王雪菲，田榮，陳志輝，楊明東，郭曉芳

1.云南省寄生蟲(chóng)病防治所，云南省蟲(chóng)媒傳染病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000；2.昆明市疾病預(yù)防控制中心

登革熱（dengue fever, DF）是由登革病毒（den‐gue virus, DENV）感染引起的蚊媒傳染病，傳播媒介主要為白紋伊蚊和埃及伊蚊[1]。登革病毒隸屬黃病毒科黃病毒屬，分為DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4四種血清型[2]，其中，DENV-1分為5個(gè)基因型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型）[3]，DENV-2則分為6 個(gè)基因型（Asian/American、Asian Ⅰ、Asian Ⅱ、Cosmopolitan、American 和 Sylvatic）[4]。登革熱廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶國(guó)家或地區(qū)，目前已有美洲、東地中海、西太平洋、歐洲、非洲和東南亞的100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告了登革熱的流行[5]，亞洲國(guó)家的疾病負(fù)擔(dān)占全球的70%[6]，我國(guó)廣東、云南、福建、浙江等多省均有流行[1]。

云南省緊鄰老撾、緬甸和越南等登革熱廣泛流行的東南亞國(guó)家，是我國(guó)主要的登革熱流行地區(qū)之一，十余年來(lái)，均有輸入性和（或）本地病例的報(bào)道[7-9]。昆明市作為云南省省會(huì)和我國(guó)溝通東南亞地區(qū)的主要交通樞紐之一，輸入性登革熱病例的報(bào)道也呈逐年上升趨勢(shì)[8,10-11]，但有關(guān)血清型或基因型的研究較少，僅2013—2015年對(duì)昆明市輸入性登革熱病例開(kāi)展了E 基因序列分析，且分析的樣本量較少[12-13]。本研究分析了2019年昆明市輸入性登革熱病例的流行病學(xué)特征，同時(shí)對(duì)部分病例進(jìn)行了病毒血清型和基因型測(cè)定，并對(duì)所得序列進(jìn)行進(jìn)化分析，為昆明市輸入性登革熱的防控提供流行病學(xué)和病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源 按照《全國(guó)登革熱監(jiān)測(cè)方案》對(duì)2019 年昆明市輸入性登革熱病例（包括實(shí)驗(yàn)室診斷病例和臨床診斷病例）開(kāi)展個(gè)案調(diào)查，病例的診斷依據(jù)為《登革熱診斷》（WS 216—2018）[14]。病例個(gè)案調(diào)查以問(wèn)卷調(diào)查的形式開(kāi)展，問(wèn)卷變量包括病例姓名、性別、年齡、職業(yè)、登革熱疫區(qū)旅居史等。

1.2 病毒血清分型 采集2019年1—6月昆明市部分輸入性登革熱病例血清樣本，采用美國(guó)公司生產(chǎn)的Cortez NS1 抗原檢測(cè)試劑作為病例臨床診斷試劑，NS1 抗原陽(yáng)性血清樣本采集后置于-20 ℃冰箱保存，隨后冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存待檢。采用天隆科技（西安）有限公司生產(chǎn)的半自動(dòng)核酸提取儀和病毒DNA/RNA 提取試劑盒（磁珠法）提取病毒RNA，獲得的RNA 立即用于后續(xù)試驗(yàn)，剩余RNA-80 ℃保存。分型引物和探針參考《登革熱診斷》（WS 216—2018）[14]設(shè)計(jì)合成。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行血清型測(cè)定。

