阮朝列，陳洪波，張澤珩，雍國勝，劉伯川，趙紅玲，陳 瑜，劉雙芹，廖國陽，李衛(wèi)東，周 健

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所，云南 昆明 650118)

基于細胞培養(yǎng)的生命科學與生物制品行業(yè)在當今已經(jīng)得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用[1].通過大量的細胞培養(yǎng)，可以有針對性、大規(guī)模、快速地生產(chǎn)各類生物制品[2].細胞傳代是細胞培養(yǎng)中必不可缺的環(huán)節(jié)，對于貼壁細胞而言，根據(jù)每種細胞的類型和其生長特點以及實驗?zāi)康?，當細胞密度達到傳代要求時就要進行傳代操作.細胞傳代一般使用胰蛋白酶消化細胞使得細胞間的粘附蛋白（如膠原蛋白、鈣粘蛋白、纖連蛋白、整連蛋白等）降解，從而使細胞分開.胰蛋白酶一般分離于動物的胰腺組織，目前最常用的胰蛋白酶大多來源于豬胰腺.一方面，不同來源的胰蛋白酶對于不同的細胞作用效果是不一樣的，且胰蛋白酶的活性與其種類、濃度、作用時間、溫度等都有關(guān).Vero 細胞（非洲綠猴腎細胞）和KMB-17 細胞（人二倍體細胞）作為生物制品行業(yè)長期以來的“明星”細胞，特別對于疫苗行業(yè)來說，它們用于狂犬疫苗、新冠疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腸道病毒疫苗等疫苗的生產(chǎn)[3].因此，研究胰蛋白酶對Vero 細胞和KMB-17 細胞的消化效果很有必要.另一方面，出于對伊斯蘭國家及人群信仰的尊重，生產(chǎn)出滿足Halal（清真）驗證的疫苗是生物制品中不可忽視的一個環(huán)節(jié)，這就使得傳統(tǒng)來源于豬的胰蛋白酶將不得使用[4-5].來源于牛胰腺組織的胰蛋白酶和非動物源的合成消化酶TrypLE 在市場上也得到了充分的應(yīng)用[6]，這就為我們尋求豬源胰蛋白酶的替代品提供了可能.

本研究比較了市面上常用的4 種消化酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞的效果.選擇1 種傳統(tǒng)的來源于豬的胰蛋白酶、2 種來源于牛的胰蛋白酶和合成的消化酶TrypLE，試圖探尋培養(yǎng)細胞的最佳消化工藝和Halal（清真）驗證中關(guān)于豬源胰蛋白酶的替代問題，以期為以細胞傳代培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物制品行業(yè)的發(fā)展提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 細胞Vero 細胞購自歐洲動物細胞收藏中心（ECACC，編號03129010），傳至141 代制成工作種子庫，由本實驗室保存.KMB-17 細胞（人胚肺二倍體細胞），中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所具有自主知識產(chǎn)權(quán)，工作代數(shù)30 代.

1.2 主要試劑及儀器MEM 培養(yǎng)基（KMB-17 細胞用）、DMEM 培養(yǎng)基（Vero 細胞用）、0.01 mol/L PBS 溶液和豬源胰酶（配制后活力為1 451.25 U/mL）由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供.新生牛血清購于蘭州民海生物工程有限公司.牛源胰酶-1干粉（貨號T9935，批號SLBZ0316，活力13 164 U/mg）、牛源胰酶-2 干粉（貨號T9935，批號SLBR5744V，活力4 508 U/mg）購于SIGMA 公司.兩種牛源胰酶溶解后，牛源胰酶-1 活力為1 462.67 U/mL，牛源胰酶-2 活力為1 502 U/mL，3 種動物源胰酶溶液均添加EDTA-Na2至終質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL，pH 均為7.6.全合成胰蛋白酶TrypLE 試劑（貨號12605010）購于Thermo Fisher Scientific 公司；Countstar 自動細胞計數(shù)儀購自上海睿玨生物科技有限公司.CCK-8 試劑盒購自碧云天公司，用于檢測細胞增殖和毒性.96 孔板；6 孔板；T25 細胞培養(yǎng)瓶；酶標儀；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱.

