范三微 吳祖芳 翁佩芳

(1 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2 浙江藥科職業(yè)大學(xué)制藥工程學(xué)院，浙江 寧波 315100)

放線菌具有很高的藥用價值[1]。在已知的10 000多種抗菌活性天然產(chǎn)物中，約70%來源于放線菌的代謝產(chǎn)物。其中鏈霉菌(Streptomycetes)是放線菌綱放線菌目的好氧革蘭氏陽性菌，60%以上的已知抗生素從其中分離獲得，如鏈霉素、氯霉素等[2]。然而自20世紀(jì)80年代以后，從陸生鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的新抗生素不足10種[3]。海洋是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，近二十年以來，海洋新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)數(shù)量呈逐年上升趨勢，來源包括海洋微生物、藻類、軟體動物、魚類及大型海洋動物等，鏈霉菌仍然是新化合物的主要來源，占海洋細(xì)菌代謝物總數(shù)的50%以上[4-6]，因此從海洋鏈霉菌中分離新抗生素一直是研究的熱點(diǎn)。浙江省位于我國東海海域，在過去的十五年中，國內(nèi)學(xué)者從浙江海域的海水、海泥、藻類等樣品中分離出大量具有抗菌活性的微生物[7-11]，但研究內(nèi)容局限于抗菌微生物初篩、化合物的初步分離[11]及基于16S rRNA基因的高通量初步鑒定[11]。潮間帶是典型的近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)[12]，具有物種多樣性，是放線菌的獨(dú)特來源，其中鏈霉菌為優(yōu)勢種群仍有待深入研究[13]。寧波近海擁有大面積潮間帶，這與鏈霉菌為海洋微生物優(yōu)勢類群的實(shí)際相矛盾，表明相關(guān)研究方法仍有待改進(jìn)。鑒于此，本研究以開發(fā)利用寧波近海潮間帶藥用微生物資源為出發(fā)點(diǎn)，從慈溪海塘采集海泥樣品，篩選培養(yǎng)抗真菌海洋放線菌，對目標(biāo)菌進(jìn)行分離和鑒定，以期發(fā)現(xiàn)微生物新物種，為進(jìn)一步研究其代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 2015年7月25日，在位于寧波近海潮間帶的慈溪海塘采樣點(diǎn)(121°24′28′′E 30°37′08′′N)，用無菌袋采集表層1～10 cm海泥樣品，共7份，保存于冰盒中。同時采集當(dāng)?shù)靥烊缓Ｋ?0 L，帶回浙江藥科職業(yè)大學(xué)科研分中心立即進(jìn)行處理，即靜置海水使大量泥沙自然沉降，后用濾紙過濾除去細(xì)小懸浮顆粒。下文中出現(xiàn)的海水均為經(jīng)過上述處理的海水。

