N)作為生物大分子如核酸、蛋白質的基本組分，是植物生長發(fā)育需要量最多的礦質營養(yǎng)元素，也是大多數(shù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中作物產(chǎn)量的限制因子[1]。在通氣土壤中，不同形態(tài)的人工合成氮肥在微生物(主要是硝化細菌)作用下轉變?yōu)橄鯌B(tài)氮(NO3--N)，成為無機態(tài)氮素的主要存在形式[2]；在淹水條件下，作物(如水稻)根系通過泌氧和根系分泌物形成的根際微環(huán)境可將不同形態(tài)氮轉化為硝態(tài)氮，亦是植物利用的重要氮素形態(tài)[3]。

目前，植物中已報道參與硝態(tài)氮吸收和運輸?shù)霓D運蛋白基因家族包括：NPF(nitratetransporter1/peptidetransporterfamily)、NRT2(nitratetransporter2)、CLC(chloridechannels)和SLAC1/SLAH(slowanion channel-associated1homologues)[4-6]。在以上4個基因家族中，NRT2、CLC和SLAC1/SLAH家族成員數(shù)量較少(5～7個)，其中NRT2家族編碼高親和力(highaffinity)轉運蛋白，與伴侶蛋白NAR2 (nitrate assimilation related protein)結合，在對低氮環(huán)境的響應中具有重要功能[4]；CLC家族編碼氯離子(Cl-)通道蛋白，后來發(fā)現(xiàn)與在液泡中的儲存和運輸有關[7-8]；SLAC1/SLAH家族編碼一類對電壓反應遲緩類型(slow type)的離子通道，通過向保衛(wèi)細胞運輸Cl-和引發(fā)氣孔閉合過程，其家族成員SLAH3主要在中柱表達，可特異性轉運，與在根與地上部之間的長距離運輸有關[9-10]。

NPF家族包括NRT1(nitratetransporter1)和PTR(peptidetransporter)兩類基因，前者一般認為編碼低親和力(low-affinity) NO3-轉運蛋白，后者編碼寡肽轉運蛋白[11]，由于二者序列相似性較高，在進化關系上處于同一分支，將NRT1/PTR基因統(tǒng)一命名為NPF(NRT1PTRfamily)[12]。研究表明，NPF基因除了作為硝態(tài)氮轉運蛋白或寡肽轉運蛋白轉運和寡肽之外，還可轉運其它多種底物(、Cl-、生長素、脫落酸、赤霉素、茉莉酸、硫代葡萄糖苷、砷酸二甲酯等)，參與多種生物與非生物脅迫響應[13-14]。與其它轉運蛋白家族相比，NPF家族成員眾多，模式植物擬南芥含有53個NPF基因，糧食作物水稻、玉米和小麥中分別含有93、79和331個NPF基因[12,15-16]。近年來，NPF基因的功能獲得了較多關注和深入研究，模式植物擬南芥中已有超過一半(31/53)NPF家族成員的生物學功能被解析，糧食作物水稻中亦有16個NPF基因的生物學功能被報道(表1、圖1)。大量研究表明，NPF基因廣泛參與植物對氮素的吸收和利用過程，在改良和提高作物氮素利用率及產(chǎn)量相關性狀中具有重要作用和應用價值。本文主要針對模式植物擬南芥和糧食作物中已報道NPF基因在氮素吸收利用中的生物學功能進行綜述，以期深入理解植物高效吸收和利用氮素的機理，為提高作物氮素利用率相關研究以及作物氮高效育種實踐提供參考。

圖1 模式植物擬南芥和糧食作物中NPF基因在參與利用中的功能Fig.1 Diverse functions of NPF genes in nitrate utilization in Arabidopsis and main food crops

表1 模式植物擬南芥和主要糧食作物中已報道生物學功能的NPF基因Table 1 Functionally characterized NPF genes in Arabidopsis and main food crops