1.3 細胞培養(yǎng)及消化細胞復(fù)蘇后傳代至12 個T25 細胞培養(yǎng)瓶中，細胞生長成致密單層后，隨機每3 瓶（n=3）為一個實驗組，共4 組.每組用0.01 mol/L 的PBS 洗去殘留培養(yǎng)基后分別加入5 mL 的豬源胰酶、牛源胰酶-1、牛源胰酶-2 和全合成胰蛋白酶TrypLE 浸潤30 s 后棄去，置37 ℃溫箱繼續(xù)消化，直至顯微鏡下觀察到細胞變圓脫落并出現(xiàn)細胞斷裂現(xiàn)象時，加入5 mL 細胞培養(yǎng)液終止消化，統(tǒng)計消化時間.反復(fù)吹吸使細胞分散，混勻后吸取稀釋后的細胞懸液用Countstar 自動細胞計數(shù)儀檢測細胞密度及細胞活率.

1.4 細胞增殖和毒性檢測與生長動態(tài)分別將每組消化下來的細胞稀釋至2×105mL?1，接種至96孔板和6 孔板繼續(xù)培養(yǎng).96 孔板每孔接種100 μL細胞懸液，共接種5 塊板，每塊板含4 種不同酶消化的細胞，每種酶消化的細胞共8 個孔（n=8），培養(yǎng)至12、24、48、72、96 h 后取出加入CCK-8 試劑孵育1 h，然后用酶標儀測定吸光度（450 nm）用于評價細胞增殖和毒性.6 孔板每孔接種2.5 mL 細胞懸液，共接種10 塊板，每種酶消化的細胞各3 個孔（n=3），培養(yǎng)至24、48、96、120、144 h 后取出用0.125%豬源胰酶消化細胞檢測細胞密度和活率.

1.5 重復(fù)性驗證采用篩選出的最優(yōu)消化條件對T25 瓶培養(yǎng)的細胞進行消化傳代，傳代培養(yǎng)96 h 后統(tǒng)一用豬源胰酶消化細胞后檢測活細胞密度，實驗進行10 次(n=10)，計算10 次實驗活細胞密度的變異系數(shù)CV（coefficient of variation，%），用于評價消化酶在多次實驗中的重復(fù)性和穩(wěn)定性，CV=（標準偏差/平均值）×100%.

1.6 統(tǒng)計學分析應(yīng)用Prism 8 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，不同胰蛋白酶組間采用t檢驗和單因素方差分析（F檢驗），以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05 標*，P<0.01 標**，P<0.001 標***，P<0.000 1 標****）.

2 結(jié)果

2.1 消化酶種類和細胞類型對消化效果的影響細胞的消化差異以細胞活率為主要評價指標.組間t檢驗結(jié)果顯示，消化酶的種類對消化作用存在影響.在Vero 細胞消化實驗中，豬源胰酶與牛源胰酶-1、牛源胰酶-2、TrypLE 的消化能力存在顯著差異；牛源胰酶-1 與牛源胰酶-2 消化能力無顯著差異；牛源胰酶-1 與TrypLE 消化能力有顯著差異，牛源胰酶-2 與TrypLE 消化能力有顯著差異（圖1（a））.TrypLE 消化Vero 細胞活率為88.85%(表1).在KMB-17 細胞消化實驗中，消化酶的種類對KMB-17 細胞消化能力均無顯著差異（圖1（b）），消化后平均細胞活率均大于98%(表1).值得注意的是，4種胰蛋白酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞的平均消化時間存在顯著差異（圖1（c）、（d）），但消化時間與細胞活率之間并不直接相關(guān)，說明相同的活力單位下不同來源的消化酶對不同的細胞的消化能力和對細胞的作用機制是不一樣的.

表1 不同種類消化酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞效果(n=3)Tab.1 Effect of different digestive enzymes on Vero cells and KMB-17 cells (n=3)

圖1 不同種類消化酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞效果對比Fig.1 Comparison of digestion effects of different digestive enzymes on Vero cells and KMB-17 cells