1.1.2 指示菌 抗菌試驗(yàn)所用指示菌：白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC90028)、黑曲霉(Aspergillusniger，CMCC98003)，均為浙江藥科職業(yè)大學(xué)科研分中心保藏。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈣、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵、重鉻酸鉀、硝酸鉀、可溶性淀粉、醋酸、醋酸鈉、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；苯丙氨酸、甘氨酸、色氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨、酵母浸出粉、改良高氏一號培養(yǎng)基、酵母提取物蛋白胨培養(yǎng)基( yeast extract peptone dextrose agar,YPDA)，杭州百思生物技術(shù)有限公司；D0063基因組DNA小量抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA marker、2×Taq Master Mix(Dye)，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)儀器 BCD-515 MLHSSEDS9型冰箱，青島海爾集團(tuán)；SANYO MLS-3750型高壓滅菌鍋，日本三洋；K640型PCR儀，力新儀器(上海)有限公司；SPX-160生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；ZQLY-180E型恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；PowerPac型水平電泳儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 篩選培養(yǎng)基 磷酸氫二鉀0.5 g·L-1、七水合硫酸鎂0.5 g·L-1、七水合硫酸亞鐵0.5 g·L-1、重鉻酸鉀0.1 g·L-1用海水溶解，配制好以后再分別添加丙氨酸(A)、苯丙氨酸(P)、色氨酸(T)，配制不同篩選培養(yǎng)基，編號分別為AM、PM和TM。各篩選培養(yǎng)基中氨基酸濃度均為1 g·L-1，瓊脂濃度為20 g·L-1，pH值7.4，分裝，121℃滅菌20 min，倒平板，貯存?zhèn)溆?。改良高氏一號固體培養(yǎng)基按說明書用海水替代蒸餾水配制，滅菌，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 傳代培養(yǎng)基 稱取10 g市售干海帶，洗凈、剪碎，與1 000 mL海水一起加熱，煮沸30 min，用4層紗布過濾除渣，收集清液，放冷備用?？扇苄缘矸?5 g·L-1、 酵母浸出粉4 g·L-1、硝酸鉀1 g·L-1、氯化鈣0.02 g·L-1、七水合硫酸鎂0.1 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1， 用海帶汁溶解，后用海水定容至1 000 mL，121℃條件下滅菌20 min，倒斜面，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，海水1 000 mL，每瓶25 mL分裝至150 mL錐形瓶中，121℃條件下滅菌20 min，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 指示菌培養(yǎng)基 按YPDA培養(yǎng)基說明書配制、滅菌，用于抗菌活性檢測。

1.2.1.5 耐受培養(yǎng)基 磷酸氫二鉀1 g·L-1，七水合硫酸鎂0.2 g·L-1，七水合硫酸亞鐵0.1 g·L-1，氯化鈣0.01 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出粉5 g·L-1， 1 000 mL蒸餾水溶解。在耐受培養(yǎng)基母液的基礎(chǔ)上，配制pH值為7.4，NaCl濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的鹽耐受培養(yǎng)基；配制氯化鈉濃度為2%，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的pH耐受培養(yǎng)基；配制NaCl濃度為2%，pH值為7.4的溫度耐受培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基分裝至150 mL錐形瓶中，每瓶25 mL，121℃條件下滅菌20 min，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 放線菌篩選培養(yǎng) 稱取5 g不同編號的海泥樣品，分別加入裝有50 mL滅菌海水的錐形瓶，100 r·min-1條件下振蕩混勻30 min，靜置沉降15 min。備3支無菌試管，用滅菌海水，梯度稀釋樣品懸液，得到10×、100×、1 000×稀釋懸液，每次移取200 μL稀釋懸液分別涂布AM、TM、PM平板，重復(fù)3次，25℃條件下培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到改良高氏一號培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)7 d，挑取單菌落接種傳代培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4～7 d，將菌種斜面保存于4℃冰箱。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 無菌條件下用接種環(huán)從菌種斜面上挑取一環(huán)孢子接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 抗菌試驗(yàn) 將發(fā)酵液分裝于2 mL無菌離心管中，6 000 r·min-1離心20 min，取上清液，用0.2 μm直徑無菌濾膜過濾盡量除去發(fā)酵液中懸浮細(xì)胞。參照管碟法[14]，取白色念珠菌斜面，用無菌水洗下菌苔，分別與50℃的YPDA培養(yǎng)基混勻，控制菌濃度為1×106CFU·mL-1，在無菌條件下倒平板；取黑曲霉斜面，用無菌水洗下孢子，以孢子懸液涂布YPDA平板。以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，檢測發(fā)酵液的抗菌活性，檢測量為200 μL，觀察各指示菌平板是否產(chǎn)生抑菌圈，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 分子鑒定 按照基因組DNA小量抽提試劑盒操作說明，以電鉆高速研磨改良細(xì)胞破碎步驟，提取2P-4基因組DNA，保存于-20℃冰箱。細(xì)菌16S rRNA通用PCR引物[15]：27F(5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C AG-3′)，1492R(5′-G G T T A C C T T G T T A C G A C TT-3′)；細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶基因通用PCR引物[15]：gyrB-F(5′-G T G G C C G A T T C C G G C A A C C C C A A CG-3′)，gyrB-R(5′-T C A G A T G T C G A G G A A G C G G A C G T CC-3′)，由杭州華大基因公司合成。以2P-4基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rRNA、gyrB基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Master Mix(Dye) 25 μL，正反向引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，凝膠成像觀察條帶。PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。在GeneBank上用BLAST比對基因序列相似度，下載相似度大于98%的模式菌株16S rRNA基因序列，及相似度大于85%的模式菌株gyrB基因序列，用MEGA X軟件分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]。