續(xù)表1 Table 1 continued

續(xù)表1 Table 1 continued

續(xù)表1 Table 1 continued

續(xù)表1 Table 1 continued

1 模式植物擬南芥中NPF基因在氮素吸收和利用中的生物學功能

1.1 參與氮素吸收與外排

AtNPF6.3(NRT1.1/CHL1)是植物中第一個被克隆的硝態(tài)氮(NO3--N)轉運蛋白基因，主要在根中表達，受誘導表達顯著上調[48]。AtNPF6.3兼具低親和力、高親和力(即dual-affinity)吸收特性，由其第101位蘇氨酸(Thr)是否磷酸化決定[98]。蛋白晶體結構分析表明，當環(huán)境中濃度充足時，AtNPF6.3中Thr101去磷酸化形成二聚體，降低了蛋白結構的靈活性，對具有低親和力吸收特性；當環(huán)境中缺乏時，Thr101磷酸化使AtNPF6.3由二聚體解離為單體，提高了蛋白結構的靈活性，對具有高親和力吸收特性[99-100]。不同于AtNPF6.3，AtNPF4.6(AtNRT1.2)僅編碼低親和力轉運蛋白，參與吸收過程[36]。AtNPF4.6主要在根毛和根表皮細胞組成型表達，并且在atnpf6.3中抑制AtNPF4.6的表達進一步降低了對的吸收，說明AtNPF6.3介導的誘導型雙親和力吸收功能和AtNPF4.6介導的組成型低親和力吸收功能相對獨立[36]。植物對的獲取是根中吸收與外排活動的綜合結果[101]。AtNPF2.7(NAXT1)主要在成熟根的皮層細胞表達，其表達受到轉錄后水平的調控，當環(huán)境酸化引起細胞質pH降低時，AtNPF2.7在蛋白水平表達顯著增加，參與根中的外排[21]，這一生理活動可能反映了植物對外界環(huán)境變化(脅迫)的適應性。此外，NPF基因家族部分成員編碼寡肽轉運蛋白(peptide transporter，PTR)，參與植物對有機態(tài)氮素的吸收過程，如atnpf8.1(ptr1)在以寡肽為氮源的培養(yǎng)基上生長時吸收的氮素顯著降低[71]。

1.2 參與氮素在營養(yǎng)器官中的運輸和分配

NPF基因亦參與在地上部不同組織器官中的運輸和分配過程。AtNPF6.3在氣孔保衛(wèi)細胞中亦有較強表達，atnpf6.3在含培養(yǎng)條件下氣孔開放受阻，這一現(xiàn)象與脫落酸(abscisic acid)對氣孔開放的抑制作用和細胞內CO2水平無關，研究發(fā)現(xiàn)atnpf6.3中保衛(wèi)細胞濃度顯著降低，誘導的去極化現(xiàn)象消失，說明AtNPF6.3通過向保衛(wèi)細胞運輸參與了氣孔活動[50]。AtNPF6.2(AtNRT1.4)主要在葉柄中表達，對維持葉片內部(葉柄、葉脈及葉片部位)的動態(tài)平衡具有重要作用，該基因突變導致葉柄中濃度顯著降低，而葉片中濃度顯著升高[46]。與幼嫩葉片(新葉)相比，成熟葉片因表面積較大具有較強的蒸騰作用，可以從蒸騰作用驅動的木質部流中獲取更多，而發(fā)育中的幼嫩葉片(新葉)相比成熟葉片需要更多的氮素供應，AtNPF1.1(AtNRT1.12)和AtNPF1.2(AtNRT1.11)共同參與了這一生物學過程，二者主要在葉片主脈韌皮部伴胞表達，并且在成熟葉片中的表達量較高，同位素示蹤試驗發(fā)現(xiàn)雙突變體atnpf1.1atnpf1.2中直接由根轉運而來的15更多流向已經(jīng)成熟的葉片而非新葉[17]。當外界供應不足時，體內貯藏的有效動員和再分配對于植物體生長尤其是幼嫩組織的發(fā)育具有重要作用，AtNPF2.13(AtNRT1.7)參與此生物學過程，該基因主要在老葉葉脈韌皮部細胞表達，并受氮饑餓誘導表達上調，突變導致老葉中濃度顯著增加，而老葉韌皮部傷流液和新葉濃度顯著降低[29]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AtNPF2.13的表達受miR827-NLA模塊的調控，NLA(nitrogenlimitationadaptation)編碼泛素連接酶，介導AtNPF2.13經(jīng)泛素化途徑降解，氮饑餓條件下NLA的表達受到miR827靶向負調控，促進下游AtNPF2.13表達上調[30]。因此，為了滿足幼嫩組織(葉片)生長發(fā)育對氮素的需求，當環(huán)境中充足時，AtNPF1.1和AtNPF1.2可以將成熟葉片主脈中的(由根轉運而來)供給新葉；當環(huán)境中缺乏時，AtNPF2.13可促進老葉中貯藏的再分配至新葉。