2.2 胰蛋白酶的種類對細胞增殖活力的影響細胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后接種至96 孔板中，采用相同條件培養(yǎng)至不同時間后用CCK-8 試劑檢測細胞增殖和毒性.單因素方差分析（F檢驗）結(jié)果表明胰蛋白酶的種類對于細胞增殖和毒性有影響.Vero 細胞在4 種胰蛋白酶消化后培養(yǎng)12 h 表現(xiàn)出明顯的細胞增殖和毒性差異（圖2（a））.隨著時間的延長差異越明顯，其中牛源胰酶-2 在24 h 后即表現(xiàn)出與其他3 種胰酶明顯的差異，說明牛源胰酶-2 對于Vero 細胞的增殖和毒性影響最大；豬源胰酶和牛源胰酶-1 在各階段未表現(xiàn)出顯著差異.全合成胰酶TrypLE 雖然在消化Vero 細胞后細胞活率小于90%（88.4%），但其對Vero 細胞的增殖和毒性影響卻最小.說明牛源胰酶-1 和TrypLE 均可作為候選胰酶用于Vero 細胞的消化.KMB-17 細胞在24 h 內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的細胞增殖活力差異（圖3）.48 h 之后牛源胰酶-2 相對于其他3 種胰酶來說對細胞增殖和毒性的影響最小，說明牛源胰酶-2 消化的KMB-17 細胞的效果好.

2.3 不同胰蛋白酶消化傳代后細胞生長動態(tài)細胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后傳代至6 孔板中按相同的條件進行培養(yǎng)，并繪制生長曲線.從Vero 細胞生長曲線（圖4）可見，相較于TrypTE，使用豬源胰酶、牛源胰酶-1 和牛源胰酶-2 消化Vero 細胞在一定程度上延長了細胞生長的潛伏期，這與細胞增殖和毒性檢測結(jié)果一致（圖2）.與Vero 不同的是，KMB-17 細胞經(jīng)牛源胰酶-1 和TrypTE 消化后細胞潛伏期長達72 h（圖5），這與細胞增殖活力檢測結(jié)果一致（圖3）.細胞培養(yǎng)至144 h 后，經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化后的Vero 細胞密度相對牛源胰酶-2 高，但無統(tǒng)計學差異（圖6（a））.豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化后的KMB-17 細胞活細胞密度最高，無統(tǒng)計學差異；與豬源胰酶和牛源胰酶-2 相比較TrypLE 消化KMB-17 細胞活細胞密度最低，其次是牛源胰酶-2（圖6（b）），有統(tǒng)計學差異.

圖2 不同種類消化酶消化Vero 細胞各階段增殖活力對比（n=8）Fig.2 Comparison of the proliferation activity of Vero cells in different stages of digestion with different digestive enzymes (n=8)

圖3 不同種類消化酶消化KMB-17 細胞各階段增殖活力對比（n=8）Fig.3 Comparison of the proliferation activity of KMB-17 cells in different stages of digestion with different digestive enzymes (n=8)

圖4 不同胰蛋白酶消化傳代后Vero 細胞生長動態(tài)（n=3）Fig.4 Growth dynamics of Vero cells after different trypsin digestion and passage（n=3）

圖5 不同胰蛋白酶消化傳代后KMB-17 細胞生長動態(tài)（n=3）Fig.5 Growth dynamics of KMB-17 cells after different trypsin digestion and passage（n=3）

圖6 不同胰蛋白酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞傳代后144 h 活細胞密度對比Fig.6 Comparison of live cell density at 144 h after passage of Vero cells and KMB-17 cells digested by different trypsin

此外，如圖7 和8 所示，細胞經(jīng)不同的胰蛋白酶消化后不同時間進行顯微鏡拍照記錄，肉眼沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞形態(tài)差異.

圖7 Vero 細胞消化后不同時間點細胞形態(tài)Fig.7 The morphology of Vero cells at different time points after digestion

2.4 重復(fù)性驗證綜上，對于Vero 細胞的消化可選擇牛源胰酶-1、TrypLE；KMB-17 細胞可選擇牛源胰酶-2 作為豬源胰酶的替代.10 次重復(fù)實驗顯示，Vero 細胞經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細胞密度的CV 分別為1.08%、1.12%、1.22%（表2），表明使用豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化Vero 細胞重復(fù)性好.KMB-17 細胞經(jīng)豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細胞密度的CV 分別為1.15%、1.04%（表2），表明使用豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化KMB-17 細胞重復(fù)性較好.

表2 消化傳代Vero 細胞和KMB-17 細胞細胞密度重復(fù)性驗證Tab.2 Validation of cell density repeatability of digestive passage Vero cells and KMB-17 cells

3 討論

本研究比較了在相同活力單位下豬源胰酶、牛源胰酶-1、牛源胰酶-2 和TrypLE 消化Vero 細胞和KMB-17 細胞的差異.通過消化后傳代培養(yǎng)，利用CCK-8 試劑檢測細胞在不同階段的增殖和毒性，并且利用Countstar 自動細胞熒光計數(shù)儀進行細胞數(shù)量和活率的檢測，保證了數(shù)據(jù)的可靠性.