1.2.6 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定 形態(tài)和生理生化鑒定委托中國工業(yè)微生物菌種保藏中心完成。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[17]的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性鑒定，用微生物生化鑒定試劑盒進(jìn)行氧化酶、明膠液化、過氧化氫酶、類黑色素、硫化氫和硝酸鹽還原試驗(yàn)。采用Biolog微生物自動分析系統(tǒng)按細(xì)菌鑒定操作規(guī)程，用微平板培養(yǎng)法進(jìn)行碳源自動分析鑒定[18]。

1.2.7 耐受試驗(yàn) 鹽濃度、pH耐受試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度為30℃，溫度耐受試驗(yàn)如表3設(shè)置培養(yǎng)溫度，按1.2.3的方法接種，160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)4 d，每天觀察、記錄生長情況，每組耐受試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)處理。

1.2.8 細(xì)胞化學(xué)組成鑒定 取菌種斜面，接種液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃ 160 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d， 3 000 r·min-1離心，收集菌體，送中國工業(yè)微生物菌種保藏中心鑒定糖組分、細(xì)胞壁氨基酸組分、極性脂質(zhì)、甲基萘醌及細(xì)胞膜脂肪酸組成。參考Hasegawa等[19]的方法用薄層層析(thin layer chromatography,TLC)法分析氨基酸、糖組分組成；參考魏安琪等[20]的方法提取細(xì)胞總脂肪酸，用MIDI Sherlock微生物自動鑒定系統(tǒng)聯(lián)合氣相色譜(gas chromatography,GC)法鑒定脂肪酸組成，進(jìn)行全細(xì)胞脂肪酸譜分析和微生物種屬鑒定；參考Minnikin等[21]的方法提取醌類和極性脂質(zhì)，用高效液相色譜(high-performance liquid chromatography,HPLC)法鑒定甲基萘醌[22]，用雙向TLC法鑒定極性脂質(zhì)組成[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性篩選結(jié)果

本研究從7份海泥樣品中共分離到25個菌株，其中AM培養(yǎng)基篩選到10個菌株，PM培養(yǎng)基篩選到15個菌株，TM培養(yǎng)基未篩選到菌株，僅發(fā)現(xiàn)1株菌對真菌表現(xiàn)抗性(圖1)，該菌編號為2P-4，表明其來自2號海泥樣品，由PM培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)得到的4號分離物。發(fā)酵液抗白色念珠菌的抑菌圈直徑為19.35±0.73 mm，抗黑曲霉的抑菌直徑為17.83±0.24 mm，表明發(fā)酵液中含有生物活性物質(zhì)，對白色念珠菌的生長及黑曲霉孢子的萌發(fā)具有抑制作用。

注：a：白色念珠菌平板；b：黑曲霉平板。Note: a：Plate for Candida albicans. b: Plate for Aspergillus niger.圖1 發(fā)酵液抗真菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of anti-fungal experiments offermentation broths

2.2 菌株的分子鑒定

由圖2可知，試驗(yàn)所用PCR引物特異性擴(kuò)增gyrB、16S rRNA基因序列，PCR產(chǎn)物gyrB大小約為1 000 bp、 16S大小約為1 500 bp，與預(yù)期的gyrB、16S rRNA基因長度相符。