1.3 參與氮素向繁殖器官的運輸和分配

在繁殖生長階段，植物體由根直接吸收的氮素以及營養(yǎng)器官中儲存的氮素大部分將向繁殖器官運輸和分配。在NPF基因家族中，AtNPF8.2(AtPTR5)編碼寡肽轉運蛋白，主要在花粉、胚珠和種子中表達，參與有機態(tài)氮素向繁殖器官的運輸和分配過程，花粉管萌發(fā)試驗中該基因增強表達株系的花粉在含毒性二肽(丙氨酰乙硫氨酸)的培養(yǎng)基中萌發(fā)嚴重受阻，而敲除突變體在相同培養(yǎng)基中花粉管生長受影響程度最低[71]。

除有機態(tài)氮素(氨基酸、寡肽、多肽等)外，無機態(tài)的硝態(tài)氮()也可以在繁殖器官積累，并影響種子發(fā)育過程。AtNPF2.12(AtNRT1.6)僅發(fā)現(xiàn)在繁殖器官(角果、果柄等)維管束表達，并在授粉后表達量顯著增加，該基因敲除導致種子中濃度顯著降低，形態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)突變體在受精后胚胎發(fā)育的1-或2-細胞期，胚柄細胞出現(xiàn)過度分裂與變形萎縮，后期種子敗育率顯著增加，這一結果說明作為無機態(tài)氮源的對于擬南芥早期胚胎發(fā)育具有重要作用，AtNPF2.12參與了這一生物學過程[27]。AtNPF5.5在胚中檢測有表達，突變導致正在發(fā)育的胚中總氮含量顯著降低，影響了胚中氮素的積累，其精細表達模式以及影響胚中氮素積累的機制和對種子發(fā)育的影響有待進一步研究[43]。

1.4 參與調控植物對氮素()的響應

AtNPF6.3除了作為轉運蛋白基因吸收和轉運外，還參與調控植物對環(huán)境中的響應。首先，AtNPF6.3作為信號因子參與對的初級響應：PNR (primary nitrate response)，即供處理短時間內(0.5～1 h)轉運蛋白基因及代謝相關基因迅速增強表達[51]。AtNPF6.3與細胞質膜上受誘導表達上調的離子通道基因CNGC15互作抑制其功能，的供給解離AtNPF6.3與CNGC15的互作，促進后者對Ca2+的吸收，引起細胞質中Ca2+水平顯著提高，激活蛋白激酶CPK10/30/32對信號轉導途徑中關鍵轉錄因子NLP7的磷酸化，促進NLP7的質-核穿梭進而激活下游PNR基因[52,102-103]。這一信號轉導途徑與AtNPF6.3中第101位蘇氨酸(Thr)是否磷酸化有關，當環(huán)境中濃度較低時，被誘導迅速增強表達的蛋白激酶CIPK23-CBL9復合物對AtNPF6.3中Thr101磷酸化，對具有低水平的初級響應；當環(huán)境中濃度較高時，AtNPF6.3 (NRT1.1/CHL1)中Thr101去磷酸化，引發(fā)對高水平的初級響應[51]。其次，AtNPF6.3參與對次級響應：SNR(secondary nitrate response)，即PNR中相關基因的表達在長時間處理條件下的反饋抑制[104]。一方面，AtNPF6.3可以誘導轉錄因子LBD37/38/39表達負向調控PNR基因(如NRT2.1)的表達[53,105]；另一方面，最近報道的PNR負向調控因子NIGTs基因位于關鍵轉錄因子NLP7下游，其中NIGT1.3和NIGT1.4對PNR基因的抑制作用依賴AtNPF6.3-CNGC15-Ca2+-CPK-NLP模塊，由于NLP對下游誘導基因的直接正向調控相比NLP-NIGTs途徑對下游基因的負向調控反應更為迅速，從而導致很多轉運蛋白基因(NPF、NRT2)和代謝相關基因(NR、NIA)表現(xiàn)出對的初級響應(PNR)和次級響應(SNR)[104,106-107]。再次，AtNPF6.3參與植物根系適應環(huán)境中不同濃度的“覓食”過程。當環(huán)境中濃度較低時，AtNPF6.3可以轉運生長素，減少側根原基和新生側根中生長素的積累，導致側根生長發(fā)育受阻；當環(huán)境中濃度較高時，AtNPF6.3的生長素轉運功能受到抑制，側根原基和新生側根中生長素濃度增加，促進側根發(fā)育[54]。

