蘇文曉，盧 珺，甘曉雯，陳卉彬，簡(jiǎn) 潔

? 藥理與臨床 ?

基于/研究九龍?zhí)冱S酮抑制自噬抗心肌缺氧損傷的作用機(jī)制

蘇文曉，盧 珺，甘曉雯，陳卉彬，簡(jiǎn) 潔*

廣西糖尿病系統(tǒng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541199

基于長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（myocardial infarction associated transcript，）/探討九龍?zhí)冱S酮（flavones，BCF）抑制自噬抗心肌缺氧損傷的作用及機(jī)制。培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞及敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)株，建立心肌細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型模擬心肌缺血缺氧，給予BCF預(yù)處理；選取SD雄性大鼠，沉默基因，建立急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）模型，給予BCF預(yù)處理。以qRT-PCR法檢測(cè)、及自噬相關(guān)基因表達(dá)；采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及RNA反義純化（RNA antisense purification，RAP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與的靶向關(guān)系；采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液及大鼠血清中肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，cTn-Ⅰ）水平；采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；采用透射電鏡觀察自噬小體數(shù)量；以自噬雙標(biāo)腺病毒Ad-mRFP-GFP-LC3感染細(xì)胞檢測(cè)自噬流；采用TTC染色法檢測(cè)大鼠心肌梗死面積；采用Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。與OGD組比較，BCF能夠下調(diào)并上調(diào)基因表達(dá)（＜0.05、0.01），提高心肌細(xì)胞活力（＜0.01），降低cTn-I水平（＜0.001），下調(diào)、、基因及蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），減少自噬小體數(shù)量（＜0.01），減輕自噬流（＜0.01）。雙熒光素酶報(bào)告基因及RAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靶向負(fù)調(diào)控表達(dá)。敲低可抑制自噬，減輕心肌缺氧損傷；與單純BCF預(yù)處理相比，敲低可顯著增強(qiáng)BCF抑制自噬和保護(hù)心肌的作用（＜0.05、0.01、0.001）。與AMI＋BCF組比較，沉默后給予BCF處理，大鼠心肌梗死面積顯著增加（＜0.01），血清中cTn-I水平顯著升高（＜0.01），心臟組織中自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（＜0.01），心肌缺血損傷加重。BCF通過(guò)/抑制自噬，從而減輕心肌缺氧損傷。

九龍?zhí)冱S酮；；；心肌缺氧損傷；自噬

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）以心肌缺血和缺氧為特征，其發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康[1]。誘發(fā)心肌缺血損傷的因素有多種，包括氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥反應(yīng)、凋亡、自噬和壞死等，其中自噬在心肌缺血的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。自噬是長(zhǎng)壽蛋白和胞質(zhì)細(xì)胞器降解和再循環(huán)的重要過(guò)程[2]，在心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)抑制自噬有利于心肌細(xì)胞的存活，并減輕心肌損傷[3]。

九龍?zhí)冱S酮（flavones，BCF）是廣西民族特色草藥九龍?zhí)?Benth.) Benth.的主要活性成分，本課題組前期研究表明，BCF具有抗炎、抗氧化的作用，能夠通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡及過(guò)度自噬，抗心肌缺氧損傷[4-6]；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)能增強(qiáng)BCF抑制自噬的作用[4]，但在整體動(dòng)物水平，對(duì)BCF的作用尚不明確。

研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）能夠發(fā)揮微小RNA（microRNA，miRNA）海綿作用，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA的反應(yīng)元件，進(jìn)而對(duì)其靶基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)控[7]。心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（myocardial infarction associated transcript，）參與了心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病過(guò)程[8]，如結(jié)合部分增強(qiáng)心肌肥厚，結(jié)合抗動(dòng)脈粥樣硬化[9-10]，但參與心肌梗死的分子機(jī)制仍有待深入研究。能否通過(guò)“分子海綿吸附”作用結(jié)合影響自噬，參與心肌缺血損傷尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，其對(duì)BCF的心肌保護(hù)作用也未闡明。本研究基于/信號(hào)軸探究BCF對(duì)心肌缺氧損傷的作用及機(jī)制，為臨床治療心肌缺血損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，敲低基因及空載對(duì)照的H9c2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株購(gòu)自武漢金凱瑞生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，7周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCKX（湘）2019-0004。動(dòng)物于溫度（24±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%、12 h光照/黑暗交替的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)GLMC201703031）。