1.3 E 基因測(cè)定及進(jìn)化分析 采用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成得到病毒第一鏈cDNA。參考有關(guān)文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)合成DENV-1 和DENV-2 E 基因擴(kuò)增引物，以上述步驟合成的cDNA為模板進(jìn)行E 基因序列擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序以獲得相應(yīng)E基因序列。測(cè)序結(jié)果使用DNAStar 軟件下的SeqMan 模塊進(jìn)行序列拼接，所得序列在NCBI網(wǎng)站的Blast進(jìn)行比對(duì)并選取相似性最高的序列。進(jìn)化分析所用的參考序列均下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，包括比對(duì)后選取的相似序列、云南省近年流行株、柬埔寨近年流行株、泰國(guó)近年流行株和各基因型代表序列。采用ClustalW 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，Mega 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining 進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用Kirmura2-parameter 模型，bootstrap設(shè)置為1 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2019 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行描述性分析。

2 結(jié) 果

2.1 總體情況 2019 年昆明市共報(bào)告輸入性登革熱病例400 例。其中，實(shí)驗(yàn)室診斷病例55 例，占13.75%；臨床診斷病例345例，占86.25%。

2.2 流行病學(xué)特征

2.2.1 來(lái)源地分布 境外輸入297 例（占74.25%），以東南亞國(guó)家為主，柬埔寨（187例）、緬甸（38例）和老撾（28 例）為主要來(lái)源國(guó)；境內(nèi)輸入99 例（占24.75%），以云南省西雙版納（93例）輸入為主；未知來(lái)源地4例（占1.00%）。見(jiàn)表1。

表1 2019年昆明市輸入性登革熱病例來(lái)源地分布

2.2.2 時(shí)間分布 2019 年昆明市全年均有輸入性登革熱病例報(bào)告，5—10 月為輸入性病例報(bào)告高峰，其中10月病例數(shù)最多，占20.75%（83/400）。見(jiàn)圖1。

2.2.3 人群分布 400例輸入性登革熱病例中男性267 例，女性 133 例，男女性別比為 2.01∶1。各年齡組均有報(bào)告病例，年齡最小6 月，最大83 歲，其中，20~29 年齡組報(bào)告病例數(shù)最多，共135 例（占33.75%）。職業(yè)以家務(wù)及待業(yè)人員、商業(yè)服務(wù)人員、干部職員、農(nóng)民和工人為主，分別為78 例（占19.50%）、56例（占14.00%）、52例（占13.00%）、46例（占11.50%）和43例（占10.75%）。見(jiàn)表2。

表2 2019年昆明市輸入性登革熱病例人群分布

2.3 DENV 血清分型 共采集DENV NS1 抗原陽(yáng)性輸入性病例血清60 例，輸入地分別為柬埔寨（49例，占81.67%）、老撾（1 例，占1.67%）、緬甸（3 例，占5.00%）、越南（3例，占1.67%）、泰國(guó)（1例，占1.67%）和非洲國(guó)家（3例，占5.00%）。DENV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性34 例，其中輸入來(lái)源為柬埔寨的32 例（28 例為DENV-1 型，4 例為 DENV-2 型），越南 1 例（DENV-2型），泰國(guó)1例（DENV-1型）。

2.4 DENV 基因分型和 E 基因進(jìn)化分析 34 例DENV 核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本擴(kuò)增得到6 條DENV-1 E基因序列（5 條源自柬埔寨，1 條源自泰國(guó)）和2 條DENV-2 E基因序列（均源自柬埔寨）。

6 條DENV-1 E 基因序列核苷酸相似性為96.63%～100.00%，與選取參考序列的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，6株DENV-1均屬于基因Ⅰ型，分別位于3個(gè)不同的進(jìn)化分支（Lineage 1、Lineage 2 和Lineage 3）。各序列分別有與其在遺傳上高度相似的毒株，Lin‐eage 1 分支中KM67 和KM71 E 基因序列分別和2019年廣東柬埔寨輸入株（MN921287、MN921259）同源性最高，核苷酸相似性分別為100.00%和99.93%，而KM68 E 基因序列則和2019 年老撾流行株（MW228042）同源性最高，核苷酸相似性為100.00%；Lineage 2 分支中，KM36 和 KM37 E 基因序列和2019 年南昌株（MN894235）同源性最高，核苷酸相似性為100.00%；Lineage 3分支中，泰國(guó)輸入性病例的病毒KM7 E 基因序列與2019 年上海株（MT856309）和2018 年泰國(guó)流行株（MN955621）同源性最高，核苷酸相似性分別為99.87%和99.66%。見(jiàn)圖2。