最近，Chen等[35]報道AtNPF4.4(NRT1.13)在調節(jié)體內的分配中具有重要功能。AtNPF4.4定位在細胞質膜，主要在葉柄和莖節(jié)部位靠近木質部的薄壁細胞中表達。atnpf4.4表現(xiàn)出濃度依賴的晚花、分支發(fā)生與生長缺陷，進一步研究表明，atnpf4.4中經(jīng)由節(jié)向葉片、分支中的“橫向”分配減少，并且在低氮(0.2 mmol/L)條件下更為顯著。值得注意的是，由于在第10和第11跨膜結構域之間高度保守，對轉運活性具有重要作用的脯氨酸位點被絲氨酸取代(P487S)，AtNPF4.4體外試驗不具有轉運的功能，但可以結合，說明AtNPF4.4可能具有感知體內水平，并通過調節(jié)在節(jié)部位的橫向分配以維持植物對低氮環(huán)境的適應性。由于AtNPF4.4不具有轉運功能，其參與體內分配的分子機制以及承擔轉運功能的組分有待進一步發(fā)掘。

2 糧食作物中NPF基因在氮素吸收和利用中的生物學功能

2.1 水稻

目前，糧食作物中有關NPF基因的研究主要集中在水稻中(表1、圖1)。已報道OsNPF2.4、OsNPF5.16、OsNPF6.1、OsNPF6.3、OsNPF6.5、OsNPF7.1、OsNPF7.2、OsNPF7.4和OsNPF7.7參與吸收過程[76,79-82,85-86,90]，OsNPF4.5在根系通過叢枝菌根共生途徑獲取中具有重要功能[78]，進一步拓寬了人們對植物獲取途徑的認知，這些基因在參與吸收過程中是否存在互作關系(協(xié)同、冗余、拮抗等)有待深入研究。其中OsNPF2.4和OsNPF6.5與另外一個家族成員OsNPF2.2在根維管組織(木質部)中表達量較高，與擬南芥中AtNPF2.3、AtNPF6.3和AtNPF7.3功能相似，三者亦參與由根向地上部的長距離運輸過程[75-76,82]；OsNPF5.16在根、莖基部和葉鞘中表達水平較高，亦參與由根向葉鞘的分配過程[79]；OsNPF7.2主要在根伸長區(qū)和成熟區(qū)厚壁細胞、皮層與中柱表達，除了參與吸收，還與在根中不同部位的分配有關[86]；OsNPF7.7存在兩種可變剪接OsNPF7.7-1(編碼較長產(chǎn)物)和OsNPF7.7-2(編碼較短產(chǎn)物)，分別定位在細胞膜(OsNPF7.7-1)和液泡膜(OsNPF7.7-2)，提高其表達水平則分別促進了對和的吸收[90]。值得注意的是，OsNPF5.16與已報道NFP7亞家族成員OsNPF7.1、OsNPF7.2、OsNPF7.3、OsNPF7.4和OsNPF7.7均參與水稻蘗芽的發(fā)育，并最終影響水稻分蘗。其中OsNPF7.1和OsNPF7.4在蘗芽中對不同供氮水平具有相反的表達模式，對蘗芽的生長發(fā)育分別具有促進和抑制作用[85]。分析表明，OsNPF5.16和OsNPF7.2表達變化影響了莖蘗基部細胞分裂素(cytokinins, CKs)水平，并且后者同時影響了獨腳金內酯(strigolactones, SLs)信號途徑相關基因的表達，說明CKs信號途徑參與了OsNPF5.16依賴的蘗芽生長發(fā)育[79]，CKs和SLs信號途徑協(xié)同參與了OsNPF7.2依賴的蘗芽生長發(fā)育[87]，對于其它NPF基因(OsNPF7.1、OsNPF7.3、OsNPF7.4和OsNPF7.7)參與蘗芽生長發(fā)育是否涉及CKs、SLs或其它激素(如生長素)，有待進一步研究。

OsNPF6.5(OsNRT1.1B)是AtNPF6.3(NRT1.1/CHL1)在水稻中的功能性同源基因，該基因定位在細胞膜上，受誘導表達顯著增強[82]。與AtNPF6.3類似，OsNPF6.5不僅參與吸收和由根向地上部的長距離運輸，還參與調控水稻對初級響應[81-82]。不同于擬南芥PNR反應中依賴AtNPF6.3、由第二信使Ca2+和磷酸化修飾介導信號關鍵轉錄因子AtNLP7的質-核穿梭[104]，在OsNPF6.5調控的PNR反應中，磷信號途徑關鍵抑制因子OsSPX4可以與信號關鍵轉錄因子OsNLP3互作抑制其質-核穿梭，可以促進OsNPF6.5與OsSPX4結合，并招募OsNPF6.5互作蛋白OsNBIP1 (OsNRT1.1B Interacting Protein 1)介導OsSPX4經(jīng)泛素化途徑降解，增強OsNLP3的質-核穿梭引發(fā)PNR反應，同時促進了磷信號途徑相關基因的表達[83]。因此，水稻中OsNPF6.5作為關鍵因子整合了信號轉導途徑(PNR反應)和受調節(jié)的磷信號轉導途徑(即促進對磷的吸收利用)。進一步研究表明，OsNPF6.5還可以調節(jié)水稻根際氮代謝功能相關微生物區(qū)系組成，影響根際對氮素的吸收[84]。Wang等[81]報道了AtNPF6.3在水稻中的另外一個同源基因OsNPF6.3(OsNRT1.1A)。不同于OsNPF6.5定位在細胞膜，OsNPF6.3定位在液泡膜，并且受另外一種無機態(tài)氮素銨誘導表達顯著增強。與OsNPF6.5基因功能相比，OsNPF6.3不僅能促進對的吸收，還促進了對的吸收，說明OsNPF6.3在對不同形態(tài)氮素的吸收和利用中可能起著更為基礎的作用[81]。