1.3 藥品與試劑

BCF由本課題組分離純化，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以蘆丁計(jì)為82%[11]；胎牛血清（批號(hào)SN201909）、高糖及無(wú)糖DMEM（批號(hào)8121382）購(gòu)自Gibco公司；mRFP-GFP-LC3腺病毒（批號(hào)133F082）、CCK-8試劑盒（批號(hào)20210323）購(gòu)自Hanbio Biotechnology；引物購(gòu)自武漢金凱瑞生物工程有限公司；電鏡固定液（批號(hào)20210911）、TTC染色液（批號(hào)415F031）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRNzol Universal Reagent（批號(hào)W9830）、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（批號(hào)O11208）、PerfectStart Green qPCR SuperMix（批號(hào)P30726）購(gòu)自上海全式金生物有限公司；Luciferase Reporter Assay Kit（批號(hào)E2920）、pmirGLO載體（批號(hào)E1330）購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)Promega公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)60004-1-Ig）購(gòu)自Proteintech Group；組織蛋白酶D（Cathepsin D）抗體（批號(hào)DF6486）購(gòu)自Affinity Biosciences；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（批號(hào)ab192890）、Beclin1抗體（批號(hào)ab207612）、p62抗體（批號(hào)ab12484）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)ab6721）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、antagomir和空載pcDNA由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成；大鼠肌鈣蛋白-I（cardiac troponin-I，cTn-Ⅰ）ELISA試劑盒（批號(hào)20210415）購(gòu)自美國(guó)Elabscience公司。

1.4 儀器

CCL-170B-8型CO2培養(yǎng)箱（ESCO公司）；LAI3T型厭氧培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡、ELx800型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；NanoDrop One型超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；MyGo Pro型小型熒光定量PCR儀（英國(guó)IT-IS公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Gene公司）；JEM1200EX型鎢燈絲透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司）；SAR-1000型小動(dòng)物呼吸機(jī)（美國(guó)CEW公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選 常規(guī)復(fù)蘇H9c2細(xì)胞，接種至24孔板中。配制1 mg/mL的嘌呤霉素母液，用完全培養(yǎng)基分別稀釋至0.1、0.4、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0 μg/mL，加入24孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，后續(xù)以2.0 μg/mL的嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

取出敲低基因的慢病毒液，冰浴融化待用。將病毒液用培養(yǎng)基稀釋，以1×107/孔加入24孔板中，病毒感染6 h后，更換成2 mL完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將完全培養(yǎng)基更換為含2.0 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基（即篩選培養(yǎng)基），每2天更換1次篩選培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察。15 d后收集細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)。穩(wěn)定細(xì)胞株凍存，得到敲低基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未感染對(duì)照細(xì)胞（negative control，sh-NC）。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與模型建立 H9c2細(xì)胞和敲低及空載對(duì)照的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將含血清的高糖DMEM換為不含血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，放入5% CO2、1% O2、94% N2的厭氧箱中培養(yǎng)24 h，建立氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）模型[12]。

2.1.3 分組與給藥 設(shè)置對(duì)照組、OGD（模型）組、sh-NC組、sh-MIAT組、BCF組、BCF＋sh-NC組和BCF＋sh-MIAT組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組、OGD組及BCF組為H9c2細(xì)胞，其余組使用穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)分組同時(shí)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞和敲低及空載對(duì)照的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。除對(duì)照組外，其余各組按“2.1.2”項(xiàng)下方法造模，各給藥組造模前加入BCF（6 μg/mL）預(yù)孵育4 h，造模時(shí)各給藥組培養(yǎng)基換成含有BCF的無(wú)糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。

2.1.4 qRT-PCR法檢測(cè)、和自噬相關(guān)基因表達(dá) 取造模后各組細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1，將作為內(nèi)參，將作為其他基因內(nèi)參。