2 條DENV-2 E 基因序列核苷酸相似性為99.73%，與參考序列的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，2條序列均屬AsianⅠ基因型，KM28 和KM61 E 基因序列分別與2019 年廣東柬埔寨輸入株（MN923115、MN915188）同源性最高，核苷酸同源性均為99.93%。見(jiàn)圖3。

3 討 論

通過(guò)對(duì)2019 年昆明市輸入性登革熱病例的流行病學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)，該地登革熱病例以境外輸入為主，占總病例數(shù)的74.25%，主要輸入來(lái)源為柬埔寨、緬甸和老撾等登革熱疫情高發(fā)的東南亞國(guó)家。其中，柬埔寨是2019年昆明市輸入性病例的主要來(lái)源國(guó)，占總輸入性病例數(shù)的46.75%，這可能與2019年柬埔寨登革熱疫情嚴(yán)重，報(bào)告病例數(shù)大幅超過(guò)去年同期[15]，且昆明與柬埔寨間的人員往來(lái)日益頻繁等因素有關(guān)。輸入性登革熱病例全年均有報(bào)道，報(bào)告高峰為5—10 月，要早于云南省登革熱高發(fā)季節(jié)（8—11月）[16]，這可能與柬埔寨等東南亞國(guó)家登革熱流行季節(jié)在5—10 月有關(guān)[17-19]。輸入性病例男性多于女性，職業(yè)以家務(wù)及待業(yè)人員、商業(yè)服務(wù)人員、干部職員、農(nóng)民和工人為主，提示該類人群為昆明市登革熱防控的重點(diǎn)人群。

本研究共檢測(cè)出2 個(gè)血清型和2 種基因型，2 種基因型均屬東南亞地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)基因型[20-22]，系統(tǒng)進(jìn)化分析也發(fā)現(xiàn)本研究序列和東南亞流行株、我國(guó)東南亞輸入株高度同源。由于周邊國(guó)家登革熱廣泛流行，我國(guó)廣東、云南、福建、浙江等地也多次報(bào)告了來(lái)自東南亞國(guó)家的輸入性病例，且部分省份暴發(fā)了由輸入性病例引起的本土聚集性疫情[23-27]。昆明市是連接我國(guó)與東南亞國(guó)家的重要門(mén)戶，便利的交通為東南亞國(guó)家登革熱病例的輸入提供了渠道。2019 年昆明市未發(fā)生由輸入性病例引起的本地散發(fā)、暴發(fā)，且無(wú)本地登革熱病例報(bào)告，這主要?dú)w因于該地對(duì)輸入性病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早隔離。登革熱傳播媒介白紋伊蚊在云南省廣泛分布[28]，昆明市也有監(jiān)測(cè)到伊蚊的相關(guān)報(bào)道[29-30]，雖然昆明市伊蚊密度較低且暫未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)蚊種埃及伊蚊[31]，但仍存在由輸入性病例引起本地登革熱暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

研究結(jié)果提示，對(duì)境內(nèi)外輸入性病例的監(jiān)測(cè)依然是昆明市登革熱防控工作的重點(diǎn)，應(yīng)密切關(guān)注東南亞地區(qū)登革熱流行形勢(shì)，提前做好昆明市登革熱防控工作部署。同時(shí)，需加強(qiáng)對(duì)疫情高發(fā)國(guó)家往來(lái)重點(diǎn)人群的監(jiān)測(cè)，提高輸入性病例的發(fā)現(xiàn)和報(bào)告能力，及時(shí)處置輸入性疫情，防止由輸入性病例引起的本地登革熱疫情暴發(fā)。