2.2 玉米

目前，糧食作物玉米中已報道4個NPF基因的生物學功能(表1、圖1)。ZmNPF7.9在胚乳轉移細胞特異性表達，該基因突變導致籽粒中濃度顯著降低，并引發(fā)嚴重的籽粒發(fā)育障礙(胚乳發(fā)育遲緩、淀粉沉積異常、粒重顯著降低等)，說明無機態(tài)的對于玉米籽粒(胚乳)發(fā)育具有重要作用，ZmNPF7.9參與了這一生物學過程[96]。ZmNPF8.8(ZmPTR1)主要在種子萌發(fā)過程中盾片上皮細胞中表達，擬南芥中異源表達ZmNPF8.8在二肽(Ala-Ala)作為唯一氮源的培養(yǎng)基中，種子吸脹后萌發(fā)的存活率顯著高于對照材料，說明ZmNPF8.8可能參與萌發(fā)籽粒中有機態(tài)氮素(二肽等)向胚的運輸過程[97]。

借助定點誘變和電生理技術，Wen等[95]對玉米中AtNPF6.3兩個同源基因ZmNPF6.4 (ZmNRT1.1A)和ZmNPF6.6 (ZmNRT1.1B)的吸收特性進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)二者在功能上出現(xiàn)分化，分別對Cl-和具有高親和力(high-affinity)吸收特性。ZmNPF6.6中含有與結合的關鍵組氨酸位點(His-362, 擬南芥AtNPF6.3中該位點為His-356[99-100])，而在ZmNPF6.4中該位點被酪氨酸(Tyr-370)取代。將ZmNPF6.6中該關鍵組氨酸位點突變成酪氨酸(His-362-Tyr)，導致ZmNPF6.6喪失了對的轉運功能；在ZmNPF6.4中引入該關鍵組氨酸位點(Tyr-370-His)，則使ZmNPF6.4獲得了對的高親和力吸收特性[95]。通過改變NPF基因編碼蛋白中特定氨基酸位點，為提高作物氮素吸收利用(包括對Cl-的耐受性)提供了新的視角。

2.3 小麥

糧食作物小麥是異源六倍體(基因組類型為AABBDD)，基因組龐大并且十分復雜[108]。目前，小麥中有關NPF基因在氮素吸收利用中生物學功能的研究尚未見報道，但已有證據(jù)表明NPF基因參與小麥對氮素的吸收利用過程[109-111]。最近，Wang等[15]和Li等[16]分別對小麥中NPF基因家族進行了系統(tǒng)鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)小麥基因組中含有高達331個NPF基因，其數(shù)量遠高于水稻(93個)和玉米(79個)。小麥中家族成員眾多的NPF基因在氮素吸收利用中的生物學功能有待發(fā)掘與解析。

3 結論與展望

如前所述，目前糧食作物玉米(含79個NPF基因)中僅有4個NPF基因的生物學功能被報道，在小麥(含331個NPF基因)中尚未有相關報道，未來對玉米和小麥中NPF基因的發(fā)掘與功能研究，將為改良作物氮素利用效率提供新的基因資源。此外，現(xiàn)有文獻報道中對NPF基因功能的研究多采用水培與盆栽試驗，試驗條件為單一氮水平(高氮或低氮)處理。在自然環(huán)境中，作物生長在多重氮水平條件下，并且在不同生長發(fā)育階段對氮素的需求各異，因此，實踐中需要考慮綜合運用多種策略(調節(jié)氮素吸收、轉運、分配/再分配、代謝及其調控基因的綜合表達)探索提高作物的氮素利用效率。