2.1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因和RNA反義純化（RNA antisense purification，RAP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和的靶向關(guān)系

（1）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)和結(jié)合關(guān)系：分別構(gòu)建含野生型和突變型3’-UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，質(zhì)粒同共轉(zhuǎn)染，以PBS清洗2次，加入Passive Lysis Buffer裂解后離心，吸取上清液至黑色96孔板中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素和海腎熒光素的熒光強(qiáng)度。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 (5’-3’) LC3F: ACCCTCTACGATGCTGGTGAR: GCTGTCCTCAATGTCCTTCTG LncRNA MIATF: AGGTCAGGCAGAGGAAGTCAR: CTCCCGATACAACAATCACG Beclin1F: GCCTCTGAAACTGGACACGR: CCTCTTCCTCCTGGCTCTCT GAPDHF: GACATGCCGCCTGGAGAAACR: AGCCCAGGATGCCCTTTAGT U6F: CAAATTCGTGAAGCGTTR: TGGTGTCGTGGAGTCG miR-384-5pF: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTR: ACACTCCAGCTGGGTGTAAA Cathepsin DF: CCGCAGTGTCACAGTCGTR: CGTGCCGTCTTCACATAGG

（2）RAP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和結(jié)合關(guān)系：取2×107個(gè)H9c2細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后用PBS洗滌1次，進(jìn)行紫外交聯(lián)，交聯(lián)后DNA超聲破碎。將生物素化的反義探針加入到LncRNA-RAP系統(tǒng)中，探針在65 ℃變性10 min，室溫雜交2 h，然后加入200 μL鏈霉親和素包被的磁珠，提取RNA后熒光定量驗(yàn)證與間的相互作用。

2.1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 H9c2細(xì)胞以8×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，造模結(jié)束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

2.1.7 ELISA法檢測(cè)cTn-I水平 取造模后各組細(xì)胞上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液cTn-I水平。

2.1.8 TEM觀察自噬小體數(shù)量 取造模后各組細(xì)胞，4 ℃、1000 r/min離心5 min，吸除上清液，加入PBS重懸10 min，離心后吸除上清液，加入電鏡固定液后重懸，4 ℃固定過(guò)夜，將樣品裝載在200目銅網(wǎng)上，用TEM觀察自噬小體產(chǎn)生情況。

2.1.9 自噬雙標(biāo)腺病毒（Ad-mRFP-GFP-LC3）感染H9c2細(xì)胞檢測(cè)自噬流 H9c2細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔板，板中預(yù)先鋪被細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h。每孔加入5 μL腺病毒培養(yǎng)6 h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后建立OGD模型。造模結(jié)束，取出24孔板，PBS洗滌2次，加入組織固定液固定10 min，以DAPI染色后取出細(xì)胞爬片，倒扣在滴加抗熒光淬滅劑的載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。

2.1.10 Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取造模后各組細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入Beclin1、Cathepsin D、LC3、p62抗體（1∶5000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，加入二抗孵育1 h，洗膜后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 敲低對(duì)大鼠心臟基因表達(dá)的影響 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、AMI（模型）組、AMI＋si-NC組及AMI＋si-MIAT組，每組5只。按文獻(xiàn)方法[6]開(kāi)胸后用6-0帶線縫合針結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前左降支，建立AMI模型，缺血24 h。在大鼠左心房注射10 μL si-MIAT或si-NC（滴度為1×108T），取各組大鼠心肌組織，按“2.1.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)基因表達(dá)。