對PCR產(chǎn)物測序，將基因序列提交到GeneBank，16S rRNA基因登錄號：MF785112，gyrB基因登錄號：ON184034，用BLAST功能分別比對16S rRNA、gyrB基因序列與模式鏈霉菌的相似度。結(jié)果表明，2P-4的16S rRNA基因序列與毒三鏈霉菌模式菌株StreptomycestoxytriciniNBRC 13194T和渾圓鏈霉菌模式菌株Streptomycesglobosus LMG 19896T的相似度最高，均為99.56%；gyrB基因序列與StreptomycestoxytriciniNRRL B-5426T相似度最高，為99.04%。下載相似度大于98%的16S rRNA基因序列和相似度大于85%的gyrB基因序列，用MEGA X軟件[24]分別進(jìn)行序列比對、優(yōu)化，用鄰位連接法進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、4)，發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示自展值(bootstrap value)大于50%的數(shù)值，上標(biāo)“T”表示為模式菌株。圖3顯示，2P-4的16S rRNA基因在進(jìn)化樹上形成獨(dú)立分枝，自展值為70%，與模式菌株StreptomycestoxytriciniNBRC 12823T和StreptomycesglobosusLMC 19896T的進(jìn)化距離相等。圖4顯示，2P-4的gyrB基因與模式菌株StreptomycestoxytriciniNRRL B-5426T在節(jié)點(diǎn)處兩者分開，2P-4形成獨(dú)立分枝，自展值為100%。16S rRNA基因在進(jìn)化上具有保守性，可作為微生物種水平鑒定的依據(jù)之一[25]，gyrB基因編碼DNA促旋酶β亞基，該基因?yàn)榧?xì)菌的保守單拷貝基因，對于菌種水平鑒別細(xì)菌是快速而有效的方法，2P-4的16S rRNA和gyrB基因進(jìn)化樹都顯示形成獨(dú)立分枝，表明2P-4與已知鏈霉菌的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)[26]，可能是鏈霉菌屬的一個新種。

注：M：DNA maker; B：空白對照；gyrB：PCR擴(kuò)增gyrB基因產(chǎn)物；16S：PCR擴(kuò)增16S rRNA基因產(chǎn)物。Note: M：DNA marker. B：Blank control. gyrB：PCR products for gene gyrB. 16S：PCR products for gene 16S rRNA.圖2 16S rRNA、gyrB基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis photographer of PCR product from 16S rRNA and gyrB

2.3 形態(tài)特征

2P-4分別接種在鏈霉菌分類標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基ISP2-ISP6上，28℃條件下培養(yǎng)10 d，菌落培養(yǎng)特征列于表1。2P-4在ISP2、ISP3、ISP4培養(yǎng)基上產(chǎn)生絨粉狀氣生菌絲，在ISP5、ISP6培養(yǎng)基上不產(chǎn)生氣生菌絲；2P-4在

圖3 2P-4 16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

圖4 2P-4 gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence

表1 2P-4在ISP培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 1 Culture characteristics of 2P-4 on ISP media

ISP2-ISP6培養(yǎng)基上形成的基內(nèi)菌絲顏色可呈淺橙色、淺黃色、灰黃色及米色，均不產(chǎn)生可溶性色素。

將2P-4孢子接種在ISP4培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)4 d，用顯微鏡觀察菌絲體。圖5-a顯示孢子絲呈螺旋狀，圖5-b顯示孢子呈柱狀，表面帶疣狀裝飾。

2.4 生理生化特征

表2中共有22種碳源，2P-4只能利用其中6種：D-葡萄糖、D-海藻糖、D-麥芽糖、D-蔗糖、N-乙酰-葡萄糖苷和甘油。2P-4能水解淀粉、纖維素、海藻酸和酪蛋白，不能使明膠液化，可分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，不產(chǎn)生類黑色素，不還原硝酸鹽，細(xì)胞表面不含細(xì)胞色素氧化酶。