結(jié)果顯示，在幾乎相同的胰酶活力下（豬源胰酶活力為1 451.25 U/mL、牛源胰酶-1 活力為1 462.67 U/mL，牛源胰酶-2 活力為1 502 U/mL），4 種消化酶對Vero 細胞消化效果有顯著差異，對KMB-17細胞無顯著差異.Vero 細胞消化實驗中，豬源胰酶對其他3 種消化酶的消化能力有顯著差異.另外，4 種消化酶消化Vero 細胞和KMB-17 細胞的平均消化時間均存在顯著差異，但消化時間與細胞活率之間并不直接相關(guān),與不同胰酶作用位點的差異有關(guān).經(jīng)TrypLE 消化后的Vero 細胞活率較低,有研究顯示，殘留的TrypLE 損害了細胞附著與生長[7].同樣地，Umegaki 等[8]研究了胰蛋白酶對人類角蛋白細胞生長的影響表明TrypLE 會誘導細胞密度下降，但不影響細胞活性，這與我們的結(jié)果一致.

其次，消化酶的種類對Vero 細胞和KMB-17細胞的增殖活力和細胞毒性是有影響的，且不同時間對不同細胞影響不同.4 種胰蛋白酶在消化后12 h對Vero 細胞表現(xiàn)出明顯的細胞增殖和毒性差異，這種差異隨著時間的延長越明顯，說明胰蛋白酶會損害細胞的生長，與Rourou 等[7]研究結(jié)果一致.有意思的是，全合成胰酶TrypLE 雖然在消化Vero 細胞后細胞活率小于90%（88.4%），從10 次重復(fù)實驗來看TrypLE 的確會降低細胞密度，但對Vero 細胞的增殖和毒性影響最小，與Umegaki 等[8]的研究結(jié)果一致.總的來說，牛源胰酶-2 對于Vero 細胞的增殖和毒性影響最大，TrypLE 影響最小.對于KMB-17細胞來說，4 種胰酶消化后24 h 內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的細胞增殖和毒性差異，48 h 之后就表現(xiàn)出了明顯的差異，其中牛源胰酶-2 在48 h 之后相對于其他3 種胰酶來說對細胞增殖和毒性的影響最小.另外，不同胰蛋白酶消化傳代后細胞生長動態(tài)結(jié)果也與增殖和毒性的結(jié)果相吻合.值得注意的是，使用不同胰酶消化細胞對細胞的影響表現(xiàn)為對細胞潛伏期的延長，推測是消化酶損傷了細胞表面的蛋白或其他，因此細胞需要更長的潛伏期來修復(fù)和進行復(fù)制物質(zhì)的準備.

最后，經(jīng)過10 次的重復(fù)實驗，我們確定Vero細胞經(jīng)豬源胰酶、牛源胰酶-1 和TrypLE 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細胞密度的CV 分別為1.08%、1.12%、1.22%，重復(fù)性好；KMB-17 細胞經(jīng)豬源胰酶和牛源胰酶-2 消化培養(yǎng)96 h 后所獲活細胞密度的CV 分別為1.12%、1.14%，重復(fù)性好.為尊重全球伊斯蘭國家及人群的信仰，藥物的Halal（清真）狀態(tài)可確保該產(chǎn)品不含豬肉或其他禁止的成分[9].與此類似的還有猶太教，也禁止食用豬肉和其他衍生物[10-11].因此，在以常規(guī)豬源胰蛋白酶消化細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物制品行業(yè)中，來源于豬的胰蛋白酶將不得使用[4-5].一方面，全球1/4 且不斷增長的穆斯林人群對生物制品尤其是疫苗的需求量是極其巨大[5].另一方面，在生物制品行業(yè)潛在的利潤豐厚的驅(qū)動下，許多制藥公司和國家都試圖提出清真疫苗和建立清真藥品標準，例如諾華公司和馬來西亞等.我們的結(jié)果表明，Halal（清真）驗證中可使用牛源胰酶-1 和TrypLE 替代豬源胰酶消化Vero 細胞，消化KMB-17 可使用牛源胰酶-2 替代豬源胰酶.

圖8 KMB-17 細胞消化后不同時間點細胞形態(tài)Fig.8 The morphology of KMB-17 cells at different time points after digestion