2.2.2 沉默基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)BCF的抗心肌缺血損傷作用 動(dòng)物隨機(jī)分為sh miRNA-384-5p組、AMI＋sh miRNA-384-5p組、AMI＋BCF組和AMI＋BCF＋sh miRNA-384-5p組，每組5只。通過(guò)在體轉(zhuǎn)染技術(shù)[9]在大鼠左心室注射10 μL抑制劑（滴度為1×108T），轉(zhuǎn)染24 h。按文獻(xiàn)方法[6]建立AMI模型，缺血24 h。術(shù)前30 min舌下靜脈給予BCF（20 mg/kg）預(yù)處理。造模結(jié)束后，取血，放入4 ℃冰箱過(guò)夜后，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集血清，按“2.1.7”項(xiàng)下方法測(cè)定血清中cTn-I水平；迅速取出大鼠心臟，切成2 mm薄片，加入1% TTC溶液避光孵育20 min，染色后用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，于顯微鏡下觀察心肌梗死情況；取心臟組織，按“2.1.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)，按“2.1.10”項(xiàng)下方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，檢驗(yàn)法用于兩組之間比較，單因素方差分析法用于多組間比較。

3 結(jié)果

3.1 BCF下調(diào)LncRNA MIAT并上調(diào)miR-384-5p基因表達(dá)

如圖1所示，與對(duì)照組比較，OGD組細(xì)胞中基因表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01），基因表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）；與OGD組比較，BCF組細(xì)胞中基因表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01），基因表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05）。

3.2 LncRNA MIAT靶向調(diào)控miR-384-5p

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示（圖2），共轉(zhuǎn)和-WT后熒光素酶活性顯著降低（＜0.001），說(shuō)明與互作。RAP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的作用關(guān)系（圖2-C），被探針富集，表明與存在相互作用。如圖2-D、E所示，與sh-NC組比較，敲低后基因表達(dá)降低（＜0.001），而基因表達(dá)升高（＜0.05）。上述結(jié)果表明是的靶基因，并受到的負(fù)調(diào)控。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與OGD組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

A-LncRNA MIAT和miR-384-5p的潛在結(jié)合序列 B-雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LncRNA MIAT和miR-384-5p的靶向關(guān)系 C-RAP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LncRNA MIAT和miR-384-5p的靶向關(guān)系 D-qRT-PCR檢測(cè)敲低LncRNA MIAT后LncRNA MIAT基因表達(dá) E-qRT-PCR檢測(cè)敲低LncRNA MIAT后miR-384-5p基因表達(dá) 與pcDNA3.1＋MIAT-WT組比較：***P＜0.001；與sh-NC組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001

3.3 敲低LncRNA MIAT抑制自噬減輕心肌缺氧損傷

如圖3-A、B所示，與對(duì)照組比較，OGD組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），心肌缺血損傷標(biāo)志物cTn-I水平顯著升高（＜0.001）；敲低能夠提高H9c2細(xì)胞存活率（＜0.01），降低cTn-I水平（＜0.01），提示下調(diào)能減輕OGD誘導(dǎo)的心肌缺氧損傷。

進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬的影響，如圖3-C～E所示，與對(duì)照組比較，OGD組自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多（＜0.01），Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值升高（＜0.001），p62蛋白表達(dá)水平降低（＜0.001）；與sh-NC組比較，敲低后自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量減少（＜0.01），Beclin1蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ/LC3-I值降低（＜0.01、0.001），p62蛋白表達(dá)水平升高（＜0.001），表明敲低能抑制OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。

A-敲低LncRNA MIAT對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響 B-敲低LncRNA MIAT對(duì)H9c2細(xì)胞上清液中cTn-I水平的影響 C-敲低LncRNA MIAT對(duì)自噬流的影響 D-敲低LncRNA MIAT對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 E-敲低LncRNA MIAT對(duì)自噬小體產(chǎn)生的影響（箭頭為自噬小體） 與對(duì)照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001；與sh-NC組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001

3.4 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞存活率和上清液中cTn-I水平的影響

如圖4所示，與OGD組比較，BCF組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01），上清液中cTn-I水平顯著降低（＜0.001）；敲低可增強(qiáng)BCF的作用（＜0.01、0.001）。

3.5 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬小體的影響

如圖5所示，與OGD組比較，BCF組自噬小體數(shù)量顯著減少（＜0.01）；敲低可增強(qiáng)BCF的作用（＜0.01）。

3.6 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與OGD組比較，BCF組細(xì)胞中、及基因表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Beclin1和Cathepsin D蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），LC3-Ⅱ/LC3-I值顯著降低（＜0.01）；敲低可增強(qiáng)BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬的抑制作用（＜0.05、0.01）。