注：a:光學(xué)顯微照片；b：掃描電鏡照片。Note: a: The optical microscope photograph. b: The scanning electron micrograph.圖5 2P-4孢子絲、孢子形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of spore chains and spores of 2P-4

表2 2P-4生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 2P-4

2.5 溫度、酸堿度、NaCl濃度耐受性

由表3可知，培養(yǎng)液起始pH值為7.4、溫度為28℃條件最適合2P-4生長；當(dāng)NaCl濃度在1%～4%范圍內(nèi)，2P-4的生長比較旺盛，當(dāng)NaCl濃度為5%時2P-4表現(xiàn)為生長微弱，當(dāng)NaCl濃度為6%時2P-4不生長；2P-4在培養(yǎng)基pH值小于5.0或大于9.0條件下不生長。耐受性試驗(yàn)結(jié)果說明，2P-4對較高濃度的酸、堿及鹽的耐受性差。

表3 2P-4對溫度、酸堿度、氯化鈉濃度的耐受特性Table 3 Tolerance characteristics of 2P-4 to temperature,pH value and sodium chloride concentration

2.6 細(xì)胞化學(xué)組成

細(xì)胞化學(xué)組成鑒定結(jié)果表明，2P-4的全細(xì)胞水解物含有核糖和LL-二氨基庚二酸(LL-diaminopimelic acid,LL-DPA)，細(xì)胞膜極性脂質(zhì)含有磷脂酰乙醇胺、心磷脂及7種不確定的極性脂質(zhì)(包括磷脂、氨基磷脂和脂質(zhì))。2P-4細(xì)胞膜甲基萘醌(methyl naphthoquinone,MK)的主要形式是MK-9(H6)，占總量的71.37%，其次是MK-9(H8)和MK-9(H4)，各占總量的13.92%、10.69%，還含有4.03%的MK-9。2P-4全細(xì)胞脂肪酸鑒定結(jié)果如表4所示，占全細(xì)胞脂肪酸總量大于2%的飽和脂肪酸，分別是16∶0、14∶0 iso、15∶0 iso、16∶0 iso、17∶0 iso 、15∶0 anteiso和17∶0 anteiso，不飽和脂肪酸分別是 16∶1 cis 9和17∶1 anteiso C；占全細(xì)胞脂肪酸總量小于2%的脂肪酸是14∶0、 17∶0、18∶0、11∶0 anteiso、17∶1 cis 9、18∶1 cis 9和16∶1 iso H；2P-4還含有少量的羥基脂肪酸、17∶0 cyclo及可能含有16∶0 9 methyl。