3.7 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬流的影響

如圖7所示，與OGD組比較，BCF組細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體數(shù)量均顯著減少（＜0.01）；敲低后自噬體和自噬溶酶體數(shù)量進(jìn)一步減少（＜0.05），表明BCF通過(guò)下調(diào)抑制自噬體和自噬溶酶體的形成，從而阻滯自噬流。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與OGD組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與BCF＋sh-NC組相比：?P＜0.05 ??P＜0.01 ???P＜0.001，圖5～7同

箭頭所示為自噬小體

圖6 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬相關(guān)基因(A) 及蛋白表達(dá)(B) 的影響(, n = 5)

圖7 BCF對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞自噬流的影響(, n = 3)

3.8 敲低LncRNA MIAT對(duì)大鼠心臟miR-384-5p基因表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，AMI組大鼠心臟中基因表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.001）；敲低顯著增加心臟中基因表達(dá)（＜0.05）。

3.9 沉默miR-384-5p基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)BCF的抗心肌缺血損傷作用

如圖9所示，與AMI＋BCF組比較，沉默后給予BCF處理，大鼠心肌梗死面積增加，梗死率顯著升高（＜0.01）；血清中cTn-I水平顯著升高（＜0.01），心臟組織中自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（＜0.01），心肌缺血損傷加重。

與對(duì)照組比較：***P＜0.001；與AMI＋si-NC組相比：△P＜0.05

A-各組大鼠心肌梗死面積（黑色箭頭為心肌梗死區(qū)） B-各組大鼠血清中cTn-I水平 C-各組大鼠心臟組織中自噬相關(guān)基因表達(dá) D-各組大鼠心臟組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 與sh miRNA-384-5p組比較：##P＜0.01；與AMI＋BCF組比較：**P＜0.01

4 討論

AMI是一種嚴(yán)重的致命性疾病，由冠狀動(dòng)脈阻塞引起的心肌缺血損傷是造成患者死亡的原因之一[13]。目前，臨床治療AMI的主要方法為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI），PCI能夠較快且安全地恢復(fù)血流再灌注，但其發(fā)病血管仍有急性再閉塞的可能性[14]。一些活血化瘀中藥具有防治心血管疾病的作用，深入研究其作用機(jī)制，有望為開(kāi)發(fā)防治AMI的藥物提供依據(jù)。

自噬在AMI中的發(fā)生機(jī)制、調(diào)控因素及藥物干預(yù)為近年研究熱點(diǎn)[2]。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，包括自噬體形成（一般以Beclin1、LC3II為標(biāo)志）、自噬體與溶酶體融合（一般以Cathepsin D為標(biāo)志）和自噬體的降解（一般以p62作為標(biāo)志）3個(gè)連續(xù)的步驟。細(xì)胞在正常情況下很少發(fā)生自噬，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺血缺氧等常誘導(dǎo)自噬[3]。九龍?zhí)偈且环N傳統(tǒng)的中草藥和功能性食品，性平低毒，BCF是其莖提取物的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)BCF可抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡和自噬、減輕心肌缺血缺氧損傷[5-6]，但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究表明負(fù)調(diào)控Beclin1表達(dá)抑制自噬，過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)BCF的心肌保護(hù)作用[4]。本研究亦發(fā)現(xiàn)ODG誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞給予BCF預(yù)處理后，基因表達(dá)上調(diào)，提示可能參與了BCF抑制自噬的作用。

以雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RAP實(shí)驗(yàn)探析的上游靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，負(fù)靶向調(diào)控。作為AMI的危險(xiǎn)等位基因，在AMI患者和小鼠血漿中高表達(dá)[15-16]，但在OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低可提高心肌細(xì)胞活力、降低cTn-I水平、減少自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量、降低Beclin1蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-I值、增加p62蛋白表達(dá)、抑制心肌缺氧損傷。為進(jìn)一步驗(yàn)證BCF是否通過(guò)影響發(fā)揮心肌保護(hù)作用，在敲低基因的心肌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株中給予BCF預(yù)處理，結(jié)果顯示，與單純BCF預(yù)處理相比，合并敲低后，BCF抑制自噬和減輕心肌缺氧損傷的作用顯著增強(qiáng)，說(shuō)明可能是BCF發(fā)揮心肌保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)BCF作用的影響，構(gòu)建AMI動(dòng)物模型，并通過(guò)在體轉(zhuǎn)染方式，沉默大鼠基因表達(dá)。結(jié)果顯示，沉默逆轉(zhuǎn)了BCF抑制自噬的作用，加重了大鼠心肌缺血損傷，提示BCF抗心肌缺血損傷作用可能與上調(diào)基因表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BCF通過(guò)/抑制自噬減輕心肌缺氧損傷（圖10）。由于全長(zhǎng)序列為8474 bp，序列太長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)后極有可能造成細(xì)胞死亡，因此本研究未對(duì)過(guò)表達(dá)情況進(jìn)行分析。后續(xù)將進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證BCF下調(diào)抑制自噬減輕心肌缺血損傷的作用。

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利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-myocardial hypoxia injury effect offlavones by inhibiting autophagy based on/

SU Wen-xiao, LU Jun, GAN Xiao-wen, CHEN Hui-bin, JIAN Jie

Guangxi Key Laboratory of Diabetic Systems Medicine, Guilin 541199, China

To investigate the effect offlavones(BCF) on myocardial hypoxia injury by inhibiting autophagy based on long non-coding RNA (LncRNA) myocardial infarction associated transcript ()/.H9c2 cardiomyocytes and stableknockdown strain were cultured, and cardiomyocyte oxygen-glucose deprivation (OGD) model was established to simulate myocardial ischemia and hypoxia, cells were pretreated with BCF. Male SD rats were selected to establish acute myocardial infarction (AMI) model by silencinggene expression, and were pretreated with BCF. qRT-PCR was used to detect the expressions of,and autophagy-related genes; Dual luciferase reporter gene experiment and RNA antisense purification (RAP) experiment were used to verify thatandtargeting relationship; ELISA method was used to detect cardiac troponin-I (cTn-I) levels in supernatant of cells and serum of rats; CCK-8 method was used to detect cell viability; Transmission electron microscopy (TEM) was used to observe the number of phagosomes; Autophagy flux was detected by infecting cells with autophagy double-labeled adenovirus Ad-mRFP-GFP-LC3; Myocardial infarction size was detected by TTC staining; Expressions of autophagy-related proteins was detected by Western blotting.Compared with OGD group, BCF down-regulatedand up-regulatedgene expressions (< 0.05, 0.01), increased myocardial cells viability (< 0.01), decreased cTn-I level (< 0.001), down-regulated,,gene and protein expressions (< 0.05, 0.01), decreased the number of autophagosomes (< 0.01), and reduced autophagic flux (< 0.01). The results of dual-luciferase reporter gene and RAP assay showed thattargeted and negatively regulated the expression of. Knockdown ofcould inhibit autophagy and alleviate myocardial hypoxia injury; Compared with BCF pretreatment, knockdown ofsignificantly enhanced the effect of BCF on autophagy inhibition and myocardial protection (< 0.05, 0.01, 0.001). Compared with AMI + BCF group, after silencingand then giving BCF treatment, myocardial infarction area of rats was significantly increased (< 0.01), cTn-I level in serum was significantly increased (< 0.01), autophagy-related gene and protein expressions in cardiac tissue were significantly up-regulated (< 0.01), and myocardial ischemia injury was aggravated.BCF alleviates myocardial hypoxic injury by inhibits autophagy through LncRNA MIAT/miR-384-5p.

flavones;;; myocardial hypoxia injury; autophagy

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5701 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.013

2022-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81760726）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82060659）

蘇文曉，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樾募∪毖獡p傷的藥物干預(yù)及分子機(jī)制。E-mail: 1063013501@qq.com

簡(jiǎn) 潔，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾募∪毖獡p傷的藥物干預(yù)及分子機(jī)制。E-mail: 251181281@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]