表4 2P-4全細(xì)胞脂肪酸組成Table 4 Whole cell fatty acids composition of 2P-4

3 討論

本研究用篩選放線菌的方法，自海泥樣品中篩選獲得了抗真菌菌株2P-4。對該菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，表明其在實(shí)驗(yàn)室條件下可正常生長，并產(chǎn)生大量孢子，其發(fā)酵液對白色念珠菌和黑曲霉具有抑制生長的作用。鏈霉菌屬的分類特征主要是細(xì)胞壁含有LL-DAP或甘氨酸，全細(xì)胞水解物中無特征性糖，或含有不易檢測出的半乳糖[17]，細(xì)胞膜含有磷脂酰乙醇胺和甲基萘醌MK-9(H6)、MK-9(H8)、MK-9(H4)[27]，細(xì)胞膜總脂肪酸中主要含有大量直鏈飽和脂肪酸和末端分支飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸含量低于5%[28]。2P-4的全細(xì)胞化學(xué)組成的鑒定結(jié)果表明，該菌不含特征性糖，而含有核糖、LL-DPA，符合鏈霉菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，其極性脂質(zhì)、甲基萘醌及脂肪酸的主要組分與鏈霉菌極為相似，并且2P-4的16S rRNA、gyrB基因序列與毒三鏈霉菌模式菌株的進(jìn)化關(guān)系最為密切，因此可以確定2P-4為鏈霉菌屬成員。《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[17]描述毒三鏈霉菌的特征是具有抗細(xì)菌、抗真菌活性，孢子鏈為典型的初旋，孢子顏色屬于紅色系，表面光滑，不能利用蔗糖，產(chǎn)類黑色素。2P-4具有與毒三鏈霉菌不同的特征，2P-4的孢子鏈呈螺旋型、孢子壁帶疣、可利用蔗糖，不產(chǎn)類黑色素。Tang等[29]鑒定發(fā)現(xiàn)，StreptomycestoxytriciniNBRC 13194T能利用L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖、纖維二糖、麥芽糖和蔗糖，與上述結(jié)果相比，2P-4不能利用纖維二糖和鼠李糖，說明2P-4在碳源利用和能量代謝上與其近緣種StreptomycestoxytriciniNBRC 13194T的差別較大，并且2P-4的16S rRNA和gyrB基因在系統(tǒng)發(fā)育樹上均形成獨(dú)立分枝，從而支持2P-4與毒三鏈霉菌分屬于不同的種。因此，結(jié)合形態(tài)、生理生化、細(xì)胞化學(xué)組成和分子進(jìn)化鑒定結(jié)果，初步鑒定2P-4為鏈霉菌屬的一個新種。

本研究用苯丙氨酸培養(yǎng)基(PM)篩選培養(yǎng)得到2P-4，生理生化特征顯示該菌株具有海藻酸裂解酶活性。通過對2P-4的16S rRNA、gyrB基因序列的BLAST比對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在16S rRNA基因序列相似度大于97%，及gyrB基因序列相似度大于85%的模式鏈霉菌株中不含有致病鏈霉菌。表明菌株2P-4易培養(yǎng)，且具有較高的生物安全性。

海藻酸是構(gòu)成褐藻細(xì)胞壁的主要多糖，其降解產(chǎn)生的寡糖能促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)抗病性及抗逆性等作用[30]。海藻酶裂解酶廣泛用于海藻酸寡糖的生產(chǎn)，在已發(fā)現(xiàn)并表征的海藻酸裂解酶中，大部分來自海洋細(xì)菌，如弧菌、假單胞菌、芽孢桿菌等[31]，而來源于海洋鏈霉菌的相關(guān)酶學(xué)研究鮮有報道。2P-4具有海藻酸裂酶活性，其酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、底物特異性及酶催化產(chǎn)物可能具有獨(dú)特性，值得深入探究。利用鏈霉菌活體制劑防治植物真菌病害在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，如防治稻瘟病菌、鐮刀菌等[32]。2P-4具有抗真菌活性，海藻酸裂解酶活性及良好的生物安全性，其活體和代謝產(chǎn)物有望應(yīng)用于抗真菌生防制劑的研制，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

在陸地鏈霉菌資源枯竭的背景下，海洋鏈霉菌因獨(dú)特的生物合成能力而備受關(guān)注[33]。為了保護(hù)我國微生物資源，將鏈霉菌2P-4送中國普通微生物中心專利保藏，登記入冊編號：CGMCC No.17860。

4 結(jié)論

本研究從寧波慈溪海塘海泥樣品中分離得到1株具有抗真菌活性的可培養(yǎng)放線菌2P-4，該菌的生長對海水具有依賴性，并且具有降解海藻酸的活性，表明該菌確為一株海洋放線菌。對2P-4進(jìn)行分子進(jìn)化、形態(tài)、生理生化和細(xì)胞化學(xué)組成分析，初步鑒定2P-4為鏈霉菌屬的一個新種。本研究發(fā)現(xiàn)的海洋鏈霉菌2P-4具有抗真菌活性，其代謝產(chǎn)物可能成為新型抗真菌藥物的來源。2P-4的抗真菌活性代謝產(chǎn)物及其生物合成機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。